CN113603666B - 化合物eutyscoparol H和L及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了化合物eutyscoparol H和L及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。本发明所述的化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I(式I)是从内生真菌Eutypella scoparia SCBG‑8的发酵培养物中分离制备得到的。经试验证明，化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I对对革兰氏阳性菌S.aureus(26003)和MRSA(JCSC 3063)的MIC值为6.25μg/Ml,显示出显著的抗菌活性，可以用于制备抗菌药物。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物eutyscoparol H和L及其制备方法 和在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
Eutypella属真菌分布广泛，次级代谢产物丰富多样。主要代谢产物包括萜类、细胞松 弛素类、甾体类、内酯类，其中萜类主要以海松烷型二萜,倍半萜为主。并且，这些次级代 谢产物显示了抗肿瘤、抗菌、抗炎以及抗增殖等多种生物活性。Sesquiterpenes类化合物是 真菌中的一类代谢产物，结构特点为分子中含有15个碳原子组成的三个异戊二烯单元，具有链状、环状等多种骨架结构。该类型分子已被报道具有多种生物活性。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供具有抗菌活性的化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I。
本发明的化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I，其结构如式(I)中所示：
本发明的第二个目的是提供一种化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I的制备方法，该 制备方法中所述的化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I从植物内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的发酵培养物中分离制备得到的，具体包括以下步骤：
(1)制备内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的固体发酵培养物，用乙酸乙酯萃取该 固体发酵培养物，将乙酸乙酯萃取液经浓缩后得浸膏；
浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1， 2:1，1:1，0:1作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷-乙酸乙酯体积比2:1洗脱获得的且经TLC 薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得Rf＝0.5-0.6的组分Fr.4；
将组分Fr.4经反相柱色谱，用甲醇-水体积比70:30,75:25,80:20,85:15,90:10,95:5,100:0, 丙酮梯度洗脱，得到14个亚组分Fr.4.1-Fr.4.14，收集甲醇-水体积比80:20洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得Rf＝0.2-0.6的组分Fr.4.6；用半制备HPLC 分离纯化组分Fr.4.6，得到化合物eutyscoparol H和化合物eutyscoparolI。
所述的半制备HPLC分离纯化是使用YMC-ODS-A/AQ柱，流动相为体积比70:30的乙腈/水，流速为3mL/min，收集保留时间为10min的洗脱组分，得到化合物eutyscoparol H，收集保留时间为11.5min的洗脱组分，得到化合物eutyscoparol I。
所述的制备内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的固体发酵培养物具体步骤为：挑取内 生真菌SCBG-8的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培 养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1mL/g的接种量接种于大米培养基中，28℃条件 下培养30天，制得内生真菌SCBG-8的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，用水补足至1000 mL，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每300g大米与360mL水混 合灭菌制得。
本发明通过实验发现，化合物eutyscoparol H和化合物eutyscoparol I对金黄色葡萄球菌、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的IC50值为6.25μg/mL。阳性对照物万古霉素对以上两种革兰氏 阳性菌的IC50值为1.25μg/mL。此结果表明：本发明的化合物eutyscoparol H和化合物 eutyscoparol I具有比较显著的抗菌活性。
因此，本发明的第三个目的是提供化合物eutyscoparol H或化合物eutyscoparolI，或其 药用盐在制备抗菌药物中的应用。所述的抗菌药物优选为抗金黄色葡萄球菌，抗耐甲氧西 林金黄色葡萄球菌药物。
本发明的第四个目的是提供一种抗菌药物，该抗菌药物包含化合物eutyscoparolH或化 合物eutyscoparol I，或其药用盐作为活性成分。优选，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球 菌，抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物。
本发明的第五个目的是提供内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8在制备化合物eutyscoparol H或化合物eutyscoparol I中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明从内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8中分离制备得到化合物eutyscoparol H和 化合物eutyscoparol I，该类化合物eutyscoparol H和化合物eutyscoparol I具有比较显著的抗 菌活性，可以用于制备抗菌药物，为研究与开发新的抗菌药物提供了候选化合物，为开发 利用植物内生菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
本发明的海洋真菌Eutypella scoparia SCBG-8已公开于Wenge Zhang,MiaomiaoWang, Sha Zha,Kangping Xu,Guishan Tan,Shengxiang Qiu,Zhenxing Zou,HaiboTan.Eutyscoparols A-G,polyketide derivatives from endophytic fungus Eutypellascoparia SCBG-8.Fitoterapia, 2020,146,104681.该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明
图1是化合物eutyscoparol H的1H NMR谱；
图2是化合物eutyscoparol H的13C NMR谱；
图3是化合物eutyscoparol H的1H-1H COSY谱；
图4是化合物eutyscoparol H的HSQC谱；
图5是化合物eutyscoparol H的HMBC谱；
图6是化合物eutyscoparol H的NOESY谱；
图7是化合物eutyscoparol H的HRESIMS谱；
图8是化合物eutyscoparol H的UV谱；
图9是化合物eutyscoparol H的CD谱；
图10是化合物eutyscoparol H的IR谱；
图11是化合物eutyscoparol I的1H NMR谱；
图12是化合物eutyscoparol I的13C NMR谱；
图13是化合物eutyscoparol I的1H-1H COSY谱；
图14是化合物eutyscoparol I的HSQC谱；
图15是化合物eutyscoparol I的HMBC谱；
图16是化合物eutyscoparol I的NOESY谱；
图17是化合物eutyscoparol I的HRESIMS谱；
图18是化合物eutyscoparol I的UV谱；
图19是化合物eutyscoparol I的CD谱；
图20是化合物eutyscoparol I的IR谱；
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的分离纯化和鉴定
本发明的内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8是2016年9月，从中国科学院华南植物 园(SCBG)澳洲植物园美丽薄子木(Leptospermum brachyandrum)叶片中分离得到的，通过 ITS序列分析进一步鉴定该内生菌株，GenBank登录号为:MN788605，经blast比对，同源 分析，鉴定该菌株属于Eutypella属真菌，命名为Eutypella scoparia SCBG-8。
2、Eutypella scoparia SCBG-8的固体发酵
将活化的内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基 (每升培养基是通过以下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，用水 补足至1000mL，灭菌制得)中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1mL/g大米培养基的接种量接种于大米培养基(该培养基是通过以下方法配 制的：将每300g大米与360mL水混合灭菌混合，121℃高压灭菌20min，冷却，制得)中，28℃条件下培养30天，制得SCBG的固体发酵培养物。
3、化合物eutyscoparol H和化合物eutyscoparol I的制备
(1)往SCBG的固体发酵培养物中加入乙酸乙酯，浸泡提取24小时，重复提取3次，提取液合并后经浓缩得浸膏(45g)。
浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1， 2:1，1:1，0:1作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷-乙酸乙酯体积比2:1洗脱获得的且经TLC 薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得Rf＝0.5-0.6的组分Fr.4；
将组分Fr.4经反相柱色谱，用甲醇-水体积比70:30,75:25,80:20,85:15,90:10,95:5,100:0, 丙酮梯度洗脱，得到14个亚组分Fr.4.1-Fr.4.14，收集甲醇-水体积比80:20洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得Rf＝0.2-0.6的组分Fr.4.6；组分Fr.4.6使用 YMC-ODS-A/AQ柱，流动相为体积比70:30的乙腈/水，流速为3mL/min，收集保留时间 为10min的洗脱组分，得到化合物eutyscoparol H，收集保留时间为11.5min的洗脱组分， 得到化合物eutyscoparol I。
4、化合物eutyscoparol H和化合物eutyscoparol I的结构鉴定
1H-NMR、13C-NMR、HMBC核磁共振谱图用Bruker Advance-600核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(TMS)为内标；ESI-MS数据用VG Autospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱 用岛津UV-2600分光光度计测定，其结构鉴定如下：
如图1-20所示，图1是化合物eutyscoparol H的1H NMR谱；图2是化合物eutyscoparol H的13C NMR谱；图3是化合物eutyscoparol H的1H-1H COSY谱；图4是化合物eutyscoparol H的HSQC谱；图5是化合物eutyscoparol H的HMBC谱；图6是化合物eutyscoparol H的 NOESY谱；图7是化合物eutyscoparol H的HRESIMS谱；图8是化合物eutyscoparol H的 UV谱；图9是化合物eutyscoparol H的CD谱；图10是化合物eutyscoparol H的IR谱；图11是化合物eutyscoparol I的1H NMR谱；图12是化合物eutyscoparol I的13C NMR谱；图 13是化合物eutyscoparol I的1H-1H COSY谱；图14是化合物eutyscoparol I的HSQC谱； 图15是化合物eutyscoparol I的HMBC谱；图16是化合物eutyscoparol I的NOESY谱；图 17是化合物eutyscoparol I的HRESIMS谱；图18是化合物eutyscoparol I的UV谱；图19 是化合物eutyscoparol I的CD谱；图20是化合物eutyscoparol I的IR谱；
化合物eutyscoparol H为黄色晶体(其核磁数据如表1所示)；根据HRESIMS[M+H]+m/z 335.1860，C19H27O5，计算值为335.1853，确定化合物的分子式为C19H26O5，不饱和度为7；1H-NMR谱显示一个芳香氢质子信号[δH 7.06(1H,s,H-5)],一个反式双键烯氢质子信号[δH5.31(1H,m,H-10)],三个甲基信号[δH 0.94(3H,d,J＝7.0Hz,H-18),1.74(3H,s,H-12),1.72 (3H,s,H-13)]。13C-NMR谱以及HSQC谱显示化合物一共19个碳，包含8个季碳，包括一个羰 基基团(δC 132.8)、3个甲基、5个亚甲基和3个甲基。化合物eutyscoparol H的平面结构结构通 过进一步分析其COSY、HSQC以及HMBC等二维谱图得以确定(图4-6)，化合物eutyscoparol H的绝对构型是通过X单晶衍射法得以确定式(II)。
化合物eutyscoparol I为黄色晶体(其核磁数据如表1所示)；根据HRESIMS[M+H]+m/z 335.1849，C19H27O5，计算值为335.1853，确定化合物的分子式与化合物1相同为C19H27O5，不饱和度为7；1H-NMR谱显示一个烯烃质子信号[δH 5.31(s,H-3)]；3个甲基信 号[δH 0.93(d,J＝6.9Hz,H3-13),1.6(s,H3-14),0.77(s,H3-15)]。13C-NMR谱以及HSQC谱显 示化合物1中有15个碳信号，包括2个季碳(包括1个烯基碳)，4个次甲基，6个亚甲 基，以及3个甲基。化合物eutyscoparins G的平面结构结构通过进一步分析其COSY、HSQC 以及HMBC等二维谱图得以确定(图13-15)，化合物eutyscoparol I的绝对构型是通过通 过X单晶衍射法得以确定式(II)。
经过上述方法分离的目标化合物eutyscoparol H和化合物eutyscoparol I的结构式如式(I) 所示：
表1化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I的核磁数据(500MHz/125MHz,δinppm,J in Hz)
实施例2
采用MHB(Microbroth dilution in Mueller-Hinton broth medium)法测试化合物 eutyscoparol H和eutyscoparol I的抗菌活性。
1、试验用试剂：将本发明制备的化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I用二甲基亚砜 (DMSO)溶解得浓度为1mg/mL的母液，再用96孔板梯度稀释。阳性对照为万古霉素。
本实验所用菌株为S.aureus(26003)和MRSA (JCSC 3063)。
2、实验方法：按照CLSI指南，采用MHB(Microbroth dilution in Mueller-Hintonbroth medium)法测定MIC值，以刃天青为可见指示剂，评估化合物的抗菌活性。取对数生长期 的S.aureus(26003)和MRSA (JCSC 3063)细菌，新鲜HB培养基稀释以UV-6000分光光 度计调整至OD600＝0.07,将上述细菌悬液与刃天青以体积比6:9混匀接种于96孔板,每孔 加入180μL的细菌悬液以及20μL 1mg/mL化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I母液， 并设2个空白孔对照，2个阳性对照，梯度稀释后于37℃、5％CO2培养箱培养，16-20h 后观察颜色变化。每次试验重复3次，并计算其MIC值。
3、实验结果如表3所示：
表3
本发明制备的化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I对革兰氏阳性菌S.aureus(26003) 和MRSA (JCSC 3063)的MIC值为6.25μg/mL。阳性对照物万古霉素对S.aureus(26003)和 MRSA (JCSC 3063)的MIC值为6.25μg/mL。此结果表明：本发明的化合物eutyscoparol H 和eutyscoparol I具有比较显著的抗菌活性，因此，本发明为研究与开发新的抗菌药物提供 了候选化合物，为开发利用植物内生菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发 明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.如式(Ι)所示的任一化合物：
2.一种权利要求1所述的化合物eutyscoparol H和eutyscoparol I的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)制备内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的固体发酵培养物，用乙酸乙酯萃取该固体发酵培养物，将乙酸乙酯萃取液经浓缩后得浸膏；
(2)浸膏经过硅胶柱层析，用正己烷-乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷-乙酸乙酯体积比2:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得Rf＝0.5-0.6的组分Fr.4；
将组分Fr.4经反相柱色谱，用甲醇-水体积比70:30,75:25,80:20梯度洗脱，收集甲醇-水体积比80:20洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：丙酮＝5:1v/v展开得Rf＝0.2-0.6的组分Fr.4.6；用半制备HPLC分离纯化组分Fr.4.6，得到化合物eutyscoparol H和化合物eutyscoparol I；
所述的半制备HPLC分离纯化是使用YMC-ODS-A/AQ柱，流动相为体积比70:30的乙腈/水，流速为3mL/min，收集保留时间为10min的洗脱组分，得到化合物eutyscoparol H，收集保留时间为11.5min的洗脱组分，得到化合物eutyscoparol I；
所述的步骤(1)制备内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的固体发酵培养物具体步骤为：挑取内生真菌SCBG-8的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1mL/g的接种量接种于大米培养基中，28℃条件下培养30天，制得内生真菌SCBG-8的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，用水补足至1000mL，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每300g大米与360mL水混合灭菌制得。
3.权利要求1所述的化合物eutyscoparol H或化合物eutyscoparol I，或其药用盐在制备抗菌药物中的应用；所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物。
4.一种抗菌药物，其特征在于，包含权利要求1所述的化合物eutyscoparol H或化合物eutyscoparol I，或其药用盐作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的抗菌药物，其特征在于，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物。
6.内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8在制备权利要求1所述的化合物eutyscoparol H或化合物eutyscoparol I中的应用。
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| New heterocyclic compounds fromRanunculus ternatusThunb.;Zi-ming Feng et al.;Bioorganic Chemi stry;第74卷;10-14 * |
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