CN107540532A - 一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物及其制备方法与应用，属于天然产物化学技术领域。该化合物结构式如式（I）所示：，式（I）；该化合物是以传统药食同源植物金银花为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得。经活性测试表明，本发明化合物具有较好的抑菌作用，将本发明化合物添加到烟草料液中，能有效抑制料液中的微生物生长，延长烟草料液的保质期，具有良好的应用前景。

Description

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物及其制备方 法与应用

技术领域

本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及一种从传统药食同源植物金银花中首次提取得到的二苯醚类化合物。同时，本发明还涉及该化合物的制备方法、以及其在防止烟草料液腐败变质，延长烟草烟草料液保质期中的应用。

背景技术

金银花，又名忍冬，为忍冬科多年生半常绿木本药食同源植物。由于初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。金银花是一种金银花自古被誉为清热解毒的良药，它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，均效果显著。随着社会的进步和科学技术的发展，人们对金银花综合开发利用的研究也越来越深入。从原始的药用价值，发展为保健养生食品、美容护肤等产品的开发生产，继而发展到旅游观光和生态农业工程建设。国内外研究表明，金银花中的主要化学成分有：有机酸类、苯丙素、黄酮、甾醇、三萜皂苷、环烯醚萜苷类和萜类挥发油等。

天然防腐剂也称天然有机防腐剂，是由生物体分泌或者体内存在的具有抑菌作用的物质，经人工提取或者加工而成为食品防腐剂。此类防腐剂为天然物质，有的本身就是食品的组分，故对人体无毒害，并能增进食品的风味品质，因而是一类有发展前景的食品防腐剂。随着食品安全性与保健功能日益成为人们关注的焦点，食品原料乃至食品添加剂的选择趋向天然、健康、具有生物活性的材料，天然植物成为了食品防腐、抗菌成分的重要来源，可用于抗菌、防腐剂开发的天然物质资源非常广泛，结构类型主要有：二苯醚、黄酮、单宁、蒽醌、生物碱、木酯素、萜类化合物、甾醇等。二苯醚类化合物为一类重要的抗菌性药物，自然界中分离得到的天然二苯醚类化合物数量不多，但一般都具有一定的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗微藻、抗炎、抗肿瘤、抑制血管紧张素转换酶和氨基肽酶、HIV蛋白酶、果胶酶等，因而引起了人们广泛关注。本发明从金银花中分离得到了一种多取代基二苯醚类化合物，活性研究表明该化合物具有较好的抗菌活性；该化合物安全、无毒，抗菌活性显著，可用于防止烟草料液的腐败变质，延长烟草料液的保质期。该化合物至今尚未见到相关报道。

发明内容

基于上述现有技术，本发明的目的在于提供一种新的二苯醚类化合物，同时提供一种制备所述二苯醚类化合物的方法，还涉及所述二苯醚类化合物在防止烟草料液腐败变质，延长烟草料液保质期中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物，结构式如式（I）所示：

，式（I）。

该化合物的命名为：1-[4-(3-羟基-5-甲基苯氧基)-2-甲氧基-6-甲基苯]-乙酮；英文名为：1-[4-(3-hydroxy-5-methylphenoxy)-2-methoxy-6-methylphenyl]-ethanone。

本发明所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将金银花粉碎到30～50目，用重量百分浓度为80%～100%的甲醇水溶液、重量百分浓度为80%～100%的乙醇水溶液或重量百分浓度60%～90%的丙酮水溶液为提取溶剂，浸泡提取多次，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤（2），硅胶柱层析：将步骤（1）得到的浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~300目，所用硅胶重量为浸膏重量2～4倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高压液相色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

进一步，优选的是，步骤（1）中，浸泡提取次数为3～5次，每次浸泡24h～72h，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为3～5:1。

进一步，优选的是，步骤（2）中，浸膏在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏1.5~3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，之后上样。

进一步，优选的是，步骤（2）中，硅胶装柱的方法为干法装柱。

进一步，优选的是，步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

本领域技术人员应该知晓本技术方案只是一个优选技术方案，高效液相色谱分离纯化采用的流动相不限于此。

进一步，优选的是，高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

上述方法制备得到的二苯醚类化合物结构通过以下方法进行测定：

本发明化合物为浅黄色油状物，其高分辨质谱HRESIMS (正离子采集) 显示准分子离子峰为 m/z 309.1109，(计算值315.0845)。结合¹H和¹³C NMR谱确定化合物分子式为C₁₇H₁₈O₄，不饱和度为9。

红外光谱中显示了羟基(3447 cm^-1)、羰基 (1685 cm^-1) 和芳环 (1610、1458和1336 cm^-1) 的共振吸收峰。紫外光谱在 205和286 nm 有最大吸收证实化合物中存在芳环结构。

化合物的¹H、¹³C NMR和DEPT数据（如图1、图2和表1）显示化合物中存在17个碳(包括4个氧化的芳香族季碳)和18个氢，包括一个1,3,5-三取代的苯环(C-1 ~ C-8，C-1 ~ C-6；H-2，H-4和H-6)，一个1,3,4,5-四取代的苯环(C-1' ~ C-6'；H-2'和H-6')一个乙酰基(C-8' 和C-9'；H₃-9')，两个甲基 (C-7和C-7'；H₃-7和H₃-7')，1个甲氧基(δ _C 56.3 q；δ _H3.86 s)，一个酚羟基 (δ _H 11.05)。以及一个乙酰基(C-8'和C-9'；H₃-9')。化合物分子式中有4个氧，两个苯环上有4个氧化的季碳，除去甲氧基、羟基和乙酰基氧，另外一个氧通过醚键连接两个苯环才能支持分子中存在的四个氧化的芳香族季碳。因此可推测该化合物为二苯醚类化合物，通过和已知化合物methyl2-hydroxy-4-(3-hydroxy- 5-methylphenoxy)-6-methylbenzoate的核磁共振数据对比，可进一步确定该化合物为3,5,3',4',5'-五取代的二苯醚衍生物。化合物的母体得到确认后，其它的信号甲基、甲氧基、酚羟基和乙酰基氧可认为是母核上的取代基。

进一步分析其HMBC相关谱（如图3），根据甲基氢信H₃-7号和C-4、C-5、C-6的HMBC相关，以及H-4和H-6与C-7的HMBC相关，可证实该甲基取代在母核的C-5位；从另一个甲基氢信号H₃-7'号和C-4'、C-5'、C-6'的HMBC相关，以及H-6'与C-7'的HMBC相关，可证实该甲基取代在母核的C-5'位。根据甲氧基氢(δ _H 3.86 s)和C-3'的HMBC相关，可证实该甲氧基取代在C-3'位。根据酚羟基氢和C-2、C-3、C-4的HMBC相关，可证实酚羟基取代在C-3位。根据乙酰甲基氢H₃-9'和C-4'的HMBC相关可证实乙酰基取代在C-4'位。苯环上典型的质子信号H-2 (δ _H6.40 s)、H-4 (δ _H 6.53 s)、H-6 (δ _H 6.48 s)、H-2' (δ _H6.36 (d) 2.2)和H-4' (δ _H 6.33(d) 2.2)，也支持母核上的上述取代基模式。

至此，化合物的结构得到确定，化合物命名为：1-[4-(3-羟基-5-甲基苯氧基)-2-甲氧基-6-甲基苯]-乙酮；英文名为：1-[4-(3-hydroxy-5-methylphenoxy)- 2-methoxy-6-methylphenyl]- ethanone。

化合物的红外、紫外和质谱数据：UV (甲醇)，λ _max (log ε) 286 (3.57)、205(4.57) nm；IR (溴化钾压片)：ν _max 3447，2938、2840、1685、1610、1458、1336、1158、1062、847 cm^-1；¹H 和 ¹³C NMR 数据 (500 和125 MHz, (C₅D₅N)，见表-1；正离子模式 ESIMS m/z309 [M+Na]⁺；正离子模式HRESIMS m/z 309.1109 [M+Na]⁺ (C₁₇H₁₈NaO₄，计算值309.1103)。

表1 化合物(Ⅰ)的核磁共振数据 (500/125 MHz，溶剂为C₅D₅N)

本发明还提供上述金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物作为抗菌剂的应用。

同时，本发明还提供上述金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物作为防腐剂的应用。

进一步，优选的是，所述的防腐剂为烟草料液防腐剂。本发明化合物能够防止烟草料液腐败变质，有效的延长烟草料液保质期。

对本发明化合物进行了抗菌活性筛选，体外抗菌实验用琼脂扩散法进行：首先将受试菌均匀地涂在MH琼脂培养基（牛肉粉6.0g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酸水解酪蛋白17.5g/L，琼脂17.0g/L，pH7.3±0.1），受试菌涂抹量为用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，再将待测化合物（本发明化合物用10 mL DMSO溶解，加水稀释成50 mg/mL的溶液）浸泡好的药片（直径5mm）放在带菌的培养基上，放入恒温箱内，于25℃孵育24-72 h后观察抑菌圈大小。

结果表明：本发明化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有很强的活性；抑制率均超过95.2%。

同时，对本发明化合物进行了安全性评价，通过小鼠骨髓微核实验、Ames实验和TK基因突变实验，证明本发明化合物对动物无毒，使用安全。

将本发明化合物添加到烟草料液中，添加量为10 mg/mL、20 mg/mL和50mg/mL，并以未添加化合物的料液作为对照，放置两周后观察样品中的微生物变化。结果表明：和对照相比，添加10 mg/mL、20 mg/mL和50mg/mL的本发明化合物后，检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数的抑制率，三种浓度的抑制率最低分别为：71.2 %、85.4%、和95.7%。由于微生物的生长得到了有效抑制，烟草料液的质保期大大得到延长，可延长3-8倍以上。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明化合物从传统药食同源植物金银花中分离得到，金银花具有悠久的食用历史，并且金银花作为原料或添加剂已被广泛应用于保健饮料和食品，对动物无毒，使用安全，金银花提取物也广泛用作烟用添加剂，不会给卷烟产品带来不良影响。

本发明化合物展现出良好的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌率全部达到95.2%以上；用作烟草料液抑菌剂，能有效抑制烟草料液腐败变质，显著延长烟草料液的保质期；可有效避免烟草料液变质造成的损失和变质料液不慎进入卷烟产品造成的不良影响。

目前金银花分布非常广泛，除黑龙江、内蒙古、宁夏、青海、新疆、海南和西藏无自然生长外，全国各省均有分布。在我国广东、广西、四川、云南、福建等地有规模化栽培基地，原料来源广泛、成本低，而且本发明化合物制备工艺简单，工业化生产容易实现，具备大规模推广应用的条件。

附图说明

图1为本发明二苯醚类化合物的核磁共振碳谱；

图2为本发明二苯醚类化合物的核磁共振氢谱；

图3为本发明二苯醚类化合物的主要HMBC相关。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所用金银花原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面基于不同产地的金银花原料，对本发明做进一步说明。本发明所采用的金银花均为普通市购品。

实施例1

金银花样品来源于云南昆明，品种树形金银花3号。

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将金银花粉碎到30～50目，用重量百分浓度为80%甲醇水溶液为提取溶剂，浸泡提取3次，每次浸泡24h，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为3:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤（2），硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏1.5倍的甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8倍的80~100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为160目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例2

金银花样品来源于云南昆明，品种树形金银花3号。

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将金银花粉碎到30～50目，用甲醇为提取溶剂，浸泡提取5次，每次浸泡72h，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为5:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤（2），硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏3倍的丙酮溶解，然后用重量是浸膏1.2倍的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为300目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3.5倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例3

金银花样品来源于云南昆明，品种树形金银花3号。

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将金银花粉碎到30～50目，用重量百分浓度为80%的乙醇水溶液为提取溶剂，浸泡提取4次，每次浸泡36h，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为4:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤（2），硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2倍的丙酮溶解，然后用重量是浸膏1倍的90目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为200目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3.8倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例4

金银花样品来源于云南昆明，品种树形金银花3号。

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将金银花粉碎到30～50目，用乙醇为提取溶剂，浸泡提取4次，每次浸泡48h，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为3.5:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤（2），硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2.5倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.9倍的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为200目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例5

金银花样品来源于云南昆明，品种树形金银花3号。

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将金银花2.5kg粉碎到30～50目，用重量百分浓度为95%的甲醇水溶液为提取溶剂，浸泡提取5次，每次浸泡24hh，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为3:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏165g；

步骤（2），硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2倍的甲醇溶解，然后用重量为180g的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为160目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量2倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的Zorbax SB-C18制备柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例6

金银花样品来源于云山东临沂，品种为北花一号。

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将金银花粉碎到30目，取4.2kg，用重量百分浓度为95%的乙醇水溶液为提取溶剂，浸泡提取4次，每次浸泡48h，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为5:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏，得浸膏302g；

步骤（2），硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2倍的甲醇溶解，然后用重量为320g的80目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为200目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量4倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的Zorbax SB-C18制备柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例7

金银花样品来源于四川峨眉，品种为山东藤本大毛花。

一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将5.8kg金银花粉碎到30～50目，用重量百分浓度75%的丙酮水溶液为提取溶剂，浸泡提取3次，每次浸泡72h，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为4.5:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏，得浸膏427g；

步骤（2），硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏1.6倍的甲醇溶解，然后用重量为480g的90目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为180目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3.6倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的Zorbax SB-C18制备柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例8

------ 化合物结构的鉴定

将实施例1方法制备得到的二苯醚类化合物的结构通过以下方法进行测定：

本发明化合物为浅黄色油状物，其高分辨质谱HRESIMS (正离子采集) 显示准分子离子峰为 m/z 309.1109，(计算值315.0845)。结合¹H和¹³C NMR谱确定化合物分子式为C₁₇H₁₈O₄，不饱和度为9。

红外光谱中显示了羟基(3447 cm^-1)、羰基 (1685 cm^-1) 和芳环 (1610、1458和1336 cm^-1) 的共振吸收峰。紫外光谱在 205和286 nm 有最大吸收证实化合物中存在芳环结构。

化合物的¹H、¹³C NMR和DEPT数据（如图1、图2和表1）显示化合物中存在17个碳(包括4个氧化的芳香族季碳)和18个氢，包括一个1,3,5-三取代的苯环(C-1 ~ C-8，C-1 ~ C-6；H-2，H-4和H-6)，一个1,3,4,5-四取代的苯环(C-1' ~ C-6'；H-2'和H-6')一个乙酰基(C-8' 和C-9'；H₃-9')，两个甲基 (C-7和C-7'；H₃-7和H₃-7')，1个甲氧基(δ _C 56.3 q；δ _H3.86 s)，一个酚羟基 (δ _H 11.05)。以及一个乙酰基(C-8'和C-9'；H₃-9')。化合物分子式中有4个氧，两个苯环上有4个氧化的季碳，除去甲氧基、羟基和乙酰基氧，另外一个氧通过醚键连接两个苯环才能支持分子中存在的四个氧化的芳香族季碳。因此可推测该化合物为二苯醚类化合物，通过和已知化合物methyl2-hydroxy-4-(3-hydroxy- 5-methylphenoxy)-6-methylbenzoate的核磁共振数据对比，可进一步确定该化合物为3,5,3',4',5'-五取代的二苯醚衍生物。化合物的母体得到确认后，其它的信号甲基、甲氧基、酚羟基和乙酰基氧可认为是母核上的取代基。

进一步分析其HMBC相关谱（如图3），根据甲基氢信H₃-7号和C-4、C-5、C-6的HMBC相关，以及H-4和H-6与C-7的HMBC相关，可证实该甲基取代在母核的C-5位；从另一个甲基氢信号H₃-7'号和C-4'、C-5'、C-6'的HMBC相关，以及H-6'与C-7'的HMBC相关，可证实该甲基取代在母核的C-5'位。根据甲氧基氢(δ _H 3.86 s)和C-3'的HMBC相关，可证实该甲氧基取代在C-3'位。根据酚羟基氢和C-2、C-3、C-4的HMBC相关，可证实酚羟基取代在C-3位。根据乙酰甲基氢H₃-9'和C-4'的HMBC相关可证实乙酰基取代在C-4'位。苯环上典型的质子信号H-2 (δ _H6.40 s)、H-4 (δ _H 6.53 s)、H-6 (δ _H 6.48 s)、H-2' (δ _H6.36 (d) 2.2)和H-4' (δ _H 6.33(d) 2.2)，也支持母核上的上述取代基模式。

至此，化合物的结构得到确定，化合物命名为：1-[4-(3-羟基-5-甲基苯氧基)-2-甲氧基-6-甲基苯]-乙酮；英文名为：1-[4-(3-hydroxy-5-methylphenoxy)- 2-methoxy-6-methylphenyl]-ethanone。

实施例9

取实施例2-7制备的化合物，为浅黄色油状物。测定方法与实施例8相同，确认实施例2-7制备的化合物为所述的二苯醚类化合物——1-[4-(3-羟基-5-甲基苯氧基)-2-甲氧基-6-甲基苯]-乙酮。

实施例10

------化合物抗菌活性试验

取实施例1-7制备的任一二苯醚类化合物进行抗菌活性试验，试验情况如下：

首先将受试菌均匀地涂在MH琼脂培养基（牛肉粉6.0g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酸水解酪蛋白17.5g/L，琼脂17.0g/L，pH7.3±0.1），受试菌涂抹量为用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，再将待测化合物（本发明化合物用10 mL DMSO溶解，加水稀释成50 mg/mL的溶液）浸泡好的药片（直径5mm）放在带菌的培养基上，放入恒温箱内，于25℃孵育24-72 h后观察抑菌圈大小。

结果表明：本发明化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有很强的活性；抑制率均超过95.2%。

同时，对本发明化合物进行了安全性评价，通过小鼠骨髓微核实验、Ames实验和TK基因突变实验，证明本发明化合物对动物无毒，使用安全。

实施例11

------化合物应用

将本发明化合物添加到烟草料液中，添加量为10 mg/mL、20 mg/mL和50mg/mL，并以未添加化合物的料液作为对照，放置两周后观察样品中的微生物变化。结果表明：和对照相比，添加10 mg/mL、20 mg/mL和50mg/mL的本发明化合物后，检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数的抑制率，三种浓度的抑制率最低分别为：71.2 %、85.4%、和95.7%。由于微生物的生长得到了有效抑制，烟草料液的质保期大大得到延长，，可延长3-8倍以上。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物，其特征在于，结构式如式（I）所示：

，式（I）。

2.权利要求1所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的金银花为原料，将金银花粉碎到30～50目，用重量百分浓度为80%～100%的甲醇水溶液、重量百分浓度为80%～100%的乙醇水溶液或重量百分浓度60%～90%的丙酮水溶液为提取溶剂，浸泡提取多次，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤（2），硅胶柱层析：将步骤（1）得到的浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~300目，所用硅胶重量为浸膏重量2～4倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高压液相色谱分离纯化，即得式（I）所示的二苯醚类化合物。

3.根据权利要求2所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，浸泡提取次数为3～5次，每次浸泡24h～72h，每次所用提取溶剂与金银花的重量比为3～5:1。

4.根据权利要求2所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，浸膏在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏1.5~3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，之后上样。

5.根据权利要求2所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，硅胶装柱的方法为干法装柱。

6.根据权利要求2所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为52%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为286nm，每次进样500μL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

7.根据权利要求2或6所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物的制备方法，其特征在于：高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

8.权利要求1所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物作为抗菌剂的应用。

9.权利要求1所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物作为防腐剂的应用。

10.根据权利要求9所述的金银花中的具有抗菌活性的二苯醚类化合物作为防腐剂的应用，其特征在于，所述的防腐剂为烟草料液防腐剂。