CN108017528B - 一种萘类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型萘类化合物及其制备方法和应用。所述新型萘类化合物分子式为C18H18O3,该化合物命名为naphthalde A。其制备方法是以福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632 的大米固体发酵产物为原料,经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱等步骤分离得到。经微量肉汤稀释法测定naphthalde A对金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300的活性,MIC50分别达到8μg/ml和16μg/ml。本发明化合物结构简单,活性好,可作为抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的先导化合物,有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物次生代谢产物技术领域,具体涉及一种萘类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
伴随着抗生素的长期不规范的使用,耐药细菌已成为全球性的问题;其中最严重的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),MRSA感染在医院内日趋流行;Klevens 等报道2005年来预计每年美国有超过9万人感染这种致命的超级病菌,其中有近1.9万人死亡,这个数据比2001年美国疾病控制与预防中心(CDC)的报道增加了2倍。MRSA治疗难度大,病死率高,已与乙型肝炎、艾滋病并列为世界三大感染性疾病,成为全球性公共卫生问题之一。我国是世界上滥用抗生素情况最严重的国家之一, 1978年,医务人员在上海抽检了200株金黄色葡萄球菌,分离出的MRSA还不到5%。2009年对住院病人的抽样调查显示对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)超过60%,同比2000年增长了40%。中国医科大学微生物学院的朱宝丽及其同事曾对中国、丹麦、西班牙人肠道菌群的DNA进行测序,研究显示:中国人肠道菌群具有更多的耐药基因。因此一些专家认为,一旦真正意义上的“超级细菌”爆发,中国将有可能成为“超级细菌”的重灾区。因此研发能有效控制耐药细菌感染的新策略和新药物,成为抗菌素研究的热点。
近年来,研究的重点重新转向了从微生物中寻找具有不同抗菌机理的新骨架次生代谢产物,而植物内生真菌代谢产物是该领域最引人注目的热点,其中最常产生抗菌活性化合物的类群为拟茎点霉属(Phomopsis)、茎点霉属(Phoma)和镰刀菌属(Fusarium)。拟茎点霉属是半知菌亚门、腔孢纲真菌中的一个大属,该类菌株可产生丰富的次生代谢产物,Weber等从鸡冠刺桐分离出的Phomopsissp.中获得的一个新的抗菌活性内酯类化合物phomol,该化合物对 24种细菌和真菌进行生物学试验都显示出很好的抗菌活性。Horn 等从细柱柳中分离出Phomopsis sp.菌株,分离到的细胞松弛素类生物碱 phomopsichalasin可抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、藤黄球菌、大肠杆菌。
本发明从一株拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)发酵产物中分离得到一个新的萘类化合物naphthalde A,该化合物具有显著的抗MRSA活性。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种naphthalde A;第二目在于提供所用专利菌株的发酵方法;第三目的在于提供所述naphthalde A的制备方法;第四目的在于提供所述naphthalde A在制备抗革兰氏阳性菌药物中的应用,特别是抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的,所述萘类化合物是从拟茎点霉菌分离得到,命名为naphthalde A,其分子式为C18H18O3 具有下述结构:
本发明的第二目的是这样实现的,本发明提供的发酵的微生物是一株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株,保藏号为CCTCC M 2017632。保藏日期为2017年10月23日。
本发明所述的福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632的分子鉴定特征为:测序结果在GenBank中进行同源性比对,提取相似度98%以上的序列,利用MEGA6.0软件,以领域连接法构建系统发育树,菌株与葡萄拟茎点霉(Phomopsis viticola)相似度为97.2%,鉴定为福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株。利用所述福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632进行发酵包括以下步骤:
(1)将福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632置于斜面固体培养基中保存备用,斜面固体培养基为:马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH值6.5,121℃,25min灭菌,冷却至60℃倒斜面备用;
(2)将保存备用的福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632转接到液体种子培养基中,摇床上28℃培养24 h,转速为180r/min,得拟茎点霉菌种子液;所述的液体种子培养基为:NaNO3 2g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4 .7H2O 0.5g/L,KCL 0.5g/L,FeSO4.7H2O 0.01g/L,葡萄糖20g/L, pH值6.5,装入250mL锥形瓶,100mL/瓶,121℃,25min灭菌备用;
(3)取步骤(2)所得拟茎点霉菌种子液,按培养基质量比2%接入大米固体培养基中进行固体发酵,发酵条件为:25-32℃,发酵30-60天,所述的大米培养基为:大米100g,珍珠岩20g,蒸馏水100ml,装入600mL组培瓶,121℃,25min灭菌备用。
本发明的第三目的是这样实现的,所述的naphthalde A制备方法包括发酵产物处理、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离等步骤,具体为:
(1)有机溶剂萃取:以60~80%的乙醇为溶剂,超声提取2~4次,每次4~8h,将提取液合并、过滤,减压浓缩成浸膏;
(2)硅胶柱层析:将浸膏用重量比1.5~3倍量的纯甲醇溶解,用浸膏重量1~3倍的200-300目硅胶拌样后上硅胶柱,以体积配比为1:0~0:1的氯仿-甲醇溶液梯度洗涤,分别收集各部分的洗脱液并浓缩,用TLC监测合并相同的部分;
(3)高压液相色谱分离:取步骤(2)7:3部分的洗脱液,以40~50%的甲醇为流动相,以规格为20mm×250mm、5μm的C18制备柱为固定相,流速为20ml/min,紫外检测器检测波长为238nm,每次进样200μL,收集洗脱液,多次累加后蒸干,得到本发明为所述的naphthalde A。
以上述方法制备的naphthalde A的结构是通过以下方法测定出来的:
本发明化合物为红色胶状物;紫外光谱(溶剂为甲醇),λ max nm (logε):346,238,205 nm;红外光谱(溴化钾压片)ν max: 1695,1680,1585,1530,1422cm-1;HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 305.1147 [M+Na]+(计算值为305.1147),结合1H 和 13C NMR谱(图1和图2,数据归属见表-1)给出其分子式C18H18O3。
化合物的1H 和 13C NMR谱显示化合物中有18个碳信号和18个氢信号,包括1,2,5,7-4元取代的萘环信号[C-1(d C 125.7 s),C-2(d C 149.1 s),C-3(d C 124.1 d),C-4(d C128.0 d),C-5(d C 155.3 s),C-6(d C 108.5 d),C-7(d C 138.4 s),C-8(d C 116.3 d),C-9(d C131.3 s),C-10(d C 123.9 s); H-3(d H 7.55 d,J=8.2), H-4(8.39 d,J=8.2),H-6(6.89 d,J=1.6),H-8(8.50 d,J=1.6)],一个甲醛取代信号(δ C 191.1 d; δ H 9.98 s),一个甲氧基信号(δ C 56.4 q; δ H 3.81),一个甲基信号(δ C 20.8; δ H 2.08),一个3-甲基-2-氧代-3-烯基(C-3'~C-7'; H2-3', H2-6', and H3-7')。红外光谱显示有羰基(1695 ,1680 cm-1)和苯基(1585,1530,1422 cm-1)的吸收峰。紫外光谱在346, 238和205 nm有吸收显示有扩展的生色团和芳香环的存在。HMBC谱中H-3(d H 7.55 d,J=8.2) 与C-1(d C 125.7 s)/ C-2(d C 149.1s)/C-4(d C 128.0 d)/C-10(d C 123.9 s),H-4(8.39 d,J=8.2)和C-2(d C 149.1 s)/C-3(d C124.1 d)/C-6(d C 108.5 d)/C-7(d C 138.4 s)/C-8(d C 116.3 d)/C-10(d C 123.9 s), H-6(6.89 d,J=1.6)和C-5(d C 155.3 s)/C-7(d C 138.4 s)/C-8(d C 116.3 d)/C-10(d C 123.9s), H-8(8.50 d,J=1.6)和C-1(d C 125.7 s)/C-6(d C 108.5 d)/C-7(d C 138.4 s)/C-9(d C131.3 s)/C-10(d C 123.9 s)相关,证实了化合物中4元取代的萘环的结构。H-1′ (δ H 9.98)和C-1 (δ C 125.7)/C-2 (δ C 149.1)/ C-9 (δ C 131.3)相关,证实甲醛基连接在C-1位,H3-2′ (δ H 2.49) 和 C-1 (δ C 125.7)/C-2 (δ C 149.1)/C-3 (δ C 124.1),H-3 (δ H 7.55) 和C-2′ (δ C 20.8)相关,证实甲基连接在C-2位,(δ H 3.81) 和 C-5 (δ C 155.3)相关,证实甲氧基连接在C-5位,H2-3′ (δ H 4.51) 和 C-6 (δ C 108.5)/C-7 (δ C 138.4)/ C-8 (δ C116.3),H-6 (δ H 6.89) 和 C-3′ (δ C 43.7),H-8 (δ H 8.50) 和 C-3′ (δ C 43.7)相关,证实3-甲基-2-氧代-3-烯基连接在C-7位。因此化合物的结构得以确认。
表-1. 化合物的1H NMR 和 13C NMR 数据 (溶剂为C5D5N)
本发明的第四目标是这样实现的,所述naphthalde A在制备抗革兰氏阳性菌药物中的应用,特别是抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。
本发明的naphthalde A是首次被分离出来,通过核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱数据确定其分子式及结构。以微量肉汤稀释法测试其抗金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300和活性,naphthalde A能抗ATCC25923金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923的MIC为8μg/ml,抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300MIC为16μg/ml,说明该化合物有较好的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性,可作为抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的先导化合物。
附图说明
图1为本发明化合物的核磁共振氢谱(1H NMR)图;
图2为本发明化合物的核磁共振碳谱(13C NMR)图;
图3为本发明化合物的HMBC相关图;
图4为本发明化合物naphthalde A的化学结构。
保藏生物材料的说明
本发明的菌株,已于2017年10月23日,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),该中心地址:中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,该菌株分类命名为:福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株,保藏编号CCTCC M 2017632。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换或改进,均落入本发明的保护范围。
本发明所述的naphthalde A是从福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCCM 2017633发酵产物中分离得到的,其分子式为C18H18O3,
该化合物命名为:naphthalde A (5-Methoxy-2-methyl- 7-(3-methyl-2-oxobut-3-enyl) -1-naphthaldehyde)。本发明所述萘类化合物naphthalde A的制备方法包括福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632固体发酵、超声提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离,具体为:
(1)将福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632置于斜面固体培养基中保存备用,将保存备用菌种转接到液体种子培养基中,摇床上28℃培养24 h,转速为180r/min,得拟茎点霉菌种子液;取拟茎点霉菌种子液,按培养基质量比2~5%接入大米固体培养基中,25~35℃,发酵30~60天,得到发酵产物。
(2)超声提取:以60~80%的乙醇为溶剂,超声提取2~4次,每次4~8h,将提取液合并、过滤,减压浓缩成浸膏;
(3)硅胶柱层析:将浸膏用重量比1.5~3倍量的纯甲醇溶解,用浸膏重量1~3倍的80-160目硅胶拌样后上硅胶柱,以体积配比为1:0、 20:1、9:1、 8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇溶液梯度洗涤,分别收集各部分的洗脱液并浓缩,用TLC监测合并相同的部分;
(4)高压液相色谱分离:取体积配比7:3的甲醇-水洗脱液,以40~50%的甲醇为流动相,以规格为20mm×250mm、5μm的C18制备柱为固定相,流速为20ml/min,紫外检测器检测波长为238nm,每次进样200μL,收集洗脱液,多次累加后蒸干,得到本发明为所述的naphthalde A。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下通过实施例及试验数据,对本发明作进一步的详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不是对本发明技术方案的限定。
实施例1
(1)将保藏于斜面固体培养基中福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCCM 2017632接种于斜面固体培养基的平板中活化,验纯后接种于斜面固体培养基中保存备用。所述斜面固体培养基为:马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH值6.5,121℃,25min灭菌,冷却至60℃倒平板和斜面备用;
(2)将保存备用的福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632转接到液体种子培养基中,摇床上28℃培养24 h,转速为180r/min,得拟茎点霉菌种子液。所述的液体种子培养基为:NaNO3 2g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,KCL 0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,葡萄糖20g/L, pH值6.5,装入250mL锥形瓶,100mL/瓶,121℃,25min灭菌备用;
(3)取步骤(2)所得拟茎点霉菌种子液,按培养基质量比2%接入大米固体培养基中进行固体发酵,发酵温度为25°C,45天发酵完成。所述的大米培养基为:大米100g,珍珠岩20g,蒸馏水100ml,装入600mL组培瓶,121℃,25min灭菌备用。
实施例2
重复实施例1,有以下不同点:
(3)发酵温度为28°C,40天发酵完成。
实施例3
(3) 发酵温度为30°C,30天发酵完成。
实施例4
(3) 拟茎点霉菌种子液按培养基质量比5%接入大米固体培养基中进行固体发酵,发酵温度为28°C,35天发酵完成。
实施例5
(1)取福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632发酵产物10kg,用80%的乙醇超声提取3次,每次4h,提取液合并、过滤,减压浓缩成浸膏A1220g;在浸膏A加入等体积的乙酸乙酯萃取5次,合并萃取相,减压浓缩成153g浸膏B。
(2)浸膏B用甲醇溶解后,用80目的硅胶200g拌样,然后用160目硅胶柱1500g装柱进行层析分离,采用体积配比为20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的氯仿-甲醇溶液梯度洗涤,分别收集各部分的洗脱液并浓缩,用TLC监测合并相同的部分。
(3)取(2)中氯仿-甲醇7:3洗脱浓缩部分11.3g用高效液相色谱进一步分离,以44%的甲醇流动相,C18制备色谱柱(20×250mm,20mL/min)半制备柱为固定相,紫外检测波长为254nm,收集16.3min的色谱峰,多次累加后蒸干,即可得所述的新型naphthalde A。
实施例6
重复实施例5,有以下不同点:
(1)用70%的乙醇超声提取3次,每次5h;减压浓缩的浸膏A为1180g;减压浓缩的浸膏B 146g。
(2)浸膏B用160目的硅胶200g拌样。
(3)氯仿-甲醇7:3洗脱部分为10.6g,以45%的甲醇为流动相进行高效液相色谱分离,收集15.5min的色谱峰。
实施例7
重复实施例5,有以下不同点:
(1)用75%的乙醇超声提取3次;减压浓缩的浸膏A为1310g;减压浓缩的浸膏B 为163g。
(3)氯仿-甲醇7:3洗脱部分为11.3g,以50%的甲醇为流动相,收集11.3min的色谱峰。
实施例8
重复实施例5,有以下不同点:
(2)浸膏B用100目的硅胶200g拌样。
(3)氯仿-甲醇7:3洗脱部分为11.6g,以45%的甲醇为流动相进行高效液相色谱分离,收集15.5min的色谱峰。
实施例9
应用微量肉汤稀释法测定naphthalde A的MIC(ug/mL)值。
(1)抗菌药物和培养基制备:将待测萘类化合物溶于DMSO,配制成浓度(2560μg/ml)母液,过滤除菌备用。配制好的MH肉汤培养基121℃灭菌30min备用。
(2)培养24h的MRSA菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释,得到约含菌1×106CFU/mL的菌液备用。
(3)稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管(13×100mm)13支,除第1管加入1.6mlMH肉汤外,其余每管加入MH肉汤1ml,在第1管加入抗菌药物原液(如1280μg/ml)0.4ml混匀,然后吸取1ml至第2管,混匀后再吸取1ml至第3管,如此连续倍比稀释至第11管,并从第11管中吸取1ml弃去,第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml,第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml,将稀释管中的培养物转入96孔板,每个样品做三个平行,DMSO为溶剂对照,万古霉素为阳性对照。
(4)孵育 将接种好的96孔板置37℃恒温培养箱中孵育24h。
(5)结果判断:以小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC,同时溶剂对照内细菌无明显抑制。
微量肉汤稀释法中使用的菌株包括金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300。结果表明naphthalde A能抑制ATCC25923和ATCC43300,金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923的MIC为8μg/ml,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300MIC为16μg/ml,可作为研制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物的先导化合物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和变化等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种萘类化合物的制备方法,其具有下式所示结构:
命名为 naphthalde A;所述的制备方法是以福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)发酵产物为原料,经有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤得到;所述福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)为福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M2017632;
A、福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632的发酵方法包括斜面、种子液制备和固体放大发酵,具体步骤为:
(1)斜面固体培养基为:马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH值6.5,121℃,25min灭菌,冷却至60℃倒斜面备用;将拟福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCCM 2017632置于斜面固体培养基中保存备用;
(2)液体种子培养基为:NaNO3 2g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,KCL 0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,葡萄糖20g/L,pH值6.5,装入250mL锥形瓶,100mL/瓶,121℃,25min灭菌备用;将保存备用的福士拟茎点霉(Phomopsis fukushii)菌株CCTCC M 2017632斜面转接到液体种子培养基中,摇床上28℃培养24h,转速为180r/min,得拟茎点霉菌种子液;
(3)大米固体培养基为:大米100g,珍珠岩20g,蒸馏水100ml,装入600mL组培瓶,121℃,25min灭菌备用;取步骤(2)所得拟茎点霉菌种子液,按培养基质量比2%接入大米固体培养基中进行固体发酵,发酵条件为:25~32℃,发酵30~60天,得到发酵产物;
B、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤具体为:
(1)有机溶剂萃取:以60~80%的乙醇为溶剂,超声提取2~4次,每次4~8h,将提取液合并、过滤,减压浓缩成浸膏;
(2)硅胶柱层析:将浸膏用重量比1.5~3倍量的纯甲醇溶解,用浸膏重量1~3倍的200-300目硅胶拌样后上硅胶柱,以体积配比为1:0~0:1的氯仿-甲醇溶液梯度洗涤,分别收集各部分的洗脱液并浓缩,用TLC监测合并相同的部分;
(3)高压液相色谱分离:取体积配比7:3的氯仿-甲醇溶液洗脱液,以40~50%的甲醇为流动相,以规格为20mm×250mm、5μm的C18制备柱为固定相,流速为20ml/min,紫外检测器检测波长为238nm,每次进样50~200μL,收集10~20min的色谱峰,多次累加后蒸干,得到naphthalde A。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述步骤B、(2)中所述氯仿-甲醇溶液的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。
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