CN110218200B - 一种红树内生真菌中环缩肽化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环缩肽化合物，其结构式如式(I)所示，该化合物可以从红树植物海桑叶子内生真菌Pseudopithomyces sp.的发酵产物分离纯化得到；体外试验表明，该环缩肽化合物对HELA人宫颈癌细胞株、A549人肺癌细胞株、SHSY5Y人骨髓神经母细胞瘤细胞株具有明显的细胞增殖抑制作用，以用来制备抗肿瘤药物，

Description

一种红树内生真菌中环缩肽化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物领域，更具体地，涉及一种红树内生真菌中环缩肽化合物及其制备方法与应用。

背景技术

恶性肿瘤是目前危害人类健康和生命的严重疾病之一。根据最新一期的全国癌症统计数据显示，平均每天超过一万人被确诊为癌症，每分钟有7人被确诊为癌症，肿瘤发病率为278.07/10万，中标率为190.63/10万，世标率为186.53/10万，0-74岁累积发病率为21.58％。目前的癌症治疗药物，大多为细胞毒性药物，在抑制肿瘤细胞增殖的同时，也能抑制机体正常细胞的增殖，从而产生一定的副作用。因此研究新的靶向性高、副作用小的抗肿瘤药物具有重大意义。

在合成的化学类抗肿瘤药物中绝大多数以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物，因此，通过研究天然产物中分离的化合物预防疾病的发生和发展，一直是药物治疗研究的一个重要领域，并受到世界各国科学界的普遍关注及研究。植物内生真菌是指寄生于宿主植物各组织内部，与宿主长久互利共生，但又不会使其表现出任何明显病害特征的一类真菌，同时还可以产生与植物本身生物活性相似的成分，且其易于扩大培养，生长周期较短，具有特殊的生存机制和代谢途径，常常会产生一些结构新颖的活性物质，故成为发掘新型药物的重要来源。

红树林生态系统分布于热带和亚热带，位于海洋、陆地和大气动态交界面，系统组成成分复杂，能量和物质循环运转速度高，生产力强，经长期的自然选择和进化适应，除了红树林植物藻类作为生产者和丰富的动物群落作为消费者外还形成了独特而丰富的微生物群。其中内生真菌与宿主红树植物共同进化，在长期的高温、高盐、频繁潮汐以及低氧条件的影响下，形成特殊的生存机制和代谢途径，产生一些结构新颖、活性显著的物质，包括促进植物生长、抗菌、抗氧化、抗肿瘤活性等，从而成为药物先导化合物的重要来源，极具研究价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种新型的环缩肽化合物。

本发明要解决的另一技术问题在于提供一种能生产上述环缩肽化合物的微生物。

本发明要解决的还一技术问题在于提供上述环缩肽化合物的制备方法。

本发明要解决的还一技术问题在于提供一种组合物，包括上述环缩肽化合物、其药物学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。

本发明要解决的还一技术问题在于提供上述环缩肽化合物或上述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种环缩肽化合物、其药物学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，所述环缩肽化合物结构式如式(I)所示：

提供一种能生产上述化合物的微生物，所述微生物为真菌Pseudopithomycessp.。

提供一种制备上述化合物的方法，将真菌Pseudopithomyces sp.接种于培养基中发酵、分离、提纯得上述化合物。

具体地，将真菌Pseudopithomyces sp.接种至马铃薯葡萄糖(PDA)琼脂平板上活化，25～30℃培养2～4d；后接入种子培养基中，25～30℃，90～120rpm培养3～5d，得到种子培养液，随后将种子培养液接种于发酵培养基中25～30℃静置扩大培养、发酵28～32d。

优选地，所述微生物接种至PDA平板上活化，28℃培养3d；后接入种子培养基中，28℃，120rpm培养4d，得到种子培养液，随后将种子培养液接种于发酵培养基中28℃静置扩大培养、发酵30d。

优选地，所述种子培养基优选PYG液体培养基。

优选地，所述发酵培养基优选PYG液体培养基。

进一步地，将扩大培养发酵完毕的液体培养基过滤得发酵液，浓缩后经乙酸乙酯萃取，减压浓缩得浸膏A；滤渣为菌丝体，风干后用甲醇反复浸泡回流提取，甲醇提取液减压浓缩后，经乙酸乙酯萃取得浸膏B；合并浸膏A与浸膏B，采用硅胶柱层析进行粗提，得到目标馏分；然后先后用硅胶柱层析和葡聚糖凝胶柱层析对所述目标馏分进行纯化。

更具体地，所述发酵液于50～60℃水浴中进行浓缩；所述发酵液浓缩后的乙酸乙酯萃取，在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯萃取至有机相无色；所述菌丝体用50～70℃甲醇反复浸泡回流提取1～3次，每次0.5～2h，直到菌丝体的浸泡液无色为止；所述菌丝体甲醇提取液浓缩后的萃取采用乙酸乙酯萃取至有机相无色。

更优选地，所述发酵液于55℃水浴中进行浓缩；

更优选地，所述发酵液浓缩后的乙酸乙酯萃取，在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯萃取至有机相无色；

更优选地，所述菌丝体用50～70℃甲醇反复浸泡回流提取1～3次，每次0.5～2h，直到菌丝体的回流液无色为止；

优选地，所述采用硅胶柱层析进行粗提时，用石油醚-乙酸乙酯和乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱；

更优选地，所述采用硅胶柱层析进行粗提时，优选洗脱剂依次用石油醚-乙酸乙酯(90：10，70：30，50：50，30：70，0：100)和乙酸乙酯-甲醇(50：50，0：100)梯度洗脱；

优选地，所述对目标馏分进行纯化时，先经硅胶柱层析，以5％甲醇/二氯甲烷为洗脱剂；再经葡聚糖凝胶柱层析，用甲醇洗脱。

更优选地，所述葡聚糖凝胶柱选用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱。

提供一种组合物，包括上述化合物、其药物学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。

进一步地，所述组合物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

提供上述化合物或上述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明首次公开了一种式(I)所示环缩肽化合物，并提供了所述环缩肽化合物的制备方法与应用。

2.本发明提供一种新的环缩肽化合物及其衍生物，属于活性肽类化合物，具有抗肿瘤活性，目前尚无该化合物及其细胞增殖抑制活性的报道。

3.本发明提供一种上述化合物的制备方法，由真菌Pseudopithomyces sp.发酵得到，该真菌易于扩大培养，生长周期较短，产物容易积累，是一类具有广阔发展前景的微生物资源。

附图说明

图1式(I)化合物的¹H-NMR谱图。

图2式(I)化合物的¹³C-NMR谱图。

图3式(I)化合物的DEPT谱图。

图4式(I)化合物的¹H-¹H COSY谱图。

图5式(I)化合物的HSQC谱图。

图6式(I)化合物的HMBC谱图。

图7式(I)化合物水解产物的正离子模式LC-MS谱图。

图8式(I)化合物水解产物的负离子模式LC-MS谱图。

图9式(I)化合物水解片段a的正离子模式LC-MS谱图。

图10式(I)化合物水解片段a的负离子模式LC-MS谱图。

图11式(I)化合物水解片段b的正离子模式LC-MS谱图。

图12式(I)化合物水解片段b的负离子模式LC-MS谱图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料

海桑(Sonneratia caseolaris)植物：于2015年10月采自广州南沙红树林国家自然保护区；

PDA培养基：按照每1L的去离子水中加入PDA粉末40.1g配制，加热搅拌至完全溶解，在121℃，0.1MPa条件下高压湿热灭菌30min；

PYG液体培养基：葡萄糖10g/L，海盐2g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏1g/L，在121℃，0.1MPa条件下高压湿热灭菌30min；

真菌Pseudopithomyces sp.的分离和ITS序列鉴定

本发明的真菌Pseudopithomyces sp.是2015年10月从广州南沙红树林国家自然保护区海桑叶子中分离得到，其ITS序列鉴定为：

tcctTCCGTAggggaACCTGCGGAAGGATCATTAACCTTTCAAAAAACAGGGTGCGTCGCGGCCCCCCTCCGGGGGCGGTTTGGGGTCCTCCCCTTCACGCGCGCACGACTGCATCCTTACTTTACGAGCACCTTCTGTTCTCCCTCGGCGGGGCAACCTGCCGTTGGAACCGAATAAACCCTTTTTTGCATCCAGCATTACCCGTTCCGAAACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTCAGCGCGCGGACTCGCCCCAAATCCATTGGCAGCGGTCCTTGCCTCCTCTCGCGCAGCACATTGCGCTTCTCGAGGGGCTCCGGCCCGCGTCCAACAAGAAAACATTACCGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAtaaacgGAGGAaac(SEQ ID NO.：1)，鉴定该菌株属于Pseudopithomyces属真菌，为已知菌株。实施例1式(I)环缩肽化合物的制备

按照以下步骤制备式(I)环缩肽化合物：

1、真菌Pseudopithomyces sp.的发酵

将Pseudopithomyces sp.的斜面保存管取出，置于室温0.5h，在超净台中将Pseudopithomyces sp.接至PDA平板上活化，置于28℃的培养箱内培养3d，然后将其接至6瓶已灭菌的含有250mL PYG液体培养基的500mL三角瓶中，放置于摇床上28℃，120rpm培养4d，做为种子培养液。配制PYG液体培养基于500mL的三角瓶中，每瓶含有250mL的PYG，向每瓶中加入适量种子液，共接种200L，放置于28℃静置培养30d结束发酵。

2、真菌Pseudopithomyces sp.次级代谢产物的提取与分离

将200L静置培养了一个月的真菌发酵液用四层纱布进行过滤并收集滤液，收集的发酵液在55℃水浴锅中进行浓缩。浓缩后的发酵液用等体积乙酸乙酯萃取至上层无颜色，有机相减压浓缩得干浸膏A 26.1g；收集的菌丝体自然风干后用甲醇60℃浸泡回流，重复3次回流提取，每次1h，直到菌丝体的浸泡液无色为止，用旋转蒸发仪减压浓缩甲醇提取液，浓缩后的浸膏加入适量水分散，然后用乙酸乙酯进行多次萃取，直到有机相无色，减压浓缩得到12.3g干浸膏B，合并两种提取物浸膏共38.4g。

采用硅胶柱进行粗分段，依次用石油醚-乙酸乙酯(90：10，70：30，50：50，30：70，0：100)和乙酸乙酯-甲醇(50：50，0：100)梯度洗脱，得到的馏分经薄层色谱法(TLC)检测合并后得到13个组分(M1-M13)。M-9先经硅胶柱层析用5％甲醇/二氯甲烷分离，再通过SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱纯化，以甲醇作为洗脱剂，得到式(I)化合物98mg。

实施例2式(I)环缩肽化合物的制备

按照以下步骤制备式(I)环缩肽化合物：

1、真菌Pseudopithomyces sp.发酵

将Pseudopithomyces sp.的斜面保存管取出，置于室温0.5h，在超净台中将Pseudopithomyces sp.接至PDA平板上活化，置于26℃的培养箱内培养4d，然后将其接至6瓶已灭菌的含有250mL PYG液体培养基的500mL三角瓶中，放置于摇床上26℃，100rpm培养5d，做为种子培养液。配制PYG液体培养基于500mL的三角瓶中，每瓶含有250mL的PYG，向每瓶中加入适量种子液，共接种200L，放置于28℃静置培养28d结束发酵。

2、真菌Pseudopithomyces sp.次级代谢产物的提取与分离

将200L静置培养了一个月的真菌发酵液用四层纱布进行过滤并收集滤液，收集的发酵液在55℃水浴锅中进行浓缩。浓缩后的发酵液用等体积乙酸乙酯萃取至上层无颜色，乙酸乙酯相减压浓缩得干浸膏A；收集的菌丝体自然风干后用甲醇60℃浸泡回流，重复3次回流提取，每次1h，直到菌丝体的浸泡液无色为止，用旋转蒸发仪减压浓缩甲醇提取液，浓缩后的浸膏加入适量水分散，然后用乙酸乙酯进行多次萃取，直到有机相无色，减压浓缩得到干浸膏B，合并两种提取物浸膏。采用硅胶柱进行粗分段，依次用石油醚-乙酸乙酯(90：10，70：30，50：50，30：70，0：100)和乙酸乙酯-甲醇(50：50，0：100)梯度洗脱，得到的馏分经TLC检测合并后得到13个组分(M1-M13)。M-9先经硅胶柱层析用5％甲醇/二氯甲烷分离，再通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱纯化，甲醇作为洗脱剂，得到式(I)化合物。

实施例3式(I)环缩肽化合物的制备

按照以下步骤制备式(I)环缩肽化合物：

1、真菌Pseudopithomyces sp.发酵

将Pseudopithomyces sp.的斜面保存管取出，置于室温0.5h，在超净台中将Pseudopithomyces sp.接至PDA平板上活化，置于30℃的培养箱内培养2d，然后将其接至6瓶已灭菌的含有250mL PYG液体培养基的500mL三角瓶中，放置于摇床上28℃，90rpm培养3d，做为种子培养液。配制PYG液体培养基于500mL的三角瓶中，每瓶含有250mL的PYG，向每瓶中加入适量种子液，共接种200L，放置于28℃静置培养32d结束发酵。

2、真菌Pseudopithomyces sp.次级代谢产物的提取与分离

将200L静置培养了一个月的真菌发酵液用四层纱布进行过滤并收集滤液，收集的发酵液在55℃水浴锅中进行浓缩。浓缩后的发酵液用等体积乙酸乙酯萃取至上层无颜色，乙酸乙酯相减压浓缩得干浸膏A；收集的菌丝体自然风干后用甲醇60℃浸泡回流，重复3次回流提取，每次1h，直到菌丝体的浸泡液无色为止，用旋转蒸发仪减压浓缩甲醇提取液，浓缩后的浸膏加入适量水分散，然后用乙酸乙酯进行多次萃取，直到有机相无色，减压浓缩得到干浸膏B，合并两种提取物浸膏。采用硅胶柱进行粗分段，依次用石油醚-乙酸乙酯(90：10，70：30，50：50，30：70，0：100)和乙酸乙酯-甲醇(50：50，0：100)梯度洗脱，得到的馏分经TLC检测合并后得到13个组分(M1-M13)。M-9先经硅胶柱层析用5％甲醇/二氯甲烷分离，再通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱纯化，甲醇作为洗脱剂，得到式(I)化合物。

实施例4式(I)环缩肽化合物结构解析

式(I)化合物为白色固体，易溶于甲醇，在254nm处有紫外吸收，碘熏显黄色，UV(MeOH)λ_max(logε)216(3.78)nm；高分辨质谱(HRESI-MS)m/z：482.32259[M+H]⁺，504.30466[M+Na]⁺，确定新化合物的分子式为C₂₅H₄₃N₃O₆，分子量为481，不饱和度为6。通过1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及HRESI-MS对化合物结构进行鉴定，式(I)化合物的¹H-NMR、¹³C-NMR数据如表1所示，¹H-¹H COSY、HMBC和HSQC核磁数据分别见附图4、5、6。

表1.式(I)化合物的¹H-NMR、¹³C-NMR数据(500和125MHz，in CD₃OD)

为了进一步确定其结构，将式(I)化合物进行酸水解，得到四个水解片段，然后通过LC-MS对其水解片段进行分析。

附图7为化合物水解产物的正离子模式LC谱图；附图8为化合物水解产物的负离子模式LC谱图。

附图9为化合物水解片段a的正离子模式LC-MS谱图，RT＝0.78min时，有一个分子量106.05的峰，为[M+H]⁺峰；附图10为化合物水解片段a的负离子模式LC-MS谱图，RT＝0.79min时，有一个分子量104.04的峰，为[M-H]^-峰；故片段a对应化学结构为式(III)，分子量为105。

附图11为化合物水解片段b的正离子模式LC-MS谱图，RT＝8.83min时，有一个分子量295.22的峰，为[M+Na]⁺峰；附图12为化合物水解片段b的负离子模式LC-MS谱图，RT＝8.84min时，有一个分子量271.23的峰，为[M-H]^-峰，故片段b对应化学结构为式(IV)，分子量为272。

水解后的LC-MS谱图显示主要为分子量105的式(III)和分子量272的式(IV)的峰；片段c即分子量116的式(V)因其极性太大，在柱子中无保留；片段d即分子量60的式(VI)有挥发性，因此分子量116与分子量60的LC-MS没有出峰。进一步确定化合物的结构如式(I)。

实施例5抗肿瘤实验

实验材料

细胞株：人宫颈癌细胞株HELA、人肺癌细胞株A549、人骨髓神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y，密封保存于液氮容器中；

DMEM培养基(美国Gibco公司)：含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素；

1640培养基(美国Gibco公司)：含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。

试验方法

细胞的培养：A549细胞、SHSY5Y细胞以DMEM培养基，HELA细胞以1640培养基，分别在5％CO₂、37℃、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，用倒置显微镜观察培养状态，每2～3天更换一次培养基，当细胞融合度达到80％时传代，取生长状态良好的对数生长期细胞进行实验。

化合物对癌细胞的抑制实验：以改良MTT法测定受试样品对人肿瘤细胞株增殖的影响。取处于对数生长期的人肿瘤细胞株，调整细胞悬浮液浓度为5×104个/mL，加入96孔培养板中，100μL/孔，细胞培养24h待细胞贴壁后移弃培养基，每孔分别加入由培养基配制的终浓度为1mM、100μM、10μM受试样品100μL，每个浓度设6个平行孔。

设置空白组：不加细胞及药液；

对照组：无药处理的细胞悬浮液；

阳性对照组：5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-FU对多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌(局部涂抹)、外阴白斑(局部涂抹)等均有一定疗效。

给药组：实施例1制备得到的化合物。

加药后细胞在37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h，移弃药液然后加入10％MTT(5mg/mL)，100μL/孔，继续培养4h后加入DMSO 100μL/孔，用酶标仪在490nm波长下测定各孔的OD值，根据OD值进行结果计算。

数据处理：细胞存活率(％)＝[(A1-A0)/(A2-A0)]×100％，其中A0为空白对照组的吸光度值，A1为给药组的吸光度值，A2为对照组的吸光度值。

实验结果如表2所示：

表2.式(I)化合物对肿瘤细胞的抑制作用

药理实验结果如表2所示，结果表明式(I)有明显的细胞毒活性，能够明显抑制肿瘤细胞增殖，可以用来制备抗肿瘤药物。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东药科大学

<120> 一种环缩肽化合物及其制备方法与应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 601

<212> DNA

<213> ITS序列

<400> 1

tccttccgta ggggaacctg cggaaggatc attaaccttt caaaaaacag ggtgcgtcgc 60

ggcccccctc cgggggcggt ttggggtcct ccccttcacg cgcgcacgac tgcatcctta 120

ctttacgagc accttctgtt ctccctcggc ggggcaacct gccgttggaa ccgaataaac 180

ccttttttgc atccagcatt acccgttccg aaacaaacaa tcgttacaac tttcaacaat 240

ggatctcttg gctctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt agtgtgaatt 300

gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgccccttgg tattccgggg 360

ggcatgcctg ttcgagcgtc atctacaccc tcaagctctg cttggtgttg ggcgtctgtc 420

ccgcctcagc gcgcggactc gccccaaatc cattggcagc ggtccttgcc tcctctcgcg 480

cagcacattg cgcttctcga ggggctccgg cccgcgtcca acaagaaaac attaccgtct 540

ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa acggaggaaa 600

c 601

Claims (7)

1.一种环缩肽化合物或其药物学上可接受的盐，所述环缩肽化合物结构式如式(I)所示：

式(I)。

2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，将真菌Pseudopithomyces sp.接种于培养基中发酵、分离、提纯得权利要求1所述化合物；具体的，将真菌Pseudopithomyces sp.接种至马铃薯葡萄糖琼脂平板上活化，25～30℃培养2～4d；后接入种子培养基中，25～30℃，90～120rpm培养3～5d，得到种子培养液，随后将种子培养液接种于发酵培养基中25～30℃静置扩大培养、发酵28～32d；

将扩大培养发酵完毕的液体培养基过滤得发酵液，浓缩后经乙酸乙酯萃取，减压浓缩得浸膏A；滤渣为菌丝体，风干后用甲醇反复浸泡回流提取，提取液减压浓缩后，经乙酸乙酯萃取得浸膏B；合并浸膏A与浸膏B，采用硅胶柱层析进行粗提，得到目标馏分；然后先后用硅胶柱层析和葡聚糖凝胶柱层析对所述目标馏分进行纯化；

所述发酵液于50～60℃水浴中进行浓缩；所述发酵液浓缩后的乙酸乙酯萃取，在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯萃取至有机相无色；所述菌丝体用50～70℃甲醇反复浸泡回流提取1～3次，每次0.5～2h，直到菌丝体的浸泡液无色为止；所述用甲醇反复浸泡回流提取的提取液浓缩后经乙酸乙酯萃取至有机相无色；

所述采用硅胶柱层析进行粗提时，选用石油醚-乙酸乙酯和乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱；对所述目标馏分进行纯化时，先经硅胶柱层析，洗脱剂选用5%甲醇/二氯甲烷；再经葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基与发酵培养基为PYG液体培养基。

4.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述化合物或其药物学上可接受的盐。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

7.权利要求1所述化合物或权利要求4~6中任一所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为宫颈癌、肺癌、骨髓神经母细胞瘤。

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