CN104975053B - 一种提高真菌产巴卡亭iii产率的氧化环境发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其包括在液体培养基中发酵培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no.79，当真菌在培养基中培养2天(48小时)后，第一次加入30ml的双氧水，然后每隔3天分别加入60ml的双氧水，直至第21天发酵结束，通过该氧化培养环境，以使在所述菌株处于氧化胁迫环境中，同时为真菌生长提供叫足够的氧气，最终提高所培养内生真菌的巴卡廷III产生量。本发明相比较传统发酵培养方法，显著的提高了菌株no.79的产率，方法简单且经济，适宜于工业化生产，巴卡廷III产率可提高1.8倍。
Description
技术领域
本发明属于真菌培育技术领域，具体涉及一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法。
背景技术
紫杉醇被广泛用于癌症的化疗，尤其是对乳腺癌、子宫癌和卵巢癌等女性高发癌症具有良好的效果，但是其人工合成工艺复杂，所以依然不能依靠人工合成生产。目前，医用紫杉醇提取自红豆杉，然而紫杉醇在红豆杉中含量极低，同时红豆杉生长极其缓慢，但紫杉醇前体物巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III含量较高，因此，通过巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III人工半合成获得紫杉醇是当今该药的主要途径。尽管红豆杉中巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III含量较之紫杉醇高，但依然不能满足市场需求，导致紫杉醇价格依然昂贵，不能充分满足市场需求。因此，如何快速生产巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III成为影响紫杉醇市场价格的主要因素。
近年来，分离自红豆杉的一些内生菌被发现能够产生巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III，这为通过发酵手段生产紫杉醇前提物提供了现实基础，但是，相比较红豆杉中巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III的含量，内生菌发酵的产生较低，因此，如何通过适当的手段来提高其发酵产量成为这些内生菌能否应用到生产的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，解决了现有技术中存在的发酵法产巴卡廷III产率较低的问题。
本发明所采用的技术方案是，一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，包括以下步骤：在液体培养基中培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌，Diaporthephaseolorum的菌株no.79，当真菌在培养基中培养一段时间后，第一次加入双氧水，然后每隔3天添加一次双氧水，直至发酵结束，得到真菌培养液，并对真菌培养液进行回收和提纯。
本发明的特点还在于，
培养基为PDB培养基，其组成为:水1000ml、马铃薯600g、蔗糖280g、pH 6.5-7.0。
培养一段时间的具体时间长度是2天。
第一次加入双氧水的量为每1000ml培养基中加入30ml双氧水。
每隔三天加入双氧水的量为每1000ml培养基中加入60ml双氧水。
回收并提纯巴卡廷III的步骤包括：
1)真菌培养液用滤纸过滤备用，菌丝体残渣加入石英砂被充分研磨，研磨的后的残渣在45℃条件下被充分干燥，然后称重备用；
2)将干燥称重后的菌丝体粉末放入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，充分混匀为悬浊液，然后在超声波震荡30分钟，过滤，将滤渣采用上述方法提取；
3)合并两次所得滤液并在40℃条件下低压旋转蒸发，然后将所的到的膏状蒸发残留物溶解在30ml氯仿中，然后用30ml的水再次抽提；
4)收集有机相，并在旋转蒸发器中40℃旋转蒸发，所得干燥残留物被溶解在5ml的甲醇中，并用0.45lm孔过滤器过滤备用；
5)过滤后的真菌培养液在70℃条件下低真空旋转蒸发；
6)当液体剩余10ml左右时，加入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，然后使用和菌丝体相同的方法进行巴卡廷III的分离。
本发明的有益效果是：本发明通过添加一定量的过氧化氢来培养一株产巴卡廷III的红豆杉内生菌，使其巴卡廷III的产量显著提高，达到原来对照产量的1.8倍。
本发明在对产巴卡廷III内生菌培养过程中，通过添加一定量的过氧化氢溶液，从而明显地提高了巴卡廷的产率，方法简便，容易操作。本发明添加过氧化氢创造了内生菌培养的氧化环境，从而促进了其次生代谢产物巴卡廷III的增加，所添加试剂在提取过程中会自动分解，不存在在有毒残留，成本低。
附图说明
图1是本发明显示的是红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no.79的菌落形态和分生孢子形态。
其中，A)是生长15天后菌落的形态；B)是分生孢子聚集的情形；C)是分生孢子单个的形态。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，包括以下步骤：在液体培养基中培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌，当真菌在培养基中培养一段时间后，第一次加入双氧水，然后每隔3天分别加入双氧水，直至发酵结束，通过加过氧化氢所产生的培养环境，提高所培养内生真菌的巴卡廷III产生量。
其中，培养基为PDB培养基，其组成为gL:马铃薯600--2400，蔗糖260，pH5.0-7.0。红豆杉内生菌是产巴卡廷III的红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no.79(已公开发表，参考文献Jian et al.(2013)Isolation ofan endophytic fungus producingbaccatin III from Taxus wallichianavar.mairei.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.40:1297–1302)，红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no.79的菌落形态和分生孢子形态如图1所示。
培养一段时间的具体时间长度是2天(48小时)。第一次加入双氧水的量为30ml/L。以后每隔三天加入双氧水的量是60ml/L。
回收并提纯巴卡廷III的步骤包括：
1)真菌培养液用滤纸过滤备用，菌丝体残渣加入石英砂被充分研磨，研磨的后的残渣在45℃条件下被充分干燥，然后称重备用。
2)将干燥称重后的菌丝体粉末放入30ml的氯仿/甲醇(1:1,v/v)混合液，充分混匀为悬浊液，然后在超声波震荡30分钟，过滤，将滤渣再一次用同样方法再一次提取。
3)合并两次所得滤液并在40℃条件下低压旋转蒸发，然后将所的到的膏状蒸发残留物溶解在30ml氯仿中，然后用30ml的水再次抽提；
4)有机相被收集，并在旋转蒸发器中40℃旋转蒸发，所得干燥残留物被溶解在5ml的甲醇中，并用0.45lm孔过滤器过滤备用；
5)过滤后的真菌培养液在70℃条件下低真空旋转蒸发；
6)当液体剩余10ml左右时，加入30ml氯仿/甲醇(1:1,v/v)混合液，然后使用和菌丝体相同的方法进行巴卡廷III的分离；
7)将4)和6)中各自所获得的溶有提取物的5ml甲醇溶液混合为10ml，备用。
以99.5％的巴卡廷III作为标准品，用高效液相方法对上述提取自发酵液和菌丝体的提取物进行巴卡廷III含量的测定。
采用本方法培养巴卡廷III与常规培养方法相比，其产率结果如表1所示，其产率大大提高。
表1添加过氧化氢培养和对照巴卡廷III的产率比较(单位：mg/l)
本发明通过加入过氧化氢使红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no.79产巴卡廷III的产率显著增加，方法简便可行，投入低。巴卡廷III属于烷烯类化合物，典型的次生代谢产物，在高等植物组培和一些微生物培养过程中，当将这些生物细胞植物氧化环境时会导致这些生物细胞的次生代谢产物产量显著增加，因此该发明正是依据该原理通过添加过氧化氢使no.79的巴卡廷III产率显著增加。
本发明通过添加过氧化氢不仅投资低，而且环保。原因在于过氧化氢在巴卡廷III提取和纯化过程及其容易分解而变为水和氧气，不存在对提取产物的污染和对人体可能的危害。
Claims (1)
1.一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：在液体培养基中培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌，Diaporthe phaseolorum的菌株no.79，当真菌在培养基中培养一段时间后，第一次加入双氧水，然后每隔3天添加一次双氧水，直至发酵结束，得到真菌培养液，并对真菌培养液进行回收和提纯；
所述培养基为PDB培养基，其组成为:水1000ml、马铃薯600g、蔗糖280g、pH6.5-7.0；
所述培养一段时间的具体时间长度是2天；
所述第一次加入双氧水的量为每1000ml培养基中加入30ml双氧水；
所述每隔三天加入双氧水的量为每1000ml培养基中加入60ml双氧水；
所述的回收并提纯的步骤包括：
1)真菌培养液用滤纸过滤备用，菌丝体残渣加入石英砂被充分研磨，研磨的后的残渣在45℃条件下被充分干燥，然后称重备用；
2)将干燥称重后的菌丝体粉末放入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，充分混匀为悬浊液，然后在超声波震荡30分钟，过滤，将滤渣采用上述方法提取；
3)合并两次所得滤液并在40℃条件下低压旋转蒸发，然后将所的到的膏状蒸发残留物溶解在30ml氯仿中，然后用30ml的水再次抽提；
4)收集有机相，并在旋转蒸发器中40℃旋转蒸发，所得干燥残留物被溶解在5ml的甲醇中，并用0.45lm孔过滤器过滤备用；
5)过滤后的真菌培养液在70℃条件下低真空旋转蒸发；
6)当液体剩余10ml时，加入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，然后使用和菌丝体相同的方法进行巴卡廷III的分离。
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| 过氧化氢胁迫促进产朊假丝酵母合成谷胱甘肽;廖鲜艳等;《生物工程学报》;20080625;第24卷(第6期);1046-1050 * |
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