CN108003000B - 一种二苯醚类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二苯醚类化合物及其制备方法和应用。所述的二苯醚类化合物是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C₁₈H₂₀O₄，结构式为：

该化合物命名为：diphentherA；所述福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株，菌株保藏编号为CCTCC M 2017632，保藏日期为2017年10月23日。所述的制备方法是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤。所述的应用为所述的二苯醚类化合物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。本发明化合物结构新颖，化合物活性好，有较好的应用前景。

Description

一种二苯醚类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种二苯醚类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

1978年，医务人员在上海抽检了200株金黄色葡萄球菌，分离出的甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)还不到5%。2009年对住院病人的抽样调查显示对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）超过60%，同比2000年增长了40%。中国医科大学微生物学院的朱宝丽及其同事曾对中国、丹麦、西班牙人肠道菌群的DNA进行测序，研究显示：中国人肠道菌群具有更多的耐药基因。因此研发能有效控制耐药细菌感染的新策略和新药物，成为抗菌素研究的热点。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种二苯醚类化合物；第二目的在于提供所述的二苯醚类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的二苯醚类化合物的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的二苯醚类化合物是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C₁₈H₂₀O₄，结构式为：

该化合物命名为：diphentherA；

所述福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株，菌株保藏编号为CCTCC M2017632，保藏日期为2017年10月23日。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、固体发酵：将菌株福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，接种到含10~100ml液体种子培养基的50~500ml的三角瓶中，于28℃下在转速180rpm旋转震荡的条件下震荡培养5~10天得到含菌营养基，将其接种到大米固体培养基中培养得到发酵产物；

B、浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3倍的有机溶剂超声提取2~4次，每次4~8h，合并提取液，过滤，减压浓缩至1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏；

C、氯仿-丙酮硅胶柱层析：浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的氯仿-丙酮混合溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

D、石油醚-乙酸乙酯硅胶柱层析：将C步骤中8:2配比的氯仿-丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液重量6~8倍，用体积比为1:0~0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

E、高压液相色谱分离纯化：将D步骤中7:3配比的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经硅胶柱色谱和制备高效液相色谱分离纯化即得目标物二苯醚类化合物，即diphentherA。

本发明的二苯醚类化合物的结构通过以下方法测定：

本发明化合物为红色胶状物；紫外光谱（溶剂为甲醇），λ _max nm (logε)：284(3.62), 206 (4.68)；红外光谱（溴化钾压片）ν _max: 2935, 2836, 1684, 1612, 1455,1331, 1156, 1060, 855cm^-1；HRESIMS显示本发明化合物加钠的分子离子峰m/z 323.1262[M+Na]⁺（C₁₈H₂₀NaO₄计算值为323.1259），结合¹H 和¹³C NMR谱（图2和图3，数据归属见表1）给出其分子式C₁₈H₂₀O₄。

化合物的¹H NMR谱显示化合物中有20个氢信号，包括两个甲基质子信号 [H₃-7（d _H 2.33 s），H₃-7′（d _H2.25 s）]，五个芳基质子信号[H-2（d _H 6.44 s）， H-4（d _H 6.51 s），H-6（d _H 6.47 s），H-2' （d _H 6. 38 d J=2.2），H-6'（d _H 6.32 d J=2.2]，两个甲氧基信号[OMe-3（d _H 3.80 s)，OMe-3′（d _H 3.85 s) ]，一个乙酰基质子信号H₃-9'（d _H 2.59 s）。化合物的¹³C NMR谱显示化合物中有18个碳信号，包括两个甲基碳信号[C-7（d_C 21.6 q）， C-7＇（d_C 23.6 q）]，两个甲氧基碳信号[3-OMe（d_C 56.0 q）， 3＇-OMe（d_C 56.3 q）]，乙酰基碳信号[C-8＇（d_C 198.5 s）， C-9＇（d_C 29.6 q）]，五个sp²杂化的芳基次甲基碳信号[C-2（d_C103.8 d）， C-4（d_C 109.5 d），C-6（d_C 111.8 d），C-2＇（d_C 100.2 d）， C-6＇（d_C 113.6 d）]，七个sp²杂化的芳基季碳信号[C-1（d_C 155.3 s），C-3（d_C 160.9 s）， C-5（d_C 140.4 s）， C-1＇（d_C 162.7 s）， C-3＇（d_C 164.3 s）， C-4＇（d_C 110.6 s），C-5＇（d_C 142.4 s）]，其中四个碳连氧。综合¹H NMR谱和¹³C NMR谱数据，说明该化合物有两个苯环存在。两个苯环中有四个连氧的季碳，除了两个甲氧基取代以外，应有一个氧原子连接两个苯环形成醚键，该化合物为二苯醚的衍生物。苯环上有两个甲基、两个甲氧基、一个乙酰基取代。红外光谱显示有羰基（1684 cm^-1）和苯基（1612, 1455, 1331cm^-1）的吸收峰。HMBC谱中H-9′(δ _H 2.59) 和 C-4′(δ _C 110.6)相关，证实乙酰基连接在C-4′位，甲氧基质子OMe(δ _H 3.80) 和 C-3 (δ _C160.9)，甲氧基质子OMe(δ _H 3.85) 和 C-3′ (δ _C 164.3)相关，证实两个甲氧基分别连接在C-3和C-3′位，两个甲基质子H₃-7 (δ _H 2.33 )和C-4 (δ _C 109.5)/C-5 (δ _C 140.4)/ C-6 (δ _C111.8)相关，H₃-7′ (δ _H 2.25)和C-4′ (δ _C 110.6)/C-5′ (δ _C 142.4)/ C-6′ (δ _C 113.6)相关，证实两个甲基分别连接在C-5和C-5′位。此外，特征质子信号 H-2 (δ_H 6.44 s), H-4(δ_H 6.51 s),H-6 (δ_H 6.47, s), H-2′ (δ_H 6.38,d, J=2.2)和H-6′(δ_H 6.32, d, J=2.2)也证明以上取代基的位置，因此化合物的结构得以确认。

表1 化合物的¹H和¹³C NMR数据（溶剂为C₅D₅N）

本发明的第三目的是这样实现的，所述的二苯醚类化合物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。

近年来，研究的重点重新转向了从微生物中寻找具有不同抗菌机理的新骨架次生代谢产物，而植物内生真菌代谢产物是该领域最引人注目的热点，其中最常产生抗菌活性化合物的类群为拟茎点霉属（Phomopsis）、茎点霉属（Phoma）和镰刀菌属（Fusarium）。拟茎点霉属是半知菌亚门、腔孢纲真菌中的一个大属，该类菌株可产生丰富的次生代谢产物，Weber等从鸡冠刺桐分离出的Phomopsis sp.中获得的一个新的抗菌活性内酯类化合物phomol，该化合物对 24种细菌和真菌进行生物学试验都显示出很好的抗菌活性。Horn 等从细柱柳中分离出Phomopsis sp.菌株，分离到的细胞松弛素类生物碱 phomopsichalasin可抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、藤黄球菌、大肠杆菌。

很多天然的二苯醚表现出很好的抗菌活性。本发明从一株福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）发酵产物中分离得到一个新的二苯醚类化合物diphenther A，该化合物具有显著的抗MRSA活性。

本发明的diphenther A是首次被分离出来，通过核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱数据确定其分子式及结构。以微量肉汤稀释法测试其抗金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300和活性，diphenther A能抗ATCC25923金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923的MIC为16μg/ml，抗MRSA标准菌株ATCC43300MIC为16μg/ml，说明该化合物有较好的抗MRSA活性，可作为抗MRSA的先导化合物。

附图说明

图1为化合物的核磁共振氢谱（¹H NMR）；

图2为化合物的核磁共振碳谱（¹³C NMR）；

图3为化合物的HMBC相关谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的二苯醚类化合物是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C₁₈H₂₀O₄，结构式为：

该化合物命名为：diphentherA；

所述福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株，菌株保藏编号为CCTCC M2017632，保藏日期为2017年10月23日。

本发明所述二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

A、固体发酵：将菌株福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，接种到含10~100ml液体种子培养基的50~500ml的三角瓶中，于28℃下在转速180rpm旋转震荡的条件下震荡培养5~10天得到含菌营养基，将其接种到大米固体培养基中培养得到发酵产物；

B、浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3倍的有机溶剂超声提取2~4次，每次4~8h，合并提取液，过滤，减压浓缩至1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏；

C、氯仿-丙酮硅胶柱层析：浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的氯仿-丙酮混合溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

D、石油醚-乙酸乙酯硅胶柱层析：将C步骤中8:2配比的氯仿-丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液重量6~8倍，用体积比为1:0~0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

E、高压液相色谱分离纯化：将D步骤中7:3配比的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经硅胶柱色谱和制备高效液相色谱分离纯化即得目标物二苯醚类化合物，即diphentherA。

A步骤中所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒斜面制备得到。

A步骤中所述的液体种子培养基为NaNO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，葡萄糖20g/L， pH值6.5，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌得到。

A步骤中所述的大米固体培养基为大米100g，珍珠岩20g，蒸馏水100ml,装入600mL组培瓶，121℃，25min灭菌制备得到。

B步骤中所述的有机溶剂为体积浓度60~80%的丙酮、乙醇或甲醇。

C步骤中所述的浸膏在经硅胶柱层析前，还包括将浸膏用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重1~3倍的200~300目硅胶拌样。

C步骤中所述的氯仿-丙酮混合溶剂体积配比为1:0、 20:1、9:1、 8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。

D步骤中所述的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂体积配比为1:0、 20:1、9:1、 8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。

本发明所述的二苯醚类化合物的制备方法，具体操作如下：

（1）将福士拟茎点霉置于斜面固体培养基中保存备用，斜面固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒斜面备用；

（2）将保存备用的福士拟茎点霉转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24 h，转速为180r/min，得福士拟茎点霉种子液；所述的液体种子培养基为：NaNO₃ 2g/L，K₂HPO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，葡萄糖20g/L， pH值6.5，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌备用；

（3）取步骤（2）所得福士拟茎点霉种子液，按培养基质量比2％接入大米固体培养基中进行固体发酵，发酵条件为：25 -32℃，发酵30-60天，所述的大米培养基为：大米100g，珍珠岩20g，蒸馏水100ml,装入600mL组培瓶，121℃，25min灭菌备用。

（4）超声提取：以60~80%的丙酮为溶剂，超声提取3~5次，每次4~8h，将提取液合并、过滤，减压浓缩成浸膏；

（5）氯仿-丙酮硅胶柱层析：将浸膏用重量比1.5~3倍量的纯丙酮溶解，用浸膏重量1~3倍的200-300目硅胶拌样后上硅胶柱，以体积配比为1:0~0:1的氯仿-丙酮溶液梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩；

（6）石油醚-乙酸乙酯硅胶柱层析: 将步骤（5）8:2部分的馏份，用重量比1.5~3倍量的纯甲醇溶解，用浸膏重量1~3倍的200-300目硅胶拌样后上硅胶柱，以体积配比为1:0~0:1的石油醚-乙酸乙酯溶液梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩；

（7）高压液相色谱分离：取步骤（6）7:3的馏份以40~60%的甲醇为流动相，以规格为20mm×250mm、5μm的C₁₈制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为284nm，每次进样200μL，收集洗脱液，多次累加后蒸干，得到本发明为所述的diphenther A。

本发明所述的二苯醚类化合物的应用为所述的二苯醚类化合物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。

下面以具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

（1）将保藏于斜面固体培养基中福士拟茎点霉CCTCC M 2017632接种于斜面固体培养基的平板中活化，验纯后接种于斜面固体培养基中保存备用。所述斜面固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒平板和斜面备用；

（2）将保存备用的福士拟茎点霉CCTCC M 2017632转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24 h，转速为180r/min，得福士拟茎点霉种子液。所述的液体种子培养基为：NaNO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ .7H₂O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，葡萄糖20g/L， pH值6.5，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌备用；

（3）取步骤（2）所得福士拟茎点霉种子液，按培养基质量比2％接入大米固体培养基中进行固体发酵，发酵温度为25°C，45天发酵完成。所述的大米培养基为：大米100g，珍珠岩20g，蒸馏水100mL,装入600mL组培瓶，121℃，25min灭菌备用。

实施例2

重复实施例1，有以下不同点：

(3)发酵温度为28°C，40天发酵完成。

实施例3

(3) 发酵温度为30°C，30天发酵完成。

实施例4

(3) 福士拟茎点霉种子液按培养基质量比5％接入大米固体培养基中进行固体发酵，发酵温度为28°C，35天发酵完成。

实施例5

（1）取福士拟茎点霉CCTCC M 2017632发酵产物10kg,用80%的丙酮超声提取4次，每次4h，提取液合并、过滤，减压浓缩成浸膏562g。

（2）浸膏用1000mL丙酮溶解后，用200-300目的硅胶200g拌样，然后用200-300目硅胶柱1200g装柱进行层析分离，采用体积配比为20:1, 9:1, 8:2的氯仿-丙酮溶液梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩。

（3）取（2）中氯仿-甲醇8:2洗脱浓缩部分56.3g，用120mL的纯甲醇溶解，用浸膏重量1~3倍的200-300目硅胶拌样后上硅胶柱，以体积配比为1:0、 20:1、9:1、 8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯溶液梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩；

（4）取步骤（3）7:3的馏份12.5g，以56%的甲醇为流动相，以规格为20mm×250mm、5μm的C₁₈制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为284nm，每次进样200μL，收集13.1min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到本发明为所述的diphenther A。

实施例6

重复实施例5，有以下不同点：

（1）用70%的丙酮超声提取4次，每次5h；减压浓缩的浸膏A为622g。

（4）氯仿-丙酮7:3洗脱部分为15.6g，以50%的甲醇为流动相进行高效液相色谱分离，收集15.8min的色谱峰。

实施例7

重复实施例5，有以下不同点：

（1）用75%的丙酮超声提取3次；减压浓缩的浸膏A为577g。

（4）氯仿-丙酮7:3洗脱部分为13.3g，以60%的甲醇为流动相，收集12.8min的色谱峰。

实施例8

重复实施例5，有以下不同点：

（3）氯仿-甲醇7:3洗脱部分为11.6g，以50%的甲醇为流动相进行高效液相色谱分离，收集14.5min的色谱峰。

实施例9

取实施例5制备的化合物，为红色胶状物，测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

紫外光谱（溶剂为甲醇），λ _max nm (logε)：284 (3.62), 206 (4.68)；红外光谱（溴化钾压片）ν _max: 2935, 2836, 1684, 1612, 1455, 1331, 1156, 1060, 855cm^-1；HRESIMS显示本发明化合物加钠的分子离子峰m/z 323.1262 [M+Na]⁺（C₁₈H₂₀NaO₄计算值为323.1259），结合¹H 和¹³C NMR谱（图2和图3，数据归属见表1）给出其分子式C₁₈H₂₀O₄。

化合物的¹H NMR谱显示化合物中有20个氢信号，包括两个甲基质子信号 [H₃-7（d _H 2.33 s），H₃-7′（d _H2.25 s）]，五个芳基质子信号[H-2（d _H 6.44 s）， H-4（d _H 6.51 s），H-6（d _H 6.47 s），H-2' （d _H 6. 38 d J=2.2），H-6'（d _H 6.32 d J=2.2]，两个甲氧基信号[OMe-3（d _H 3.80 s)，OMe-3′（d _H 3.85 s) ]，一个乙酰基质子信号H₃-9'（d _H 2.59 s）。化合物的¹³C NMR谱显示化合物中有18个碳信号，包括两个甲基碳信号[C-7（d_C 21.6 q）， C-7＇（d_C 23.6 q）]，两个甲氧基碳信号[3-OMe（d_C 56.0 q）， 3＇-OMe（d_C 56.3 q）]，乙酰基碳信号[C-8＇（d_C 198.5 s）， C-9＇（d_C 29.6 q）]，五个sp²杂化的芳基次甲基碳信号[C-2（d_C103.8 d）， C-4（d_C 109.5 d），C-6（d_C 111.8 d），C-2＇（d_C 100.2 d）， C-6＇（d_C 113.6 d）]，七个sp²杂化的芳基季碳信号[C-1（d_C 155.3 s），C-3（d_C 160.9 s）， C-5（d_C 140.4 s）， C-1＇（d_C 162.7 s）， C-3＇（d_C 164.3 s）， C-4＇（d_C 110.6 s），C-5＇（d_C 142.4 s）]，其中四个碳连氧。综合¹H NMR谱和¹³C NMR谱数据，说明该化合物有两个苯环存在。两个苯环中有四个连氧的季碳，除了两个甲氧基取代以外，应有一个氧原子连接两个苯环形成醚键，该化合物为二苯醚的衍生物。苯环上有两个甲基、两个甲氧基、一个乙酰基取代。红外光谱显示有羰基（1684 cm^-1）和苯基（1612, 1455, 1331cm^-1）的吸收峰。HMBC谱中H-9′(δ _H 2.59) 和 C-4′(δ _C 110.6)相关，证实乙酰基连接在C-4′位，甲氧基质子OMe(δ _H 3.80) 和 C-3 (δ _C160.9)，甲氧基质子OMe(δ _H 3.85) 和 C-3′ (δ _C 164.3)相关，证实两个甲氧基分别连接在C-3和C-3′位，两个甲基质子H₃-7 (δ _H 2.33 )和C-4 (δ _C 109.5)/C-5 (δ _C 140.4)/ C-6 (δ _C111.8)相关，H₃-7′ (δ _H 2.25)和C-4′ (δ _C 110.6)/C-5′ (δ _C 142.4)/ C-6′ (δ _C 113.6)相关，证实两个甲基分别连接在C-5和C-5′位。此外，特征质子信号 H-2 (δ_H 6.44 s), H-4(δ_H 6.51 s),H-6 (δ_H 6.47, s), H-2′ (δ_H 6.38,d, J=2.2)和H-6′(δ_H 6.32, d, J=2.2)也证明以上取代基的位置，因此化合物的结构得以确认。

实施例10

取实施例6、7、8制备的化合物，均为黄色胶状物，测定方法与实施例9相同，均确定实施例6、7、8制备的化合物为C₁₈H₂₀O₄。

实施例11

取实施例5~8所制备的任一化合物进行活性检测试验，试验情况如下：

应用微量肉汤稀释法测定diphenther A的MIC（ug/mL）值。

（1）抗菌药物和培养基制备：将待测二苯醚类化合物溶于DMSO，配制成浓度(2560μg/ml)母液，过滤除菌备用。配制好的MH肉汤培养基121℃灭菌30min备用。

（2）培养24h的MRSA菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释，得到约含菌1×10⁶CFU/mL的菌液备用。

（3）稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml，将稀释管中的培养物转入96孔板，每个样品做三个平行，DMSO为溶剂对照，万古霉素为阳性对照。

（4）孵育将接种好的96孔板置37℃恒温培养箱中孵育24h。

（5）结果判断：以小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，同时溶剂对照内细菌无明显抑制。

微量肉汤稀释法中使用的菌株包括金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300。结果表明diphenther A能抑制ATCC25923和ATCC43300，金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923的MIC为16μg/ml，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300MIC为16μg/ml，可作为研制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物的先导化合物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和变化等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种二苯醚类化合物的制备方法，其特征在于所述二苯醚类化合物是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C₁₈H₂₀O₄，结构式为：

该化合物命名为：diphentherA；所述福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株，菌株保藏编号为CCTCC M 2017632，保藏日期为2017年10月23日；制备方法包括以下步骤：

A、固体发酵：将菌株福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，接种到含10~100mL液体种子培养基的50~500mL的三角瓶中，于28℃下在转速180rpm旋转震荡的条件下震荡培养5~10天得到含菌营养基，将其接种到大米固体培养基中培养得到发酵产物；液体种子培养基为NaNO₃ 2g/L、K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、KCL 0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、葡萄糖20g/L，pH值6.5，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌得到；

B、浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3倍的有机溶剂超声提取2~4次，每次4~8h，合并提取液，过滤，减压浓缩至1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏；

C、氯仿-丙酮硅胶柱层析：浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的氯仿-丙酮混合溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

D、石油醚-乙酸乙酯硅胶柱层析：将C步骤中8:2配比的氯仿-丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液重量6~8倍，用体积比为1:0~0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

E、高压液相色谱分离纯化：将D步骤中7:3的馏份以40~60%的甲醇为流动相，以规格为20mm×250mm、5μm的C₁₈制备柱为固定相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为284nm，每次进样200μL，收集洗脱液，多次累加后蒸干，得到所述二苯醚类化合物diphenther A。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，pH值6.5，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒斜面制备得到。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述大米固体培养基为大米100g、珍珠岩20g、蒸馏水100mL，装入600mL组培瓶，121℃，25min灭菌制备得到。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述有机溶剂为体积浓度60~80%的丙酮、乙醇或甲醇。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于C步骤中所述浸膏在经硅胶柱层析前，还包括将浸膏用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重1~3倍的200~300目硅胶拌样。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于C步骤中所述氯仿-丙酮混合溶剂体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述石油醚-乙酸乙酯混合溶剂体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。

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