CN113481106A

CN113481106A - 一种深海来源蕈青霉及获得化合物

Info

Publication number: CN113481106A
Application number: CN202110843806.7A
Authority: CN
Inventors: 王颖; 金国虞; 陈超逸
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-07-26
Filing date: 2021-07-26
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2041-07-26
Also published as: CN113481106B

Abstract

本发明提供了一种深海来源蕈青霉及获得化合物，属于微生物技术领域。该菌株的分类命名为蕈青霉属（Penicillium paxilli），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2021685，保藏日期2021.6.7。以大米固体培养基对该菌株进行发酵，经甲醇浸提、乙酸乙酯萃取、大孔树脂柱层析、硅胶柱层析、制备型高效液相色谱的提取步骤获得新化合物B9‑1。

Description

一种深海来源蕈青霉及获得化合物

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种深海来源蕈青霉次级代谢产物中分离提取的新化合物B9-1。

背景技术

过去半个多世纪，陆生微生物一直是生物活性次级代谢产物(青霉素，环孢菌素A，阿霉素等)的主要来源。然后，近年来，越来越难以获得新的有价值的次级代谢产物。因此，人们把目光投向了海洋。地球生物的起源地是海洋。海洋占地球表面积的3/4，面积巨大，资源丰富，具有相当多的微生物和动植物。在资源日益枯竭的今天，如何向海洋寻找新的活性化合物成为了一个重要的课题。海洋具有黑暗、高盐度、压强大、低氧、低温或部分地区高温的条件，海洋微生物形成了一定的机制来适应这些条件。故海洋微生物与陆生微生物相比具有不同的生长和代谢机制，其次级代谢产物具有独特的生物学功能。因此有望在其中筛选到更多在结构和活性上都具有新颖性的次级代谢产物。

海洋青霉属真菌可以产生结构多样，生物活性丰富的次级代谢产物，据不完全统计，自1991年Kobayasht等报道第一个海洋青霉菌来源的天然产物fellutamide A到2014年，共报道了392个海洋青霉菌来源的新天然产物^[1]。这些海洋青霉属来源的天然化合物结构包括聚酮、生物碱、萜类、甾体、卤代物、脂肪酸、肽类、糖苷等多种类型，这些化合物在抗菌、抗肿瘤、自由基清除、抗寄生虫、抗癌、抗炎等方面具有优良表现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种深海来源的蕈青霉Penicillium paxillin次级代谢产物中分离提取B9-1的方法，采用优化培养基和培养条件的方式来促进蕈青霉次级代谢产物B9-1的合成，提高B9-1产量。

本发明为了实现以上目的采用的技术方案如下：

一株深海来源蕈青霉B9(Penicillium paxilli)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉武汉大学，保藏日期：2021.6.7，保藏号CCTCC M 2021685。

(1)形态鉴定：采用三点法将种子液以2ul/点接种在MEA平板上(20.0g麦芽糖提取物；1.0g蛋白胨；20.0g葡萄糖；0.005g CuSO4.5H2O；0.01g ZnSO4.7H2O；20.0g琼脂；海水晶33.0g；H2O 1L；调节PH至7.0-7.5)。待种子液被MEA培养基完全吸收之后，在恒温培养箱中28℃倒置培养5天。制备菌丝玻片：采用插片法，将1.0cm×1.0cm的盖玻片高压灭菌，以45°插入至接种点附近，恒温培养箱中28℃倒置培养5天。

所述菌株的形态特征是：在MEA培养基上28℃倒置培养5天之后，菌落直径是1.5cm。菌落表面呈致密丝绒状或者絮状，菌丝体颜色为绿色，中心区域轻微隆起，边缘区域颜色为白色，有色素生成，无渗出液，孢子产量较少，菌落反面呈棕褐色(见图1)。菌丝玻片经棉兰染色之后，用显微镜观察(放大倍数为40倍)，菌丝有隔菌丝，分生孢子呈现球形或近球形，直径或长轴2.2-3.2μm，壁平滑；分生孢子链较疏松，叉开或不规则纠缠。形态特征与青霉属真菌相近(见图2)。

(2)分子生物学鉴定：挑取MEA平板上的菌丝，使用南京擎科植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并以此为模板扩增管家基因5.8S rDNA和28S rDNA的基因间隔序列(Thenuclear ribosomal internal transcribed spacer region，ITS)。

ITS PCR扩增引物序列如下所示：

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

PCR条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，30个循环；72℃延伸10min。菌株B12经ITS1和ITS4引物扩增产物，由南京擎科生物科技有限公司完成测序，扩增产物长度为579bp，序列如下所示：

catcgagtgacggctctgggtccacctcccacccgtgtttaactgtaccttgttgcttcggcgggcccgcctcacggccgccggggggctctcccgcccccgggcccgcgcccgccgaagccacctgtgaacgctgtctgaagtatgcagtctgagacaactagctaaattagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataattaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccctctggtattccggagggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggccctcgtccccccggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggcttcgtcacccgctcgttaggcccggccggcgccagccgaccccccctcaatctttaaccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcataaagcgggaagaaaagtattaaaa

将测序结果通过NCBI网站的BLAST，序列比对结果中相似性最大的即为菌株的相似种属。该菌株经序列比对，经鉴定该真菌为真菌门(Eumycota)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢真菌纲(Hyphomycetes)、丝孢菌目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、青霉属(Penicillium)，最相似种属为Penicillium paxillin。

B9-1的制备方法

(1)孢子制备：

将保存在-80℃超低温冰箱的蕈青霉B9的甘油管接种在PDA平板上，置于28℃、黑暗培养3天。

(2)种子液制备：

在PDA平板上长出单菌落之后，用无菌接种环将孢子和菌丝刮至200ml PDB液体培养基中，200rpm，28℃，培养3-4天。

(3)菌株发酵

按照1ml种子液/10g培养基的比例将种子液接种到固体发酵培养基中，置于28℃、黑暗培养100天。

(4)次级代谢产物提取

按照10L/1kg的比例用甲醇浸泡固体发酵产物，超声浸提30分钟，减压抽滤得到浸提液。浸提三次。38℃减压旋蒸除去甲醇，即可获得发酵浸膏。

(5)分离纯化

发酵浸膏加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压旋蒸除去，得萃取物。将最终发酵萃取物用大孔树脂色谱进行洗脱，洗脱剂选择乙醇、水；所得组分2使用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择氯仿、甲醇；所得组分2-5使用制备型液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，体积比为18-82，得到新化合物B9-1。

B9-1

作为优选，在菌株发酵步骤中，选择的发酵培养基是大米固体培养基，配方：4000.0g大米，132g海水晶，1.2g MgSO4.7H2O，4000.0ml H2O，调节PH＝7.0-7.5。

作为优选，在菌株发酵步骤中，选择的发酵周期是100天。

作为优选，在菌株发酵步骤中，选择的发酵条件是黑暗、28℃。

作为优选，在次级代谢产物提取步骤中，使用甲醇作为浸提溶液，甲醇能够破坏细胞壁，有利于次级代谢产物的浸提；优选地，超声提取更加有利于破坏细胞壁，加快了次级代谢产物的提取。

作为优选，在分离纯化步骤，选择制备型液相色谱的方式纯化目标化合物，流动相为甲醇—水，体积比为18-82。

本发明的有益效果：

本发明在大量发酵之前，优化培养基和培养条件，选择B9-1产量较高的培养基和培养条件进行发酵，旨在获得更多的目标产物，操作简单，成本低廉。

附图说明

图1是蕈青霉B9在MEA培养基上生长5天的图片；

图2是蕈青霉B9菌丝棉兰染色地显微图片(放大倍数为40倍)；

图3是B9-1的HPLC色谱图；

图4是B9-1的1H-NMR；

图5是B9-1的13C-NMR。

具体实施方式

本实施例中的菌种培养基和发酵培养基均为发明人自身配制，若无特殊说明则均为市售的普通商品。

实施例1：菌株形态鉴定和分子生物学鉴定

(3)种子液制备：将保存在-80℃超低温冰箱的分离于南海来源菌株B9的甘油管接种至PDA平板上，28℃静置培养3天。待PDA平板(真菌培养基：5.0g马铃薯浸粉；20.0g葡萄糖；20.0g琼脂；海水晶33.0g；H2O 1L；调整PH至6.0)上由明显的菌丝长出之后，加入适量的无菌水，用无菌的接种环将菌丝洗下，将孢子悬液接种至200ml PDB液体培养基(真菌培养基：10.0g马铃薯浸粉；20.0g葡萄糖；海水晶33.0g；H2O 1L；调整PH至6.0)中，28℃，200rpm，3天。

(4)形态鉴定：采用三点法将种子液以2ul/点接种在MEA平板上(20.0g麦芽糖提取物；1.0g蛋白胨；20.0g葡萄糖；0.005g CuSO4.5H2O；0.01g ZnSO4.7H2O；20.0g琼脂；海水晶33.0g；H2O 1L；调节PH至7.0-7.5)。待种子液被MEA培养基完全吸收之后，在恒温培养箱中28℃倒置培养5天。制备菌丝玻片：采用插片法，将1.0cm×1.0cm的盖玻片高压灭菌，以45°插入至接种点附近，恒温培养箱中28℃倒置培养5天。

(5)分子生物学鉴定：挑取MEA平板上的菌丝，使用南京擎科植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并以此为模板扩增管家基因5.8S rDNA和28S rDNA的基因间隔序列(Thenuclear ribosomal internal transcribed spacer region，ITS)。

ITS PCR扩增引物序列如下所示：

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

实施例2：菌株发酵

(1)种子液制备：制备方法同实施例1(1)

(2)小批量发酵：将种子液按照1ml/10g的比例接种到大米固体培养基、玉米固体培养基、大米+1固体培养基、玉米+1固体培养基中；培养时间分别为30天和100天；培养条件分别为光照和黑暗；培养温度均为28℃。每组设置两个平行。

大米固体培养基：1000.0g大米，33g海水晶，0.15g MgSO4.7H2O，1000.0ml H2O；

玉米固体培养基：1000.0g玉米，33g海水晶，0.15g MgSO4.7H2O，1000.0ml H2O；

大米+1固体培养基：1000.0g大米，33g海水晶，20.0g麦芽糖，20.0g山梨醇，3.0g酵母，0.5g色氨酸，10.0g谷氨酸钠，0.5gK2HPO4，0.3g MgSO4.7H2O，1000.0ml H2O，调节PH＝7.0-7.5；

玉米+1固体培养基：1000.0g玉米，33g海水晶，20.0g麦芽糖，20.0g山梨醇，3.0g酵母，0.5g色氨酸，10.0g谷氨酸钠，0.5gK2HPO4，0.3g MgSO4.7H2O，1000.0ml H2O，调节PH＝7.0-7.5。

对小批量发酵产物，用3倍体积的甲醇浸泡过夜，次日超声浸提30min，减压抽滤得到滤液。重复此步骤三次。合并所得滤液，减压旋蒸得发酵浸膏，加入3ml甲醇溶解浸膏即可获得发酵粗提物。

(3)大批量发酵：种子液制备同实施例1(1)。根据实施例2(2)的小批量发酵产物的液相结果，选择大米固体培养基进行大量发酵。配制4kg大米固体发酵培养基，50g/罐，分装在80个发酵罐中，121℃高压灭菌备用。将种子液以5ml/罐进行接种，28℃，黑暗，静置培养100天。对大批量发酵产物，用3倍体积的甲醇浸泡过夜，次日超声浸提30min，减压抽滤得到滤液。重复此步骤三次。合并所得滤液，减压旋蒸得发酵浸膏，用于后续分离纯化。

实施例3：目标化合物的分离纯化

(1)将实施例2步骤(3)得到的发酵浸膏首先用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯先用3％比例的水饱和，以乙酸乙酯：水1:1进行萃取，重复3次。取有机相进行后续试验。

(2)将萃取物首先用大孔树脂柱色谱进行洗脱(大孔树脂型号为D101，柱体积约为4L)洗脱剂选择水和乙醇，分别用3倍柱体积的去离子水(组分1)、20％乙醇(组分2)、40％乙醇(组分3)、60％乙醇(组分4)、80％乙醇(组分5)和100％乙醇(组分6)进行洗脱。每个洗脱梯度的流出液分3段进行收集。

(3)对于实施例3(2)获得的组分2，减压浓缩至重量不再减少，过硅胶柱色谱(硅胶柱体积约为300ml，硅胶G规格是100-200目)。硅胶柱层析的流动相是甲醇和氯仿，采用梯度洗脱，V氯仿：V甲醇＝(100：1)(组分2-1)、V氯仿：V甲醇＝(60：1)(组分2-2)、V氯仿：V甲醇＝(50：1)(组分2-3)、V氯仿：V甲醇＝(40：1)(组分2-4)、V氯仿：V甲醇＝(30：1)(组分2-5)、V氯仿：V甲醇＝(20：1)(组分2-6)、V氯仿：V甲醇＝(10：1)(组分2-7)、V氯仿：V甲醇＝(5：1)(组分2-8)、V氯仿：V甲醇＝(1：1)(组分2-9)。得到V氯仿：V甲醇＝(30：1)(组分2-5)。

(4)对于实施例3(3)获得组分2-5，使用制备型液相色谱进行分离纯化即可获得目标化合物B9-1。流动相为甲醇-水，体积比为18-82。提供了该化合物的液相图(见图3)、核磁图(见图4-5)

B9-1。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种深海来源蕈青霉及获得化合物

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> ITS1(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> ITS4(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 566

<212> DNA

<213> 扩增产物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

catcgagtga cggctctggg tccacctccc acccgtgttt aactgtacct tgttgcttcg 60

gcgggcccgc ctcacggccg ccggggggct ctcccgcccc cgggcccgcg cccgccgaag 120

ccacctgtga acgctgtctg aagtatgcag tctgagacaa ctagctaaat tagttaaaac 180

tttcaacaac ggatctcttg gttccggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataatt 240

aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gagtctttga acgcacattg cgccctctgg 300

tattccggag ggcatgcctg tccgagcgtc attgctgccc tcaagcacgg cttgtgtgtt 360

gggccctcgt ccccccgggg acgggcccga aaggcagcgg cggcaccgcg tccggtcctc 420

gagcgtatgg ggcttcgtca cccgctcgtt aggcccggcc ggcgccagcc gaccccccct 480

caatctttaa ccaggttgac ctcggatcag gtagggatac ccgctgaact taagcatatc 540

ataaagcggg aagaaaagta ttaaaa 566

Claims

1.一株深海来源蕈青霉(Penicillium paxilli)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武汉大学，保藏日期：2021.6.7，保藏号CCTCC M 2021685。

2.一种来源权利要求1所述的蕈青霉(Penicillium paxilli)的化合物B9-1，结构式如下：

3.化合物B9-1的制备方法，其步骤如下：

(1)将蕈青霉CCTCC M 2021685菌种培养基中进行培养得种子液；

(2)菌株种子液在发酵培养基中培养；

(3)发酵液经有机溶剂提取，减压浓缩得发酵浸膏；

(4)浸膏依次经过乙酸乙酯萃取、大孔树脂柱层析、硅胶柱层析、制备型高效液相，获得化合物B9-1。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，

步骤(1)中，所述菌种培养基是PDB液体培养基；

步骤(2)中，所述发酵培养基是大米固体发酵培养基，所述培养条件是28℃、黑暗、静置培养100d；

步骤(3)中，所述有机溶剂为甲醇，提取方式为超声30分钟；

步骤(4)中，乙酸乙酯萃取与提取液比例为1:1，萃取3次；

步骤(4)中，大孔树脂柱层析的流动相是乙醇和水，采取梯度洗脱，V乙醇：V水＝0：100～100：0。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，硅胶柱层析的流动相是甲醇和氯仿，采取梯度洗脱，V氯仿：V甲醇＝100：1～1：10。