CN110229127B - 一种红树内生真菌来源的丁内酯类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种红树内生真菌来源的丁内酯类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种红树内生真菌来源的丁内酯类化合物及其制备方法与应用。所述丁内酯类化合物具有化合物1‑3所示结构：

Description

一种红树内生真菌来源的丁内酯类化合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于红树植物内生真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种红树内生真菌来源的丁内酯类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
本发明所述红树尖瓣海莲内生真菌TGM112(CGMCC No.16499)，已在先前发明专利申请(申请号：201811476397.6、201811478315.1)中公开，先前申请人从真菌TGM112中分离获得系列抗虫活性的混元萜类化合物及异香豆素类化合物(J.Nat.Prod.,2019,82,5,1155-1164)。本发明公开从真菌TGM112中分离获得的三个结构新颖的丁内酯来化合物。
发明内容
本发明提供一种红树内生真菌来源的丁内酯类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述丁内酯类化合物具有化合物1-3所示结构：
Figure BDA0002137876130000011
本发明的另一实施方案提供一种同时制备上述化合物1-3的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制种子培养基，将TGM112菌株接入种子培养基，26～28℃，培养3～4天得种子培养液；
(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入发酵培养基中，26～28℃静置培养21～24天得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并50:50和40:60梯度洗脱得到的馏分浓缩后经正相硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝10:1-3:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1、2、3。
其中所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述种子培养基中含有葡萄糖1.5％–3.0％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。
本发明的另一实施方案提供上述化合物1-3或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防由细菌感染引起的疾病药物中的应用。所述细菌优选金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923。
本发明的另一实施方案提供上述化合物1-3或其药学上可接受的盐在防治致倦库蚊Culex quinquefasciatus中的应用。
本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于以本发明化合物1-3或其药学上可接受的盐作为活性成分。
本发明提供的另一实施方案提供上述药物组合物，还可包含其他抗菌或杀虫药物；也可以包含药学上可接受的辅料(优选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。
附图说明
图1是化合物1-3的1H-1H COSY、HMBC相关图；
图2是化合物1-2的NOESY相关图；
图3是化合物1-3的Mo2 4+络合物的ECD图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)TGM112的菌种培养
配制种子培养基：葡萄糖80g，蛋白胨8g，酵母膏8g，粗海盐10g，水4.0L，平均分装于8个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将TGM112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；
(2)TGM112的发酵
配制发酵培养基：葡萄糖1.1kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g，水50L，平均分装于75个1000mL锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养21天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)化合物1-3的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并50:50和40:60梯度洗脱得到的馏分浓缩后经正相硅胶柱层析(硅胶目数200-300目)，洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝10:1-3:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1(5.1mg,tR＝10.5min)、2(3.5mg,tR＝17.5min)、3(3.2mg,tR＝29.1min)。
Figure BDA0002137876130000031
化合物1-3的1H和13C-NMR(400/100MHz,CD3OD)数据如下表
Figure BDA0002137876130000032
Figure BDA0002137876130000041
化合物1:
Figure BDA0002137876130000042
UV(MeOH)λmax(logε)280(3.02)nm；CD(c 2×10-4mol/L,MeOH)λmax(Δε)288(-4.88)nm；IR(KBr)νmax 3315,3230,1710,1432,1082,798,718cm-1；HRESIMS m/z 213.1121[M+H]+(calcd for C11H17O4,213.1121).
化合物2:
Figure BDA0002137876130000043
UV(MeOH)λmax(logε)280(3.00)nm；CD(c 2×10-4mol/L,MeOH)λmax(Δε)292(-5.65)nm；IR(KBr)νmax 3314,3231,1707,1430,1080,799,720cm-1；HRESIMS m/z 213.1124[M+H]+(calcd for C11H17O4,213.1121).
化合物3:
Figure BDA0002137876130000044
UV(MeOH)λmax(logε)280(3.05)nm；CD(c 2×10-4mol/L,MeOH)λmax(Δε)287(-4.98)nm；IR(KBr)νmax 3313,3228,1705,1422,1092,799,716cm-1；HRESIMS m/z 213.1122[M+H]+(calcd for C11H17O4,213.1121).
实施例2
(1)TGM112的菌种培养
配制种子培养基(10.0L)：葡萄糖1.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于16个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将TGM112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养4天得种子培养液；
(2)TGM112的发酵
配制发酵培养基(100L)：葡萄糖1.6％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于150个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养24天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)化合物1-3的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并50:50和40:60梯度洗脱得到的馏分浓缩后经正相硅胶柱层析(硅胶目数200-300目)，洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝10:1-3:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1-3(结构确证数据与实施例1相同)。
实施例3
(1)TGM112的菌种培养
配制种子培养基(1.0L)：葡萄糖3.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于3个500mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将TGM112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养4天得种子培养液；
(2)TGM112的发酵
配制发酵培养基(10L)：葡萄糖3.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于15个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养22天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)化合物1-3的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并50:50和40:60梯度洗脱得到的馏分浓缩后经正相硅胶柱层析(硅胶目数200-300目)，洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝10:1-3:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1-3(结构确证数据与实施例1相同)。
本发明实施例1-3中步骤(1)-(3)菌种培养、发酵、浸膏的制备与先前发明专利中记载的步骤相同(是同一次实验制备得到的)，区别在于步骤(4)分离纯化时选取减压柱层析获得的馏分不同。
实施例4
本发明的化合物1-3按照文献方法(Pierce C.G.；Uppuluri P.；Teistan A.R.；Wormley Jr.F.L.；Mowat E.；Ramage G.；Lopez-ribot J.L.Nat.Protoc.2008，3，1494-1500)，测试对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 25923)的抗菌活性，以Ciprofloxacin作为阳性对照药，MIC值见下表。按照文献方法(Zhang,W.F.；Crickmore,N.；George,Z.；Xie,L.；He,Y.Q.；Li,Y.Z.；Tang,J.L.；Tian,L.；Wang,X.；Fang,X.J.Characterization of new highly mosquitocidal isolate of Bacillusthuringiensis-an alternative to Bti？J.Invertebr.Pathol.2012,109,217-222)，测试对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)幼虫的杀虫活性，以Azadirachtin作为阳性对照药，半数致死浓度LC50见下表。
Figure BDA0002137876130000071

Claims (4)

1.一种同时制备化合物1-3的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制种子培养基，将TGM112菌株接入种子培养基，26～28℃，培养3～4天得种子培养液；
(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入发酵培养基中，26～28℃静置培养21～24天得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并50:50和40:60梯度洗脱得到的馏分浓缩后经正相硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝10:1-3:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1、2、3；
所述化合物1-3所示结构如下：
Figure FDA0002708132270000011
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述种子培养基中含有葡萄糖1.5％–3.0％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。
3.化合物1在制备治疗和/或预防由细菌感染引起的疾病药物中的应用，所述化合物1具有如下结构：
Figure FDA0002708132270000012
4.化合物2在防治致倦库蚊Culex quinquefasciatus中的应用，所述化合物2具有如下结构：
Figure FDA0002708132270000021
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