CN110229131B - 角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110229131B
CN110229131B CN201910639955.4A CN201910639955A CN110229131B CN 110229131 B CN110229131 B CN 110229131B CN 201910639955 A CN201910639955 A CN 201910639955A CN 110229131 B CN110229131 B CN 110229131B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture medium
fermentation
seed culture
extract
compounds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910639955.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110229131A (zh
Inventor
邓鹏飞
罗由萍
周学明
陈光英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hainan Normal University
Original Assignee
Hainan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hainan Normal University filed Critical Hainan Normal University
Priority to CN201910639955.4A priority Critical patent/CN110229131B/zh
Publication of CN110229131A publication Critical patent/CN110229131A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110229131B publication Critical patent/CN110229131B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用，所述苯并吡喃酮衍生物具有化合物1‑4所示的结构：

Description

角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于红树林植物来源真菌次级代谢产物领域，具体涉及角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
红树药用植物角果木(Ceriops tagal)具有一定的药用价值，中国民间将角果木的树皮捣碎后用于止血、通便、治疗恶疮等。发明人先前对角果木真菌根部真菌Fusariumsp.JG13次级代谢产物的化学成分及生物活性做了较多研究。近期，发明人在角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides的四个结构新颖，且对A549细胞显示出一定的细胞毒活性。
发明内容
本发明提供一种角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述苯并吡喃酮衍生物具有化合物1-4所示的结构：
Figure BDA0002133328850000011
本发明的另一实施方案提供一种同时制备上述化合物1-4的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制种子培养基，将角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides接入种子培养基种子，28℃恒温培养3天得种子培养液；
(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入发酵培养基中，28℃恒温静置培养28-30天得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，其中发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并60:40和50:50梯度洗脱得到的馏分、浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝2:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3OH:H2O＝35:65，最终得到化合物1、2、3、4。
其中所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述种子培养基中含有葡萄糖1.5％–3.0％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。
本发明的另一实施方案提供上述化合物1-4或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述化合物1-4或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物先导化合物中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述化合物1-4或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物候选药物中的应用。
本发明提供一种药物组合物，其特征在于以上述化合物1-4或其药学上可接受的盐作为有效成分。
本发明提供的上述药物组合物，还可包含其他抗肿瘤药物；也可以包含药学上可接受的辅料(优选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。上述药物组合物的剂型可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。
本发明所述“角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides”是发明人采集自海口市东寨港红树林自然保护区红树植物角果木的根部，分离纯化后，经形态学及分子生物学鉴定该菌株为炭疽菌属；该真菌ITS区域的序列已提交至NCBI(GenBank accessionNo.MF508974)。本发明所述“角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides”已在发明人的先前研究论文“The Journal of Antibiotics,volume 72,pages513–517,(2019)，Threenew polyketides from a mangrove-derived fungus Colletotrichumgloeosporioides”中公开，并且一直保藏于申请人所在的热带药用资源化学教育部重点实验室(曾用名：热带药用植物化学教育部重点实验室)，公众可按照发明人上述研究论文中记载的方法获得本发明所述“角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides”，或者向申请人所在的热带药用资源化学教育部重点实验室购买获得，申请人承诺自本发明申请日起20年热带药用资源化学教育部重点实验室可向公众提供本发明所述的“角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides”。
附图说明
图1是化合物2-3的ECD图；
图2是化合物4的ECD图；
图3是化合物1-4的1H-1H COSY、HMBC相关图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides的菌种培养
配制种子培养基：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，粗海盐2.5g，水1.0L，平均分装于2个1000mL锥形瓶，120℃灭25分钟。
将角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides菌株接入配制好的种子培养基中，于28℃下恒温培养3天得种子培养液；
(2)角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides的发酵
配制发酵培养基：葡萄糖1.1kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g，水50L，平均分装于100个1000mL锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液(8mL/瓶)接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于28℃恒温静置培养30天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏(20.0g)；
(4)化合物1-4的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并60:40和50:50梯度洗脱得到的馏分、浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝2:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3OH:H2O＝35:65，最终得到化合物1(15mg)、2(9mg)、3(11mg)、4(6mg)。
Figure BDA0002133328850000041
化合物1-2的1H和13C-NMR(400/100MHz,acetone-d6)数据如下表。
Figure BDA0002133328850000042
化合物3-4的1H和13C-NMR(400/100MHz,CDCl3)数据如下表。
Figure BDA0002133328850000043
Figure BDA0002133328850000051
化合物1：UV(MeOH):225(0.58),254(0.38)nm.IR(KBr):νmax 3396,2928,1621,1461,1231,1024cm–1.HR-ESI-MS:223.0602,([M+H]+,C11H11O5 +,calc.223.0601).
化合物2：
Figure BDA0002133328850000052
UV(MeOH):206(1.65),251(1.82)nm.IR(KBr):νmax 3435,2925,1645,1085cm–1.ECD(c＝0.001,MeOH)λmax(Δε):206(+9),247(+23)nm.HR-ESI-MS:225.1122([M+H]+,C12H17O4 +；calc.225.1121).
化合物3：
Figure BDA0002133328850000053
UV(MeOH):210(0.77),251(0.78)nm.IR(KBr):νmax 3392,2925,1658,1032cm–1.ECD(c＝0.001,MeOH)λmax(Δε):207(+2),246(+9)nm.HR-ESI-MS:197.0806([M+H]+,C10H13O4 +；calc.197.0808).
化合物4：
Figure BDA0002133328850000054
UV(MeOH):214(1.32),271(1.19)nm.IR(KBr):νmax 3406,2930,1710,1658cm–1.ECD(c＝0.001,MeOH)λmax(Δε):214(-13.8),271(+6.2)nm.HR-ESI-MS:223.0964([M+H]+,C12H15O4 +；calc.223.0965).
实施例2
(1)角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides的菌种培养
配制种子培养基(10.0L)：葡萄糖1.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于16个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides接入配制好的种子培养基中，于28℃恒温培养3天得种子培养液；
(2)角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides的发酵
配制发酵培养基(100L)：葡萄糖1.6％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于200个1000mL锥形瓶，120℃灭30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于28℃静置培养28天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)化合物1-4的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并60:40和50:50梯度洗脱得到的馏分、浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝2:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3OH:H2O＝35:65，最终得到化合物1(27mg)、2(16mg)、3(23mg)、4(11mg)。
实施例3
(1)角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides的菌种培养
配制种子培养基(1.0L)：葡萄糖3.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于3个500mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides菌株接入配制好的种子培养基中，于28℃恒温培养3天得种子培养液；
(2)角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides的发酵
配制发酵培养基(10L)：葡萄糖3.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于20个1000mL锥形瓶，120℃灭25分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于28℃恒温静置培养29天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)化合物1-4的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并60:40和50:50梯度洗脱得到的馏分、浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝2:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3OH:H2O＝35:65，最终得到化合物1-4。
实施例4细胞毒活性测试
采用MTT方法(Mosmann,T.Rapid colorimetric assay for cellular growthand survival:application to proliferation and cytotoxicityassays.J.Immunol.Methods.1983,65,55-63)对肿瘤细胞A549进行细胞毒活性测试，Adriamycin(阿霉素)作为阳性对照药。结果表明，在测试浓度范围内(10-200μg/mL)化合物1-4对肿瘤细胞A549均显示出一定的细胞毒活性，其中化合物2的活性最强，其IC50为21.19μg/mL，化合物1、3-4的IC50>50μg/mL。

Claims (2)

1.一种同时制备化合物1-4的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制种子培养基，将角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides接入种子培养基中，28℃恒温培养3天得种子培养液；
(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入发酵培养基中，28℃恒温静置培养28-30天得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，其中发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，合并60:40和50:50梯度洗脱得到的馏分、浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝2:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3OH:H2O＝35:65，最终得到化合物1、2、3、4；
所述化合物1-4所示的结构：
Figure FDA0002645998860000011
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述种子培养基中含有葡萄糖1.5％–3.0％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。
CN201910639955.4A 2019-07-17 2019-07-17 角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用 Active CN110229131B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910639955.4A CN110229131B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910639955.4A CN110229131B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110229131A CN110229131A (zh) 2019-09-13
CN110229131B true CN110229131B (zh) 2020-10-27

Family

ID=67855607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910639955.4A Active CN110229131B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110229131B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113717866B (zh) * 2021-09-27 2023-03-31 海南师范大学 一种海桑果内生真菌及其在制备抗肿瘤活性化合物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108640897A (zh) * 2018-04-27 2018-10-12 海南师范大学 一种红树内生真菌中聚酮类化合物及其制备方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108640897A (zh) * 2018-04-27 2018-10-12 海南师范大学 一种红树内生真菌中聚酮类化合物及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Four New Chromone Derivatives from Colletotrichum gloeosporioides;You-Ping Luo等;《Chem. Biodiversity》;20200109;第17卷;第e1900547页 *
Spiciferone analogs from an endophytic fungus Phoma betae collected from desert plants in West China;Xiang-Mei Tan等;《The Journal of Antibiotics》;20180314;第71卷;第614页图1 *
Three new polyketides from a mangrove-derived fungus Colletotrichum gloeosporioides;You-Ping Luo等;《The Journal of Antibiotics》;20190401;第72卷;第513-517页 *
一株药用红树尖瓣海莲内生真菌活性次级代谢产物研究;周学明;《海南师范大学硕士学位论文》;20190515;第62页，第75页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110229131A (zh) 2019-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110229127B (zh) 一种红树内生真菌来源的丁内酯类化合物及其制备方法与应用
CN110257255B (zh) 红树尖瓣海莲内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用
CN113717866B (zh) 一种海桑果内生真菌及其在制备抗肿瘤活性化合物中的应用
CN110229131B (zh) 角果木内生真菌来源的苯并吡喃酮衍生物及其制备方法与应用
CN110218200B (zh) 一种红树内生真菌中环缩肽化合物及其制备方法与应用
JP4852353B2 (ja) 新規な桂皮酸誘導体及びその製造方法並びにプロポリス発酵物
CN111671780A (zh) 具有神经细胞保护活性的透骨草木脂素制备方法及其应用
Li et al. Effects of oligosaccharide elicitors from endophyitc Fusarium oxysporum Dzf17 on diosgenin accumulation in Dioscorea zingiberensis seedling cultures
Mou et al. Enhancement of diosgenin production in plantlet and cell cultures of Dioscorea zingiberensis by Palmarumycin C13 from the endophytic fungus, Berkleasmium sp. Dzf12
CN102093187A (zh) 聚酮类化合物及其应用
CN111944702A (zh) 一种芳香丁烯酸内酯的制备方法及其应用
CN1158298C (zh) 抗肿瘤化合物及其制备方法和制药用途
CN105837590A (zh) 具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制备方法和应用
CN110698441A (zh) 一类2-甲基-4-(1-丙三醇)-呋喃类化合物及其制备方法和应用
CN105085221B (zh) 具有抗真菌和抗肿瘤活性的化合物及其制备方法与应用
CN108660169A (zh) 一种发酵制备棘孢菌素类抗生素的方法
CN103724177B (zh) 一种具有抗真菌活性的化合物及其制备方法与应用
CN113185393B (zh) 愈创木烷型倍半萜化合物、其制备方法以及其应用
CN114805276B (zh) 一种异色烯类化合物及其制备方法与应用
CN115181083B (zh) 化合物Cyophiobiolins A-B制备方法及其在制备抗炎药物中的应用
CN114874915B (zh) 一株产布雷菲德菌素a的毛黄堇内生真菌及其应用
CN108516923B (zh) 一系列烯萜类化合物及其制备方法和应用
CN108276363B (zh) 帚状曲霉次生代谢物及其在制备抗真菌药物中的应用
Li et al. Acyclic isoprenoids of Endophytic Aspergillus sp. Y-12 from Panax notoginseng
JPH0959275A (ja) 新規物質トリプロスタチン、その製造方法、細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant