CN110642823A - 一种吡喃衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种吡喃衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种吡喃衍生物及其制备方法和应用。本发明对青霉(Penicillium sp.)菌株TR85(CGMCC No.18116)经发酵培养、提取分离，获得一种如式(一)所示的吡喃衍生物，化学结构经核磁共振和质谱等技术鉴定。经实验发现：式(一)所示吡喃衍生物对番茄灰霉病菌与苹果轮纹病菌的MIC值分别为32μg/mL与64μg/mL，可以作为制备农用杀菌剂的新农药成分或先导化合物。
Figure DDA0002249717950000011

Description

一种吡喃衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物来源杀菌剂，具体的说是一种吡喃衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
番茄与苹果为我国主要的经济作物之一，广受欢迎，具有较好的经济效益。近年来，灰 霉病害发病率高，危害严重，尤其是大棚番茄种植，严重影响番茄品质与产量。而苹果轮纹 病能够侵染苹果树的枝干和果实，造成枝干枯萎和果实腐烂，严重时会造成整棵苹果树绝产， 造成较大的经济损失。
目前，上述植物病害防治手段主要依靠使用化学合成农药，虽然能够起到较好的防控作 用，但是随着植物病害抗药性增强，化学合成农药施用量也逐年加大，其弊端也日益凸显， 带来了环境污染与危害人类健康等问题。
相比较化学合成农药，微生物来源天然产物对人畜与非靶标生物安全，具有环境兼容性 好、不易产生抗药性等优点；此外，微生物易于规模化发酵生产，便于产业化开发。所以， 从微生物中寻找并开发微生物来源杀菌剂已经成为未来绿色农药发展的趋势。
发明内容
针对上述问题，本发明从青霉(Penicillium sp.)菌株TR85的发酵产物中分离到一种如 式(一)所述的吡喃衍生物。该吡喃衍生物为新化合物，对番茄灰霉病菌与苹果轮纹病菌具 有较强的抑菌活性，可以作为新农药成分或先导化合物，具有较好的应用开发潜力。
本发明的目的是提供一种吡喃衍生物，其结构如式(一)所示，
Figure BDA0002249717930000011
上述化合物的分子式为C11H20O4，命名为：四氢-6-(2-羟丙基)-2H-吡喃-2-乙酸甲酯。
本发明还提供了上述的吡喃衍生物的制备方法，其特征是，
1)将青霉(Penicillium sp.)TR85(CGMCC No.18116)接种于真菌固体培养基中室温 静置发酵28-35天，经乙酸乙酯提取，获得提取物，待用；
2)将上述提取物进行硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇体积比100:1至1:1进行梯度洗脱， 收集二氯甲烷-甲醇体积比40:1梯度的洗脱组分；
3)将上述步骤2)中的洗脱组分，进行反相硅胶柱层析分离纯化，以甲醇-水体积比1:9 至9：1进行梯度洗脱；收集体积比3:7的甲醇-水洗脱组分，蒸干溶剂后，即得式(一)所示 吡喃衍生物的粗品，可以直接将其配制成农用杀菌剂使用。
所述步骤1)中真菌固体培养基为大米培养基。
本发明还公开了式(一)所示吡喃衍生物在制备防治番茄灰霉病菌或苹果轮纹病菌的农 用杀菌剂方面的应用。
本发明所具有的优点：
1)本发明所涉及的吡喃衍生物具有较好抑菌活性，式(一)所示吡喃衍生物对番茄灰霉 病菌与苹果轮纹病菌的MIC值分别为32μg/mL与64μg/mL。
2)本发明所涉及的吡喃衍生物可以利用微生物进行规模发酵，具有生产工艺相对简单、 周期相对较短等特点。
3)本发明所涉及的吡喃衍生物结构相对简单，可以作为具有杀菌活性的先导化合物，便 于进行结构修饰与改造。
附图说明
图1为式(一)所示吡喃衍生物的1H NMR谱图。
图2为式(一)所示吡喃衍生物的13C NMR谱图。
图3为式(一)所示吡喃衍生物的HSQC谱图。
图4为式(一)所示吡喃衍生物的COSY谱图。
图5为式(一)所示吡喃衍生物的HMBC谱图。
具体实施方式
为阐明对本发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。
本发明从山东省东营碱蓬湿地分离到青霉(Penicillium sp.)菌株TR85，目前已保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所)，保藏日期：2019年8月2日，保藏号：CGMCC No.18116。该菌株的 实验室保存为：保存于麦芽膏琼脂培养基。
实施例1：吡喃衍生物的发酵生产及分离纯化
1)发酵培养
菌种培养：按照微生物的常规培养方法，挑取少量保存于麦芽膏琼脂培养基的菌株青霉 (Penicillium sp.)TR85，接种于PDA平板表面，28℃培养5天，作为规模发酵培养的菌种， 待用。
切取上述PDA平板表面的菌种适量，接种至已灭菌的、盛有大米培养基的锥形瓶中，室 温静置培养30天。所述大米培养基为：大米100g/瓶，蛋白胨0.6g/瓶，天然海水100mL/ 瓶。
2)式(一)所示化合物的分离纯化
将步骤1)获得的培养物用乙酸乙酯反复浸泡提取3次，合并乙酸乙酯提取液，减压蒸 馏得浸膏。
将其进行硅胶快速柱层析(内径65mm，长度300mm，具砂板及抽咀的玻璃层析柱)，按照洗脱液极性递增顺序，以体积比100:1至1:1的二氯甲烷-甲醇(流速为150mL/min) 进行梯度洗脱。收集洗脱液，并经薄层层析检测，检测时以茴香醛-浓硫酸作为显色剂，根据Rf值以及显色情况来合并相同或类似部分。收集二氯甲烷-甲醇体积比40:1梯度的洗脱组分， 将收集的组分进行反相硅胶柱层析(内径30mm，长度600mm，具标准四氟节门的玻璃层析 柱)，以体积比1:9至9：1的甲醇-水(流速为5mL/min)依次进行梯度洗脱，收集体积比 为3:7的甲醇-水洗脱组分，蒸干溶剂后得到目标化合物的粗品(含量≥80％)，可以直接配 制农药使用。
将上述组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以丙酮为洗脱溶液(流速为1mL/min)洗脱， 洗脱组分最后制备薄层层析法分离纯化(色谱条件为体积比30:1的氯仿-甲醇展开)，收集 Rf值为0.5的组分，即得高纯度(≥98％)的化合物，用于对该化合物进行鉴定及抑菌活性实 验研究。该目标化合物，白色粉末，HRESIMS m/z 239.1264[M+Na]+，提示分子式为C11H20O4， 其NMR数据见表1(附图1与2)。
表1.式(一)所示吡喃衍生物的1H(500MHz)和13C NMR(125MHz)谱图数据 (NMR测试所用溶剂：氘代甲醇)
Figure BDA0002249717930000031
根据氢谱(附图1)、碳谱(附图2)及二维谱图(HSQC附图3、COSY附图4及HMBC 附图5)可以确定，该化合物为如式(一)所示(结构中的阿拉伯数字为碳原子的标位)的 吡喃衍生物。
实施例2：抑菌活性试验
采用微量稀释法，测定式(一)所示化合物对番茄灰霉病菌或苹果轮纹病菌的抑菌活性 (《从天然产物到新农药创制-原理方法》，吴文君，2006，化学工业出版社)。
1)菌悬液的制备
将供试真菌接种于PDA培养基表面于28℃培养72h后，吸取2mL无菌0.85％NaCl 溶液(含0.25％吐温-20)洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌落轻轻刮下。吸取适量菌悬液于 无菌试管中，调至0.5麦氏比浊(相当于1.5×108CFU/mL)备用。
2)样品的配制
取1mg待测样品(式(一)所示化合物)，溶解于100μL 50％DMSO中，充分混匀后， 吸取50μL样品溶液到另一只离心管中，接着加入50μL 50％DMSO，得到浓度减半的样品 溶液。按照此方法，得到6组浓度依次减半的样品溶液。
3)最小抑制浓度(MIC)测定方法
(1)采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯 板中，第1至第6孔各加5μL的样品溶液，并以不加样品孔作为空白对照，加5μL 50％DMSO 溶液孔为溶剂对照。
(2)将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经PDB培养基稀释1000倍后，取95μL依次加入到96孔板中，使得第1至第6孔的样品浓度依次为512、256、128、64、32、16μg/mL。以上所有样品均重复三次。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于28℃生化培养箱中，培养72h。
(3)观察96孔板各孔中指示菌生长状况，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品 浓度为该化合物的MIC。
试验结果为：式(一)所示吡喃衍生物对番茄灰霉病菌与苹果轮纹病菌的MIC值分别为32μg/mL与64μg/mL。
上述实验结果证明本发明所涉及的吡喃衍生物具有较强抑菌活性，可作为防治番茄灰霉 病菌或苹果轮纹病菌的先导化合物或新农药成分。

Claims (4)

1.一种吡喃衍生物，其结构如式(一)所示，
Figure FDA0002249717920000011
2.权利要求1所述的吡喃衍生物的制备方法，其特征是，
1)将青霉(Penicillium sp.)TR85接种于真菌固体培养基中室温静置发酵28-35天，发酵产物经乙酸乙酯提取，获得提取物，待用；所述青霉(Penicillium sp.)TR85的保藏编号为CGMCC No.18116；
2)将上述提取物进行硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇体积比100:1至1:1进行梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比40:1梯度的洗脱组分；
3)将上述步骤2)中的洗脱组分，进行反相硅胶柱层析分离纯化，以甲醇-水体积比1:9至9:1进行梯度洗脱；收集体积比3:7的甲醇-水洗脱组分，蒸干溶剂后，即得式(一)所示吡喃衍生物的粗品。
3.如权利要求2所述的吡喃衍生物的制备方法，其特征是，所述步骤1)的真菌培养基为大米培养基。
4.权利要求1所述的吡喃衍生物在制备防治番茄灰霉病菌或苹果轮纹病菌的农用杀菌剂方面的应用。
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