CN115806881A - 一种青霉属真菌及其在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）UJNMF0503，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.40172；所述的青霉属真菌及其发酵产物可用于生产抗菌药物。本发明还提供了3个上述青霉属真菌产生的具有抗菌作用的嗜氮酮类化合物：
，在开发具有抗菌作用的药物方面有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋天然药物领域，具体涉及一种可生产嗜氮酮类化合物的青霉属真菌及其在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
弧菌属(Vibrio)于革兰氏阴性条件致病菌，具有嗜盐性，广泛分布于河口及海洋环境中，不仅能感染鱼、虾、贝类等水产经济动物，造成严重的经济损失，同时也是一类重要的食源性致病细菌，可以引起急性肠胃炎、伤口感染、败血症等疾病，严重威胁渔业生产和公众健康。目前已报道的海水养殖动物病原弧菌有20多种，其中12种可导致人类疾病，病原弧菌分布广泛，海产品中携带率高，已经成为世界性食源性病原体，是细菌性食物中毒的主要病原菌之一，其大规模流行可能对全球公共卫生和经济发展构成巨大威胁，亟需开发安全有效的弧菌抗菌剂。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus)广泛分布于自然界中，是人体和动物最常见的致病菌之一，主要寄居在动物体的粘膜、皮肤、鼻咽部等。作为第三大食源性致病菌，金黄色葡萄球菌可以通过食物为载体使人中毒，轻则会呕吐、恶心、腹泻、腹痛，重则会导致肺败血症和脓毒症等疾病，给全球的公共卫生安全带来艰巨的难题。
海洋来源微生物能够产生结构新颖、活性广泛的代谢产物，是抗菌剂研发的重要资源，因此筛选具有抗菌作用的海洋真菌，发现具有抗菌作用的活性物质，对新型抗菌药物的研发具有重要意义。
发明内容
针对目前抗菌药物的迫切需求，本发明提供一种青霉属真菌（Penicillium sclerotiorum ）UJNMF 0503，其发酵产物具有抗菌作用。
本发明的另一目的是提供一种青霉属真菌发酵物中分离具有抗菌活性的嗜氮酮类化合物及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种菌核青霉（Penicillium sclerotiorum） UJNMF 0503，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号：CGMCC No. 40172。
一种菌核青霉（Penicillium sclerotiorum） UJNMF 0503及其发酵产物在生产抗菌药物中的应用。所述菌核青霉（Penicillium sclerotiorum） UJNMF 0503培养后可产生发酵产物，所述发酵产物具有抗菌活性，可用于生产具有抗菌活性的药物或添加剂。
上述青霉属真菌产生的具有抗菌作用的嗜氮酮类化合物，其结构如式（I）所示。
式（I）。
式（I）嗜氮酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌核青霉（Penicillium sclerotiorum） UJNMF 0503的发酵；
（2）从步骤（1）所得发酵物中经提取得到发酵提取物；
（3）步骤（2）中的提取物通过正相硅胶柱、快速中压层析柱、反相C18柱、高效液相色谱等方法进行分离。
本发明提供一种步骤（2）中提取物，或式（I）所示化合物在制备抗菌药物或药物中间体中的用途。
本发明提供一种含有步骤（2）中提取物，或式（I）所示化合物的抗菌药物。所述抗菌药物还包括医学上可接受的辅料以及其他有效成分，以扩大杀菌谱或增强抗菌效果。
本发明具有以下优点：
本发明的嗜氮酮类化合物可以通过Penicillium sclerotiorum UJNMF 0503的发酵提取分离获得，能够抑制创伤弧菌或金葡萄球菌的生长，在制备抗菌药物方面具有应用潜力。
生物保藏信息
菌核青霉（Penicillium sclerotiorum） UJNMF 0503，于2022年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为中国北京，，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No. 40172。
附图说明
图1为真菌Penicillium sclerotiorum UJNMF 0503平板培养图片；
图2为式（I）所示化合物主要的1H-1H COSY、HMBC信息；
图3为式（I）所示化合物主要的NOESY信息；
图4位式（I）所示化合物的ECD谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为商业购买。
实施例1 菌种的分离纯化与鉴定
从南海海域采集的样品中经分离纯化获得菌种Penicillium sclerotiorum UJNMF 0503，其典型培养物图片如图1所示：菌落呈圆形，菌丝微黄色。经ITS rDNA检测，与Gene Bank中菌核青霉Arthrinium sp. zzz1842同源性为100%，鉴定为Penicillium sclerotiorum真菌。
实施例2 发酵物的抗菌活性
种子培养基的配制方法：土豆浸出液200 mL，葡萄糖20 g，海盐 30 g，用水定容到1 L。将培养基装入20个500 mL的三角烧瓶中，每瓶约150 mL，在121℃高压蒸汽灭菌25分钟，备用。
PDB发酵培养基配置方法：土豆浸出液200 mL，葡萄糖20 g，海盐 30 g，用水定容到1 L。置于1 L三角瓶中，每瓶350mL液体培养基，共150瓶。121℃高压蒸汽灭菌25分钟，备用。
用无菌竹签挑取适量的真菌Penicillium sclerotiorum UJNMF 0503菌种接种入种子培养基中，28℃摇床（160 rpm）培养3天得到种子液，然后用移液枪接种10 mL种子液到1 L的装有PDB培养基的三角烧瓶中，于28℃静置培养30天后，收取发酵物。
将发酵物用纱布进行过滤分为菌体和菌液，菌体用95%乙醇浸泡，浸取液回收乙醇后剩余水相，再用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物A，菌液用等量乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物B，A、B合并得到总提取物。
以纸片扩散法测定总提取物对Staphylococcus aureus ATCC25923和Vibrio vulnificus ATCC27562的抗菌活性：分别将上述菌种接种到LB液体培养基中37 °C摇床（180 rpm）培养24小时，然后通过麦氏比浊法，用LB液体培养基将培养液的菌种浓度稀释到约108 cfu/mL备用；在50-60 ℃时，每20 mL无菌LB固体培养基中加入20 μL上述菌种稀释液后迅速倒入直径为9cm的灭菌培养皿中，待平板冷却后，将6 mm的无菌纸片（含100 μg待测样品）置于上述平板中37 ℃培养18小时，观察抑菌圈大小。
实验结果显示，Penicillium sclerotiorum UJNMF 0503的发酵提取物在100μg/纸片的浓度下能够抑制Staphylococcus aureus和Vibrio vulnificus的生长，抑菌圈分别为7.0 mm、7.5 mm。
实施例3 嗜氮酮类化合物的制备
按照实施例1的方法获得70 L液体培养基，菌体用95%乙醇浸泡、浸取液回收乙醇后剩余水相再用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物A，菌液用等量乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物B，A、B合并得到总提取物200 g。乙酸乙酯提取物用大孔树脂吸附材料进行柱层析，以乙醇/水作为洗脱剂，体积比30%、50%、75%、90%进行洗脱，回收洗脱溶剂，获得4个馏分（Fr.1-Fr.4）。
Fr.2进一步以二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂进行正相硅胶（200-300目）柱层析，根据薄层层析情况合并各个流份，回收洗脱溶剂，获得8个馏分（Fr.2-1-Fr.2-8）。Fr.2.4通过Flash RP-C18柱层析（甲醇/水25:75-100:0）进行梯度洗脱，得到6个馏分（Fr.2.4.1-Fr.2.4.6），Fr.2.4.1通过RP-C18柱层析，以甲醇/水（25:75-70:30）进行梯度洗脱，得到3个馏分（Fr.2.4.1.1- Fr.2.4.1.3），Fr.2.4.1.2通过半制备高效液相色谱（色谱柱为YMC-Pack ODS-A 10 mm×250 mm，流速为3.0 mL/min，检测波长280 nm和320 nm，流动相为体积比为43: 57的甲醇-水））得到式I所示化合物1 (tR=12.6 min, 7.1mg)和化合物2 (tR=14.8min, 6.6mg)。Fr.3通过硅胶柱层析（100-200目），以二氯甲烷/甲醇（1:0-0:1）进行梯度洗脱，结合薄层色谱硅胶板检测，共得到8个馏分（Fr.3.1- Fr.3.8），Fr.3.4通过硅胶柱层析（200-300目），以石油醚/乙酸乙酯（1:0-0:1）进行梯度洗脱，合并得到5个馏分（Fr.3.4.1-Fr.3.4.5），Fr.3.4.2通过硅胶柱层析（200-300目），以石油醚/乙酸乙酯（1:0-0:1）进行梯度洗脱，合并得到4个馏分（Fr.3.4.2.1- Fr.3.4.2.4），Fr.3.4.2.4通过Flash RP-C18柱层析（甲醇/水 30:70-100:0）进行洗脱，共得到3个馏分（Fr.3.4.2.4.1- Fr.3.4.2.4.3），Fr.3.4.2.4.2通过半制备高效液相色谱（色谱柱为YMC-Pack ODS-A 10 mm×250 mm，流速为3.0 mL/min，检测波长280 nm和320 nm，流动相为体积比为80：20的甲醇-水）得到式I所示化合物3(tR=16.8 min, 1.8 mg)。
式（I）所示化合物均为淡黄色胶状物，易溶于氯仿、甲醇、DMSO，难溶于水，旋光度值分别为 [α]27 D +64.3（c 0.44，MeOH）、[α]27 D +48.8（c 0.32，MeOH）、[α]27 D –654.3（c0.23，MeOH）。
对分离获得的化合物进行高分辨质谱（HR-ESIMS）、1H NMR、13C NMR、2D 1H-1HCOSY、HSQC、HMBC分析，确定了平面结构，再结合NOESY信号与ECD谱图分别确定了化合物的相对构型和绝对构型。化合物的1H和13C NMR数据见表1，主要的1H-1H COSY和HMBC相关信息见图2，ECD谱图见图3。
表1 化合物1-3在CDCl3中的1H和13C NMR数据
结构鉴定：
化合物1：黄色胶状，高分辨质谱（HRESIMS）在m/z处给出准分子离子峰399.1209（[M + H]+，计算399.1205），结合NMR波谱数据，推测化合物的分子式为C19H23ClO7，不饱和度为8。分析该化合物的NMR数据发现，该化合物与文献报道的化合物peniaphilone B类似（Sunghee Bang et al., 2021），主要区别是该化合物中sp2杂化季碳（δC 176.8）代替了peniaphilone B中sp3杂化的连氧亚甲基碳（δC 68.4; δH 3.81, 2H），结合质谱信息（相对于peniaphilone B多了14），推测化合物1中一个酯基取代了peniaphilone B中连氧亚甲基片段，H-12、H-13、H-14与C-15的HMBC相关信号进一步证明了该推测（图2）。
J 8,8a (3.0 Hz) 说明H-8与H-8a位于平面同侧；NOE谱图中，H-8a与H3-18相关推测H-8a与H3-18处于平面的同侧，H-12与H3-17相关，表明H-12和H3-17位于环平面的同侧；根据文献报道（Bin-Bin Gu et al. 2018），在CDCl3中，C-10、C-16 化学位移值为141.3、27.0时C-11和C-12为反式，化学位移值为144.0，23.7时C-11和C-12为顺式，推测该化合物C-11和C-12为顺式；该化合物的ECD谱与计算值基本一致（图4），可以推测出左侧吡喃醌双环结构绝对构型为7R, 8R, 8aS，文献查阅显示已报道的azaphilones类化合物C-13均为S构型，从生源上推测化合物1的C-13绝对构型为S，因此该化合物构型为7R, 8R, 8aS,11S, 12S,13S。
化合物2：黄色胶状，高分辨质谱（HRESIMS）在m/z处给出准分子离子峰399.1209（[M + H]+，计算399.1205），结合NMR波谱数据，推测化合物的分子式为C19H23ClO7，不饱和度为8。该化合物NMR数据与化合物化合物1基本一致，但其中有三个H和两个C化学位移值差别较大，化合物1中，δ H 6.52 (H-10)，2.63(H-13)，1.23(H3-17)；δ C 140.2 (C-10)，24.8 (C-17)；化合物2中，δ H 6.40 (H-10)，2.55 (H-13)，1.11 (H3-17)；δ C 138.2 (C-10)，25.9 (C-17)，推测两化合物在C11、C-12或C13位的构型不同。
化合物2中的J 12,13 (5.2 Hz)以及H-12和H3-17的NOE相关信号，与化合物1类似，推测两个化合物H-12和H-13的相对构型一致；化合物2中C-10、C-16化学位移值为139.4、26.1，说明C-11和C-12为反式，因此推测化合物2与1相比，区别在于C-11的构型。另外，化合物2的ECD谱图与1基本一致，因此该化合物构型为7R, 8R, 8aS,11R, 12S, 13S。
化合物3：黄色胶状，高分辨质谱（HRESIMS）在m/z处给出准分子离子峰395.1624（[M + H]+，计算395.1620），结合NMR波谱数据，推测化合物的分子式为C21H27ClO5，不饱和度为8。分析13C，HSQC和DEPT谱数据，表明该化合物含有6个sp2季碳，4个sp2次甲基，1个sp3季碳，3个次甲基，2个亚甲基，5个甲基。1H谱数据显示，该化合物含有4个烯烃质子δ H 6.14 (s,H-4)，6.07 (d, H-9)，7.35 (d, H-10)，5.46 (d, H-12)，通过与已知化合物isochromophilones IV比较（Noriko Arai, 1995），发现两个化合物核磁数据在三个位置有较大差异 [isochromophilones IV δ C 118.9 (C-9)，141.9 (C-10)，12.4 (C-16)；δ H6.96 (H-10)，1.81(H-16)；化合物3 δ C 121.4 (C-9)，133.7 (C-10)，20.3 (C-16)；δ H 6.07(H-9), 7.35 (H-10), 1.88 (H-16)]，推测是由于C-11,12位双键构型差异引起的空间效应，因此推测C11/C12双键为cis。通过比较类似化合物C-11,12构型差异对化学位移值的影响（Bin-Bin Gu et al. 2018）进一步证实了该推测。
J 8,8a (10.2 Hz) 推测H-8与H-8a位于平面两侧；NOE谱图中，H-8a与H3-18无NOE相关推测H-8a与H3-18处于平面的两侧，并且该化合物的ECD谱图与hypocrellone A (Hui-Chun Wang et al. 2021)类似，因此推测该化合物的构型为7R, 8R, 8aR,13S。
化合物的结构如下：
实施例4 式（I）所示化合物的抗菌活性测试
以Staphylococcus aureus ATCC25923和Vibrio vulnificus ATCC27562作为测试菌株，首先将菌株接种到LB固体培养基上进行复苏，然后挑取适量菌落接种到液体培养基37℃、160 rpm摇床震荡培养，使用空白培养基将培养好的菌株稀释到105 cfu/mL。使用移液枪量取190 μL加入至96孔板中，再加入10 μL含一定浓度化合物的DMSO溶液，37℃过夜培养，使用酶标仪在600 nm下测定吸光度(OD值)并计算抑制率，实验使用空白培养基作为阳性对照。
实验结果显示，在测试浓度为100 μM时，式（I）所示化合物1和2对创伤弧菌的抑制率分别为52.8%和53.2%；化合物3对金黄色葡萄球菌的抑制率为94.2%，IC50值为65.08μM。表明化合物1和2对病原弧菌具有一定的抗菌活性，化合物3对金黄色葡萄球菌具有较好抗菌活性。
Claims (6)
1.一种菌核青霉（Penicillium sclerotiorum） UJNMF 0503，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 40172。
2.一种嗜氮酮类化合物，其结构通式为：
3.一种如权利要求1所述的菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）UJNMF 0503在制备权利要求2所述的嗜氮酮类化合物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）UJNMF 0503的发酵；
（2）从步骤（1）所得发酵物中经提取得到发酵提取物；
（3）步骤（2）中的提取物通过正相硅胶柱、快速中压层析柱、反相C18柱、高效液相色谱等方法进行分离。
4.具有抗菌作用的药物，其特征在于，包含有效量的作为活性成分的如权利要求2所述的嗜氮酮类化合物，和药学上可以接受的载体。
5.权利要求2所述的化合物在制备具有抗菌作用的药物或药物中间体中的应用。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，还包括医学上可接受的辅料以及其他有效成分，以扩大杀菌谱或增强抗菌效果。
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