CN110563683B - 一种苯骈吡喃酮类化合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物农药技术领域，具体的说是一种从菌株Acremonium sp.Z13（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年8月2日，保藏号：CGMCC No.18117）固体发酵产物中得到苯骈吡喃酮类化合物及其分离纯化方法和应用。苯骈吡喃酮类化合物为式（一）所示。式（一）所示化合物对灰霉病菌（Botrytis cinerea）最小抑菌浓度为128μg/mL；在20μg/mL浓度时，式（一）所示化合物对马唐[Digitaria sanguinalis]胚芽鞘的生长抑制率为58.57%，与商品化除草剂乙草胺接近；本发明所得化合物可作为具有除草活性或杀菌活性的先导化合物，进而开发微生物源除草或杀菌剂。

Description

一种苯骈吡喃酮类化合物的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域，具体的说是一种从菌株Acremonium sp. Z13固体发酵产物中得到苯骈吡喃酮类化合物及其分离纯化方法。

背景技术

灰霉病是温室种植番茄、草莓、葡萄、蔬菜、观赏植物等最重要的植物病害之一，仅次于稻瘟病，可造成显著减产和重大经济损失。灰霉病作为一种全球性真菌病害，主要由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起。灰葡萄孢具有寄主范围广、繁殖和遗传变异速度快及反复侵染频繁等特点，很容易产生抗药性，属于少数几个具有高抗药性风险的病原菌之一。

水稻田杂草发生及危害越来越重，其中马唐[Digitaria sanguinalis]的发生和危害表现近年来日益突出，已成为制约水稻丰产的主要因素之一。化学合成除草剂虽然能够有效防治杂草，但是抗药性和农药残留超标问题日趋严重，已危及农产品安全及人类健康。

从微生物、植物等生物资源中寻找杀菌或除草活性成分，具有毒性低、环境兼容性好及不易产生抗药性等优点，已经成为开发“环境友好”杀菌剂或除草剂的重要来源。

根据文献调研，苯骈吡喃酮类化合物具有显著的抗凝结、抗癌及抗艾滋病毒等活性，而本发明涉及的为新化合物苯骈吡喃酮类化合物的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种苯骈吡喃酮类化合物的制备方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种苯骈吡喃酮类化合物，为式（一）所示化合物，化合物分子式为C₁₂H₁₂O₃,

。

一种苯骈吡喃酮类化合物制备方法：

1）将菌株Acremonium sp. Z13（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2019年8月2日，保藏号：CGMCC No. 18117）于固体培养基中静置发酵，发酵产物经乙酸乙酯反复浸泡提取，合并提取液进行浓缩，获得发酵粗提物；

2）将上述发酵粗提物进行硅胶柱层析，以梯度为60:1至1:1（v/v，下同）的石油醚-乙酸乙酯作为溶剂进行梯度洗脱；

3）将上述步骤2）中石油醚-乙酸乙酯=1:1洗脱组分，进行反相硅胶柱层析，以梯度为1:9至1:0的甲醇-水作为溶剂进行梯度洗脱；

4）将上述步骤3）中甲醇-水=5:5洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为70%甲醇-水，检测波长为230 nm，流速为3 mL/min，收集保留时间t _R值为15.38 min的组分，即得式（一）所示化合物。

所述固体培养基为每150 mL天然海水中含大米70 g，玉米浆0.15 g，蛋白胨0.45g。

一种苯骈吡喃酮类化合物应用，所述式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物可用于具有杀菌或除草活性的先导化合物制备。

所述病菌为灰霉病菌（Botrytis cinerea），杂草为马唐。

本发明所具有的优点：

1）本发明所涉及的式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物为新化合物，在20 μg/mL浓度时，式（一）所示化合物对马唐[Digitaria sanguinalis]胚芽鞘的生长抑制率为58.57%，与商品化除草剂乙草胺接近。

2）本发明所涉及的式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物具有较好的抑菌活性，对灰霉病菌（Botrytis cinerea）最小抑菌浓度为125 μg/mL。

3）本发明所涉及的式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物由菌株Acremonium sp. Z13产生，便于进行规模发酵生产；其次，式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物为天然产物，相比较化学合成农药，具有环境兼容性好、不易产生抗药性等优点。

4）本发明所涉及的式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物结构简单，能够作为具有杀菌或除草活性的先导化合物，进而开发微生物源杀菌剂或除草剂。

附图说明

图1为式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物的¹H NMR谱图。

图2为式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物的¹³C NMR谱图。

图3为式（一）所示苯骈吡喃酮类化合物对马唐种子萌发的抑制作用。

具体实施方式

为阐明对本发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。

本发明从菌株Acremonium sp. Z13中分离得到如下的实施例中所指的化合物，苯骈吡喃酮类化合物结构如式（一）所示（结构中的阿拉伯数字为碳原子的标位）：

。

实施例1：式（一）所示化合物的制备方法

1) 菌株发酵培养

切取生长于PDA平板表面的菌株Acremonium sp. Z13（大小2×2 cm），接种至已灭菌的、盛有固体培养基的锥形瓶中，室温静置培养30天。发酵产物经乙酸乙酯反复浸泡提取，合并提取液进行浓缩，获得发酵粗提物。

所述固体培养基为每150 mL天然海水中含大米70 g，玉米浆0.15 g，蛋白胨0.45g。

2) 化合物的制备

将上述发酵粗提物进行减压硅胶柱层析（内径65 mm，长度300 mm，具砂板及抽咀的玻璃层析柱），按照洗脱液极性递增顺序，以梯度为60:1至1:1（v/v，下同）的石油醚-乙酸乙酯作为溶剂进行梯度洗脱；收集石油醚-乙酸乙酯=1:1洗脱组分，进行反相硅胶柱层析（内径30 mm，长度600 mm，具标准四氟节门的玻璃层析柱），以梯度为1:9至1:0的甲醇-水作为溶剂进行梯度洗脱。

收集甲醇-水=5:5反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为70%甲醇-水，检测波长为230 nm，流速为3 mL/min，收集保留时间t _R值为15.38 min的组分，即得式（一）所示化合物。

3) 化合物的结构鉴定

式（一）所示化合物，白色粉末，HR-ESI-MS m/z 205.0869 [M + H]⁺，提示分子式为C₁₂H₁₂O₃，其¹H-（附图1）和 ¹³C-NMR（附图2）数据见表1。

实施例2：除草活性试验

罗小勇等所建立的琼脂混粉法[青岛农业大学学报, 2007, 24: 267-270]用于快速测定化合物的除草活性，具有灵敏度高、操作简便、重复性好、便于大通量筛选等优点，且易于观察指示植物的生长状况；罗小勇等利用该方法对40种园林植物叶片进行了快速除草活性测定；张丽娟[植物保护, 2016, 42: 63-66]和苏范胜[应用化学, 2014, 31: 290-295]以稗草为供试杂草，采用琼脂混粉法快速测定了玉米秸秆和咪唑类化合物的除草活性；张蕴[微生物学报, 2015, 55: 292-298]和李帅[Journal of Agricultural and FoodChemistry，2014, 62: 8997-9001]以反枝苋为供试杂草，研究了微生物次生代谢产物对反枝苋根生长的抑制作用。

1）杂草种子的萌发

杂草种子先用0.2%次氯酸钠消毒处理15分钟，然后用无菌蒸馏水反复清洗，浸泡4-6小时，在黑暗条件下用无菌湿滤纸在医学托盘中发芽12小时。

2）样品溶液的制备

待测化合物以二甲亚砜（DMSO）溶解，配制为4 mg/mL溶液，用含50％DMSO的蒸馏水稀释成一定浓度，备用。

3) 试验方法

1 mL的样品溶液和99 mL无菌的琼脂水溶液混合均匀，分别倒入3个25 mL的小烧杯内冷凝；用尖嘴镊子在已冷凝的琼脂表面插5个小口后，分别夹取胚根长达4～5 mm的已发芽供试杂草种子，将胚根垂直轻轻插入小口中；每烧杯5粒，重复3次；而后将所有烧杯用锡纸封口并置于已消毒的小纸箱内，放人人工气候箱遮光培养2 d；人工气候箱的设置条件为14 h光照（25℃）和10 h黑暗（20℃）的自动循环，箱内的相对湿度为60％；。2 d后调查胚根和胚轴的长度，计算杂草生长抑制率。

计算公式为[中国农学通报, 2013, 29: 177-182]：

生长量 = 处理后的胚根(胚轴)长度 − 处理前的胚根(胚轴)长度；

抑制率(％) = [(对照平均生长量 − 处理平均生长量)／对照平均生长量]×100％。

试验结果见表2及附图3，结果表明，在20 μg/mL浓度时，式（一）所示化合物对马唐[Digitaria sanguinalis]胚芽鞘的生长抑制率为58.57%，与商品化除草剂乙草胺接近，可作为具有除草活性的先导化合物或新农药成分。

实施例3：抑菌活性试验

采用微量稀释法，测定式（一）所示化合物对灰霉病菌（Botrytis cinerea）的抑菌活性（《从天然产物到新农药创制-原理方法》，吴文君，2006，化学工业出版社）。

1）菌悬液的制备

将供试真菌接种于PDA培养基表面于28 ℃培养72 h后，吸取2 mL无菌0.85% NaCl溶液（含0.25% 吐温-20）洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌落轻轻刮下。吸取适量菌悬液于无菌试管中，调至0.5麦氏比浊（相当于1.5×10⁸ CFU/mL）备用。

2）样品的配制

取1 mg待测样品（式（一）所示化合物），溶解于100 μL 50% DMSO中，充分混匀后，吸取50 μL样品溶液到另一只离心管中，接着加入50 μL 50% DMSO，得到浓度减半的样品溶液。按照此方法，得到6组浓度依次减半的样品溶液。

3）最小抑制浓度（MIC）测定方法

（1）采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第6孔各加5 μL的样品溶液，并以不加样品孔作为空白对照，加5 μL 50%DMSO溶液孔为溶剂对照。

（2）将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经PDB培养基稀释1000倍后，取95 μL依次加入到96孔板中，使得第1至第6孔的样品浓度依次为512、256、128、64、32、16 μg/mL。以上所有样品均重复三次。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于28℃生化培养箱中培养72h。

（3）在600 nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。

试验结果为：式（一）所示化合物对灰霉病菌（Botrytis cinerea）具有较好抑制活性，MIC为125 μg/mL，具有较好抑菌活性。

上述实验结果证明本发明所涉及的苯骈吡喃酮类化合物具有较好抑菌活性，可作为防治灰霉病菌的先导化合物或新农药成分。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种苯骈吡喃酮类化合物及其制备方法和应用

<130> 6

<141> 2019-09-20

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> Acremonium sp.

<400> 1

tccgtaggtg aaccttgcgg caacccatgt gaacttacct gacgttgctt cggcggaccg 60

ccccggtgcc taaccgcgcc ggaaccaggc gcccgccggg ggaccgaaac actcttgttt 120

tttctacgcg gaattctgag tggcatttat tacaaataaa tcaaaacttt caacaacgga 180

tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtagt gtgaattgca 240

gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc ccgccagcat tctggcgggc 300

atgcctgttc gagcgtcatt tcaaccctca agacccttcc ctctcggggg acgggccttg 360

gtgttggcgg ccggctgcct accctgcgca gccgccgccg aaatgcaggg gcggtcgcct 420

cgcggtaacc attacgcagt agtaacatct cgtaactggg acgcggagcg gccacgccta 480

accccccaat tctttctaga gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag 540

catatcaata agcggaggag catatcaata agcggagga 579

Claims (2)

1.一种苯骈吡喃酮类化合物的制备方法，所述化合物如式（一）所示：

1）菌株Acremonium sp. Z13保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年8月2日，保藏号：CGMCC No. 18117；将菌株于固体培养基中静置发酵，发酵产物经乙酸乙酯反复浸泡提取，合并提取液进行浓缩，获得发酵粗提物；

2）将上述发酵粗提物进行硅胶柱层析，以梯度体积比为60:1至1:1的石油醚-乙酸乙酯作为溶剂进行梯度洗脱；

3）将上述步骤2）中石油醚-乙酸乙酯=1:1洗脱组分，进行反相硅胶柱层析，以梯度为1:9至1:0的甲醇-水作为溶剂进行梯度洗脱；

4）将上述步骤3）中甲醇-水=5:5洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为70%甲醇-水，检测波长为230 nm，流速为3 mL/min，收集保留时间t _R值为15.38 min的组分，即得式（一）所示化合物。

2.按权利要求1所述的苯骈吡喃酮类化合物制备方法，其特征在于：所述固体培养基为每150 mL天然海水中含大米70 g，玉米浆0.15 g，蛋白胨0.45 g。

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