CN115708826A - 一种皮落青霉次级代谢产物在抗菌化合物中的应用及其提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮落青霉次级代谢产物在抗菌化合物中的应用及其提取纯化方法，本发明首次从皮落青霉菌种中分离出具有抑制耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的次级代谢产物，该次级代谢产物用于制备耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的药物，具有良好的临床前景。本发明还提供了从皮落青霉菌种中分离次级代谢产物的方法，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于抗菌化合物技术领域，具体涉及一种皮落青霉次级代谢产物在抗菌化合物中的应用及其提取纯化方法。
背景技术
海量的海洋生物物种为获取大量结构多样、活性优良的天然产物提供了宝贵资源。
大量的研究报道一些海洋生物的次级代谢产物具有显著的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗心血管、抗肿瘤等等。然而，近年来耐药性问题加剧，使开发出安全性高、活性好且不易耐药的抗生素成为必要。随着生命科学及技术的发展，以微生物来源的次级代谢产物越来越受到人们的关注。
致病菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等，是医院和社区的重要致病菌，可引起各种危及生命的感染，包括坏死性肺炎和皮下脓肿等。由于临床治疗中抗生素的过度使用，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等的抗生素耐药性有所增加，研制和发现新型抗生素成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明所提取纯化的皮落青霉次级代谢产物，提取自皮落青霉S14菌种(拉丁文名称：Penicillium crustosum)，所述皮落青霉S14菌种来源于南海海泥，保藏编号：CCTCCNO：M 20221447。本发明皮落青霉次级代谢产物分子式为：C15H11NO3，结构式如式I：
本发明所述皮落青霉S14菌种，如图1和图2所示，菌丝体呈墨绿色，边缘区域呈白色，有色素生成，无渗出液，菌落背面呈黄色，棉兰染色观察，形态特征与青霉属真菌相近，通过提取菌丝体基因组DNA，并进行序列比对，鉴定为皮落青霉菌种。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种皮落青霉次级代谢产物在抗菌化合物中的应用。
优选地，所述皮落青霉次级代谢产物能够抑制耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性。
具体地，所述抗菌化合物包括抗菌药物及其盐。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法，其由以下步骤组成：
S1、制备粗提物：将发酵培养得到的皮落青霉加入乙醇浸泡，抽滤得到滤液，将得到的滤液旋转蒸发到原体积的1/4，按照体积比1∶1加入乙酸乙酯萃取，然后再次旋转蒸发得到发酵浸膏，加入甲醇溶解发酵浸膏，得到粗提物；S2、分离纯化：将所述粗提物用硅胶G层析柱分离，采用100-200目的硅胶G，洗脱梯度依次为：二氯甲烷；二氯甲烷∶甲醇＝80∶1；二氯甲烷∶甲醇＝60∶1；二氯甲烷∶甲醇＝40∶1；二氯甲烷∶甲醇＝20∶1；、二氯甲烷∶甲醇＝10∶1；收集并合并二氯甲烷∶甲醇＝20∶1和二氯甲烷∶甲醇＝10∶1的洗脱梯度所得的洗脱产物进行ODS柱层析纯化，洗脱梯度依次为：水；水∶甲醇＝80∶20；水∶甲醇＝60∶40；水∶甲醇＝40∶60；水∶甲醇＝20∶80；甲醇，将水∶甲醇＝20∶80的洗脱梯度所得的洗脱产物进行高效液相层析纯化，流动相为：甲醇∶水＝1∶1，流速2ml/min，得到淡紫色结晶。
作为本发明所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法的一种优选方案：所述皮落青霉菌种，为皮落青霉S14菌种。
作为本发明所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法的一种优选方案：所述发酵培养，是将皮落青霉S14菌种的种子培养液接种到大米固体发酵培养基中，在黑暗环境下置于培养箱中培养三十天，培养温度为28摄氏度。
作为本发明所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法的一种优选方案：所述皮落青霉S14菌种的种子培养液，其制备方法是：将皮落青霉S14菌种接种在PDA培养基平板上，在黑暗环境下置于培养箱中培养3天，培养温度为28摄氏度，当PDA培养基平板上出现单菌落后，将孢子和菌丝刮至200毫升的PDB液体培养基中，在黑暗环境下置于培养箱中培养三天，培养温度为28摄氏度。
作为本发明所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法的一种优选方案：所述大米固体发酵培养基的制备方法：将1千克大米加入到1升蒸馏水中，加入0.075克硫酸镁和33克海水晶，混合均匀，调节pH值约为7.0，按照50g/罐分装，121摄氏度下高压灭菌。
本发明的有益效果：本发明首次从皮落青霉菌种中分离出具有抑制耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的次级代谢产物，该次级代谢产物用于制备耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的药物，具有良好的临床前景。本发明还提供了从皮落青霉菌种中分离次级代谢产物的方法，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为40倍镜下观察菌丝的棉兰染色图片。
图2为本发明皮落青霉菌落照片。
图3为本发明分离提纯的皮落青霉次级代谢产物的高效液相层析色谱。
图4为本发明分离提纯的皮落青霉次级代谢产物的核磁共振氢谱。
图5为本发明分离提纯的皮落青霉次级代谢产物的核磁共振碳谱。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
本发明皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法：
1、种子液制备：将皮落青霉S14菌种接种在PDA培养基平板上，在黑暗环境下置于培养箱中培养3天，培养温度为28摄氏度，当PDA培养基平板上出现单菌落后，将孢子和菌丝刮至200毫升的PDB液体培养基中，在黑暗环境下置于培养箱中培养三天，培养温度为28摄氏度。
2、菌种发酵培养：4千克接种了种子液的大米固体发酵培养基分别装入80个发酵罐，将步骤1得到的种子液接种到大米固体发酵培养基中，每克大米固体发酵培养基上加入100微升的种子液，分别在黑暗环境下置于培养箱中培养三十天，培养温度为28摄氏度。(所述大米固体发酵培养基制备方法：将1千克大米加入到1升蒸馏水中，加入0.075克硫酸镁和33克海水晶，混合均匀，121摄氏度下高压灭菌，调节pH值为7.0)。
3、制备粗提物：在发酵培养得到的大米固体发酵培养基及皮落青霉S14菌种的混合发酵产物中加入150毫升/罐的CH3CH2OH，浸泡1O小时，抽滤得到滤液，将得到的滤液旋转蒸发到原体积的1/4，加入乙酸乙酯萃取，其中，加入的乙酸乙酯的体积与滤液的体积比为1∶1，然后再次旋转蒸发，得到发酵浸膏总计35克，加入20毫升的CH3OH溶解发酵浸膏，得到粗提物。
4、分离纯化：
(1)硅胶层析柱分离：将所述粗提物用硅胶G层析柱分离，采用100-200目的硅胶G，洗脱液：二氯甲烷-甲醇，洗脱液梯度及各洗脱梯度所得洗脱产物编号见表1。各洗脱梯度下得到的洗脱产物分别编号为F1-F6。
表1洗脱液梯度及各洗脱梯度所得洗脱产物编号
| 产物编号 | 洗脱液体积比(v∶v) |
| F1 | 二氯甲烷 |
| F2 | 二氯甲烷∶甲醇＝80∶1(v∶v) |
| F3 | 二氯甲烷∶甲醇＝60∶1(v∶v) |
| F4 | 二氯甲烷∶甲醇＝40∶1(v∶v) |
| F5 | 二氯甲烷∶甲醇＝20∶1(v∶v) |
| F6 | 二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(v∶v) |
以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为指示菌，对各洗脱梯度下得到的产物F1-F6分别进行活性组分筛选；
活性组分的筛选方法为：将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MHB培养液(指示菌菌种浓度：OD600nm＝0.1)涂布在MHB培养基平板上，并在平板上用打孔器打孔，每孔直径6mm；每孔加入30微升的F1-F6各组洗脱产物作为实验组，每孔加入30微升的氯霉素(浓度为100μg/ml)作为阳性对照，每孔加入30微升的甲醇为阴性对照，37摄氏度培养18小时，计算各实验组的抑菌圈直径(cm)。
以上抑菌活性筛选结果显示，组分F5和F6具有抑菌活性，合并组分F5和F6，计为组分A，进行下一步分离。
(2)将步骤(1)分离得到的组分A进行ODS柱层析纯化，洗脱液：水-甲醇；洗脱液梯度及各洗脱梯度所得洗脱产物编号见表2。各洗脱梯度下得到的洗脱产物分别编号为A1-A6。
表2洗脱液梯度及各洗脱梯度所得洗脱产物编号
| 产物编号 | 洗脱液体积比(v∶v) |
| A1 | 水 |
| A2 | 水∶甲醇＝80∶20(v∶v) |
| A3 | 水∶甲醇＝60∶40(v∶v) |
| A4 | 水∶甲醇＝40∶60(v∶v) |
| A5 | 水∶甲醇＝20∶80(v∶v) |
| A6 | 甲醇 |
以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为指示菌，参照步骤(1)所述方法对各洗脱梯度下得到的产物A1-A6分别进行活性组分筛选。
抑菌活性筛选结果显示，组分A5具有抑菌活性。
(3)取少量步骤(2)得到的活性组分A5进行薄层色谱层析(TLC)，用于分析活性组分A5中的具体物质组成，展开剂为：二氯甲烷∶甲醇＝20∶1(v∶v)，于紫外灯下(254nm)检测分离得到的条带，为后续的纯化步骤提供参考。
(4)将步骤(2)得到的活性组分A5进行HPLC纯化，流动相为50％甲醇：50％水(体积比)；流速2ml/min，得到淡紫色结晶，将该组分按照步骤(1)所述方法测试抑菌活性，经抑菌活性测试，确认为该抑菌活性组分为目标化合物，用1H-NMR和13C-NMR鉴定(图3-图5)，其分子式为：C15H11NO3，结构式为：
计算得本发明所述皮落青霉次级代谢产物的得率为：15mg/kg大米。
实施例2：
皮落青霉次级代谢产物作为抗菌化合物的应用：
皮落青霉次级代谢产物的最小抑菌浓度(MIC)试验：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis，MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsie//a aerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)作为指示菌，将上述各指示菌分别用MHB液体培养基于37摄氏度下培养，指示菌液中指示菌浓度1×105CFU/ml；
将上述各指示菌菌液分别加入到96孔板中，并分别加入各浓度梯度的皮落青霉次级代谢产物化合物I，具体的，分别将所述皮落青霉次级代谢产物化合物I的浓度梯度设置为：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，并在各菌液中加入50μg/mL的氯霉素作为阳性对照。将96孔板放置于恒温培养箱中，37摄氏度下培养18小时，对于上述各指示菌，使得菌液变澄清的最低给药浓度即是该化合物对该指示菌的最小抑菌浓度。
实验结果：
金黄色葡萄球菌(Staphy/ococcus aureus)的MIC为：25μg/mL；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphy/ococcus epidermidis，MRSA)的MIC为：25μg/mL；耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的MIC为：50μg/mL；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的MIC均为200μg/mL。
以上实验结果表明，本发明皮落青霉次级代谢产物具有良好的抑菌活性，可以作为抑菌化合物，尤其是对于耐药菌株：耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有非常优异的抑菌效果，可以用于解决临床上耐药菌感染较难治疗的技术问题。
研究例：
将实施例1中步骤2：菌种发酵培养的发酵培养基分别选为大米固体发酵培养基或玉米固体培养基，发酵培养条件分别为黑暗环境或日光灯光照环境，研究不同培养条件得到的粗提物的抑菌效果，实验结果见表3。
实验方法：按照实施例1步骤1-3的方法在各实验条件下分别进行菌种发酵培养，制备粗提物。将表3所示的各指示菌的培养液(指示菌菌种浓度：OD600nm＝0.1)分别涂布在MHB培养基平板上，并在各培养基平板上用打孔器打孔，每孔直径6mm；每孔加入30微升的粗提物作为实验组，每孔加入30微升的氯霉素(浓度为100μg/ml)作为阳性对照，每孔加入30微升的甲醇为阴性对照，37摄氏度培养18小时，计算各实验组的抑菌圈直径(cm)，不同培养条件得到的粗提物的抑菌效果见表3。
表3不同培养条件得到的粗提物的抑菌效果
从以上实验结果可知，大米固体培养基发酵得到的粗提物抑菌活性优于玉米固体培养基，因此优选采用大米固体培养基进行发酵。
应说明的是，以上，仅是本发明的较佳实施例，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种皮落青霉次级代谢产物在抗菌化合物中的应用，其特征在于：所述皮落青霉次级代谢产物的化学结构式如式I所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述皮落青霉次级代谢产物能够抑制耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抗菌化合物包括抗菌药物及其盐。
4.权利要求1所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法，其特征在于：由以下步骤组成：
S1、制备粗提物：将发酵培养得到的皮落青霉加入乙醇浸泡，抽滤得到滤液，将得到的滤液旋转蒸发到原体积的1/4，按照体积比1∶1加入乙酸乙酯萃取，然后再次旋转蒸发得到发酵浸膏，加入甲醇溶解发酵浸膏，得到粗提物；
S2、分离纯化：将所述粗提物用硅胶G层析柱分离，采用100-200目的硅胶G，洗脱梯度依次为：二氯甲烷；二氯甲烷∶甲醇＝80∶1；二氯甲烷∶甲醇＝60∶1；二氯甲烷∶甲醇＝40∶1；二氯甲烷∶甲醇＝20∶1；、二氯甲烷∶甲醇＝10∶1；收集并合并二氯甲烷∶甲醇＝20∶1和二氯甲烷∶甲醇＝10∶1的洗脱梯度所得的洗脱产物进行ODS柱层析纯化，洗脱梯度依次为：水；水∶甲醇＝80∶20；水∶甲醇＝60∶40；水∶甲醇＝40∶60；水∶甲醇＝20∶80；甲醇，将水∶甲醇＝20∶80的洗脱梯度所得的洗脱产物进行高效液相层析纯化，流动相为：甲醇∶水＝1∶1，流速2ml/min，得到淡紫色结晶。
5.根据权利要求4所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法，其特征在于：所述皮落青霉菌种，为皮落青霉S14菌种。
6.根据权利要求4或5所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法，其特征在于：所述发酵培养，是将皮落青霉S14菌种的种子培养液接种到大米固体发酵培养基中，在黑暗环境下置于培养箱中培养三十天，培养温度为28摄氏度。
7.根据权利要求6述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法，其特征在于：所述皮落青霉S14菌种的种子培养液，其制备方法是：将皮落青霉S14菌种接种在PDA培养基平板上，在黑暗环境下置于培养箱中培养3天，培养温度为28摄氏度，当PDA培养基平板上出现单菌落后，将孢子和菌丝刮至200毫升的PDB液体培养基中，在黑暗环境下置于培养箱中培养三天，培养温度为28摄氏度。
8.根据权利要求4或5所述的皮落青霉次级代谢产物的提取纯化方法，其特征在于：所述大米固体发酵培养基的制备方法：将1千克大米加入到1升蒸馏水中，加入0.075克硫酸镁和33克海水晶，混合均匀，调节pH值为7.0，121摄氏度下高压灭菌。
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