CN103880824B - 异香豆素类抗生素和田霉素(Hetiamacin)B、C、D及其制备和应用 - Google Patents

异香豆素类抗生素和田霉素(Hetiamacin)B、C、D及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供三个异香豆素类新抗生素和田霉素（Hetiamacin）B、C、D及其制备方法以及和田霉素B、C、D及其组合物在制备抗生素药物中的应用。上述化合物左侧都具有所有Amicoumacin类化合物的骨架结构：甲基丁基氨基-3,4-二氢-8-羟基异香豆素；右侧侧链上10′-C、11′-C、12′-C、14′-C与13′-NH、15′-NH相连，形成一个六氢嘧啶环结构。上述化合物通过对枯草芽孢杆菌菌株的发酵并分离而得，对革兰氏阳性细菌如葡萄球菌属及其耐药菌等具有很高的抑制活性，有望成为抗革兰氏阳性菌药物及其先导化合物而具有良好的药用开发前景。

Description

异香豆素类抗生素和田霉素(Hetiamacin)B、C、D及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一组天然来源的异香豆素类(isocoumarin)新抗生素及其制备方法，以及其在制备抗革兰氏阳性细菌及其耐药菌感染药物中的应用。
背景技术
以“ESKAPE”为代表的耐药菌日益猖獗，严重威胁着全球感染性疾病的治疗。自1961年在英国首次发现耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)以来，MRSA占临床上分得金黄色葡萄球菌的比例由20世纪80年代中期的1％～5％迅速迅速增加至目前的60％～70％，美国每年超过94000人感染MRSA，19000人死亡。据我国细菌耐药性监测网(CHINET)报告显示：2011年我国临床耐甲氧西林金葡菌MRSA分离率高达50％以上，部分MRSA对糖肽类抗生素低水平耐药，即万古霉素中介的金黄色葡萄球菌(VISA)，可见MRSA感染也是我国细菌耐药的突出问题。虽然万古霉素、利奈唑胺、达托霉素和替加环素等少数药物经美国FDA批准已用于临床治疗MRSA感染，但近年来临床上已发现上述药物的耐药菌株，尤其是1996年万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌(VISA)及2002年第1株耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)的出现。MRSA已经成为严重威胁人类生命健康的“超级细菌”，与艾滋病、病毒性乙型肝炎并称为世界三大感染性疾病，成当今感染医学一个难题。因此研究开发针对MRSA的新的抗菌药物刻不容缓。
Amicoumacin是一类来源于微生物的异香豆素类化合物。该类化合物具有异香豆素(isocoumarin)类母核结构，自1975年发现第一个该类抗生素baciphelacin以来，已报道了20多种来源于微生物的Amicoumacin类化合物，它们具有抗菌、抗肿瘤，抗疟，抗病毒，抗炎，溃疡保护，植物生长调节等广泛的生物活性，尤其是抗MRSA的活性极为突出。1975年武田制药株式会社HisayoshiOkazaki等发现的第一个Amicoumacin类抗生素Baciphelacin对耐药(耐青霉素、链霉素和大环内酯类抗生素)金黄色葡萄球菌有很好的抑制；而后1981年日本明治制菓株式会社(MeijiSeikaKaisha,Ltd.)JiroItoh等从短小芽孢杆菌BacilluspumilusBN-103中首次分离到AmicoumacinA，对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的MIC值均小于1μg/mL；2007年日本武蔵野大学(MusashinoUniversity)的MakotoHasimoto等活性研究表明，AmicoumacinA耐甲氧西林金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC43300的抗菌活性与万古霉素相当，MIC值分别为4和2.5μg/mL；另外，1992年日本山之内制药株式会社TutomuSato等从芽孢杆菌Bacillussp.Y-05460M-A中分离得到的Y-05460M-A，2012年香港科技大学LiYongxin等分离到的BacilosarcinsB，以及1981年美国专利报道的Amicoumacin类抗生素Kristenin，都具有抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或者抗MRSA的强活性。
本发明人从一株植物叶片内生枯草芽孢杆菌的次级代谢产物中分离得到三个Amicoumacin类抗生素—和田霉素(Hetiamacin)B、C、D，经紫外光谱、红外光谱、高分辨质谱及核磁共振等波谱学数据的仔细分析，确定和田霉素(Hetiamacin)B、C、D为Amicoumacin类新抗生素，该结构与本发明人已经发表的Amicoumacin类抗生素HetiamacinA(参见发明人的专利申请CN102977082A)相似，其侧链都有一个独特的六氢嘧啶环，但是与HetiamacinA侧链的成环位点不同。对HetiamacinB、C、D进行抗菌活性评价发现，三者对葡萄球菌属，包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)都有抑制活性，其中HetiamacinB的抗菌活性最强，MIC值均在1-2μg/ml范围内。因此，HetiamacinB、C、D有望成为抗革兰氏阳性细菌如葡萄球菌属及其耐药菌(MRSA)感染的药物及先导化合物并具有潜在的良好开发前景。
发明内容
本发明的目的之一是：提供三个异香豆素类新抗生素和田霉素(Hetiamacin)B、C、D，结构如式(1)、(2)、(3)所示：
(1)HetiamacinB
(2)HetiamacinC
(3)HetiamacinD
通过一系列光谱学分析，确定了和田霉素(Hetiamacin)B、C、D的结构。该组化合物左侧都具有所有Amicoumacin类化合物的骨架结构：甲基丁基氨基-3,4-二氢-8-羟基异香豆素；右侧侧链上10′-C、11′-C、12′-C、14′-C与13′-NH、15′-NH相连，形成一个六氢嘧啶环结构。
本发明所说的和田霉素(Hetiamacin)B是一种白色无定形粉末，分子式为C23H33O7N3，分子量为463，其结构特征为侧链具有六氢嘧啶环的羟基二氢异香豆素结构，在14′-C上连接两个甲基。其易溶于甲醇、氯仿、二甲基亚砜、吡啶等溶剂，难溶于水。本发明所说的HetiamacinC是一种淡黄色无定形粉末，分子式为C22H31O7N3，分子量为449。其结构与HetiamacinB相似，不同之处在于侧链六氢嘧啶环的14′-C上连接一个甲基，其易溶于甲醇、氯仿、二甲基亚砜、吡啶等溶剂，难溶于水。本发明所说的HetiamacinD是一种淡黄色无定形粉末，分子式为C23H33O7N3，分子量为463。其结构与HetiamacinB、C相似，不同之处在于侧链六氢嘧啶环的14′-C上连接一个乙基，其易溶于甲醇、氯仿、二甲基亚砜、吡啶等溶剂，难溶于水。
本发明的另一个目的是，提供天然来源的本发明的上述和田霉素(Hetiamacin)B、C、D化合物的制备方法，包括如下步骤：
首先发酵培养保藏编号为CGMCCNo.6688的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilissubsp.inaquosorum)PJS(参见发明人的专利申请CN102977082A)，收获发酵物；然后从发酵物中提取、分离所述的和田霉素(Hetiamacin)B、C、D。
所述发酵培养步骤为：将保藏编号为CGMCCNo.6688的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilissubsp.inaquosorum)PJS接种于种子培养基上培养，然后转入发酵培养基培养，培养成熟后收获发酵液。
其中，在种子培养基培养条件为26～30℃，150～200rpmin，培养22～26h。
其中，在发酵培养基培养条件为26～30℃，150～200rpmin，培养46～50h。
所述提取、分离步骤包括：将发酵液离心后，布氏漏斗抽滤，上清滤液用大孔树脂HP-20吸附，经过不同比例的丙酮-水洗脱，洗脱液去丙酮后冷冻干燥得粗提物；粗提物用少量甲醇溶解，经反向C18中压柱洗脱分离，LC-MS检测合并，去甲醇后得到半纯品；半纯品溶于少量甲醇，用HPLC进行制备，去甲醇的水溶液冷冻干燥，得到成品。
具体的提取分离步骤为：发酵液经离心、布氏漏斗抽滤后，以3-4BV/h(倍柱体积/小时)的速度通过HP-20型大孔树脂，流出液弃去；用1-2BV体积的蒸馏水洗涤树脂层，再分别用2-3BV的30％、50％、80％丙酮-水溶液洗脱树脂，洗脱液去丙酮的水溶液经冷冻干燥，分别获得30％丙酮-水溶液、50％丙酮-水溶液、80％丙酮-水溶液洗脱的粉末状粗品。而后50％丙酮-水溶液洗脱的粗提物，用少量甲醇溶解，湿法上样于RP-C18中压柱，用甲醇-水进行分级梯度洗脱(30％甲醇-水溶液150mL，60％甲醇-水溶液200mL，90％甲醇-水溶液200mL)，按5-6mL/管收集洗脱液。60％甲醇水洗脱液进行LC-MS的检测，相同成分管合并后减压浓缩，得到分别含有不同目标化合物(MW＝449或463)的半纯品。半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，以48％甲醇-水溶液，2mL/min的流速进行等度洗脱，分别收集254nm紫外波长下出现在29min、26min、33min附近的色谱峰，去甲醇后水溶液经冷冻干燥，分别得到白色或浅黄色粉末状的成品化合物HetiamacinB、C、D。
本发明的又一个目的是，提供和田霉素(Hetiamacin)B、C、D及其组合物在制备抗感染药物中的用途。所述抗感染药物用于抗革兰氏阳性细菌感染，所述抗革兰氏阳性细菌感染为革兰氏阳性菌葡萄球菌属及其耐药菌所造成的感染。
本发明所说和田霉素(Hetiamacin)B、C、D，是从一株来源于新疆未知植物叶片内生枯草芽孢杆菌亚种PJS(Bacillussubtilissubsp.inaquosorumPJS)培养液的次级代谢产物中分离得到的。所述产生菌已于2012年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Bacillussubtilissubsp.inaquosorum，保藏编号为：CGMCCNo.6688。因此，本发明提供了一种用于生产和田霉素(Hetiamacin)B、C、D的枯草芽孢杆菌PJS。
本发明还提供了枯草芽孢杆菌PJS在生产和田霉素(Hetiamacin)B、C、D中的应用。
为了获得和田霉素(Hetiamacin)B、C、D及其开展抗菌活性测定，本发明采取了以下技术路线与步骤：
和田霉素(Hetiamacin)B、C、D产生菌的发酵及培养：首先是将生长于斜面的的枯草芽孢杆菌菌株PJS接种于种子培养基，在旋转摇床上培养24小时，然后转入发酵培养基并在旋转摇床上培养，48小时收获发酵液；
所述的种子培养基为改良高氏一号培养基(可溶性淀粉20.0g，NaCl50.0g，K2HPO40.5g，KNO31.0g，MgSO41.0g，FeSO40.02g，葡萄糖1.0g，蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.3g，1.0升无菌蒸馏水，pH8.0)。所述的发酵培养基与种子培养基配方一致。
和田霉素(Hetiamacin)B、C、D的提取、分离：将发酵液离心过滤后，上清滤液用大孔树脂HP-20吸附，经过不同比例的丙酮/水溶液洗脱，去丙酮的水溶液冷冻干燥后得粗提物；粗提物少量甲醇溶解，经反向C18中压柱分离，甲醇/水溶液洗脱，洗脱液LC-MS检测，合并相同成分得到半纯品；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，分别收集不同时间下的洗脱组分，冷冻干燥，得到化合物纯品和田霉素(Hetiamacin)B、C、D。
和田霉素(Hetiamacin)B、C、D的结构鉴定：根据UV、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT数据和1H-1H相关谱(1H-1HCOSY)、1H-13C相关谱(HSQC)、反向检测远程1H-13C异核多键相关谱(HMBC)、旋转坐标系中的二维核间奥氏效应谱(ROESY)的分析，确定了和田霉素(Hetiamacin)B、C、D的化学结构；
和田霉素(Hetiamacin)B、C、D的抗菌活性测定：最低抑菌浓度(MIC)的测定按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法进行。实验结果表明，和田霉素(Hetiamacin)B、C、D对革兰氏阳性菌葡萄球菌属具有抑制作用：对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)都有一定的抑制活性，其中和田霉素(Hetiamacin)B的抗菌活性最强，MIC值均在1-2μg/ml范围内；和田霉素(Hetiamacin)C的抗菌MIC值在4-8μg/ml范围内；和田霉素(Hetiamacin)D的抑菌MIC值在8-16μg/ml范围内。
本发明提供的结构式(1)、(2)、(3)所示化合物是一组新型Amicoumacin类抗生素—和田霉素(Hetiamacin)B、C、D，经体外生物活性测定证明，该组化合物具有较好的抗革兰氏阳性细菌及其耐药菌包括MRSA的活性，作为一系列新的抗感染药物有着较好的应用前景。
附图说明
图1HetiamacinB的紫外光谱。
图2HetiamacinB的红外光谱。
图3HetiamacinB的高分辨质谱(HR-ESI-MS)。
图4HetiamacinB在DMSO-d6中的1H-NMR谱。
图5HetiamacinB在DMSO-d6中的13C-NMR谱。
图6HetiamacinB在DMSO-d6中的DEPT谱。
图7HetiamacinB在DMSO-d6中的1H-1HCOSY谱。
图8HetiamacinB在DMSO-d6中的HSQC谱。
图9HetiamacinB在DMSO-d6中的HMBC谱。
图10HetiamacinB在CDCl3中的ROESY谱。
图11HetiamacinC的高分辨质谱(HR-ESI-MS)。
图12HetiamacinC在CDCl3中的1H-NMR谱。
图13HetiamacinC在CDCl3中的13C-NMR谱。
图14HetiamacinC在CDCl3中的DEPT谱。
图15HetiamacinC在CDCl3中的1H-1HCOSY谱。
图16HetiamacinC在CDCl3中的HSQC谱。
图17HetiamacinC在CDCl3中的HMBC谱。
图18HetiamacinC在CDCl3中的ROESY谱。
图19HetiamacinD的高分辨质谱(HR-ESI-MS)。
图20HetiamacinD在CDCl3中的1H-NMR谱。
图21HetiamacinD在CDCl3中的13C-NMR谱。
图22HetiamacinD在CDCl3中的DEPT谱。
图23HetiamacinD在CDCl3中的1H-1HCOSY谱。
图24HetiamacinD在CDCl3中的HSQC谱。
图25HetiamacinD在CDCl3中的HMBC谱。
图26HetiamacinD在CDCl3中的ROESY谱。
图27HetiamacinB在DMSO-d6的1H-1HCOSY和HMBC示意图。
图28HetiamacinC在CDCl3中的1H-1HCOSY和HMBC示意图。
图29HetiamacinD在CDCl3中的1H-1HCOSY和HMBC示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，除HPLC制备甲醇为色谱纯级外，加入的其它各原料如无特别说明，均为市售分析纯级。
实施例1发酵培养HetiamacinB、C、D产生菌
将生长于斜面的枯草芽孢杆菌株PJS(Bacillussubtilissubsp.inaquosorumPJS)接种于种子培养基：改良高氏一号培养基(可溶性淀粉20.0g，NaCl50.0g，K2HPO40.5g，KNO31.0g，MgSO41.0g，FeSO40.02g，葡萄糖1.0g，蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.3g，1.0升无菌蒸馏水，pH8.0)中，每250毫升摇瓶中装50毫升改良高氏一号培养基，28℃，180rpm旋转摇床上培养24小时，然后以5％的接种量，转入发酵培养基(配方与种子培养基相同)，每5升摇瓶中装1升改良高氏一号培养基，在28℃于180rpm旋转摇床上培养48小时，收获发酵液。
实施例2HetiamacinB、C、D的提取、分离
实施例1所得的发酵液，离心(4500rpm，20min)后，布氏漏斗抽滤。滤液上样于HP-20型大孔树脂，分别用2-3倍柱体积的30％、50％、80％丙酮-水溶液洗脱，去丙酮的洗脱液冷冻干燥后分别获得30％丙酮-水溶液、50％丙酮-水溶液、80％丙酮-水溶液的粉末状粗品。
将50％丙酮-水的洗脱液获得的粉末状粗品溶解于少量甲醇，湿法上样于LiChroprepRP-C18中压柱(50g，粒径40-63μm，柱体积1×50cm)中，用甲醇-水进行分级梯度洗脱(30％甲醇-水150mL，60％甲醇-水200mL，90％甲醇-水200mL)，按5-6mL/管收集洗脱液。将60％甲醇水洗脱液进行LC-MS的检测，相同成分管合并后减压浓缩，得到分别含有不同目标化合物(MW＝449或463)的半纯品。
将半纯品溶于少量甲醇中，用高压液相色谱进行纯品制备：色谱柱为柱体积10×250mm，粒径5μm的YMC-PackODS-A型色谱柱；流动相为48％甲醇-水溶液；流速为2mL/min。分别收集254nm的紫外波长下出现在29min、26min、33min的色谱峰，将所得流分旋转蒸发除去甲醇，水溶液经冷冻干燥分别获得化合物HetiamacinB、HetiamacinC、HetiamacinD的纯品，纯度分别为98.2％、96.3％、95.6％。
实施例3HetiamacinB、C、D的结构鉴定
对实施例2所得纯品进行结构鉴定。本发明根据UV光谱(图1)、IR光谱(图2)、HR-ESI-MS(图3、图11、图19)，以及分别以DMSO-d6或CDCl3为溶剂的核磁共振光谱：1H-NMR(图4、图12、图20)、13C-NMR(图5、图13、图21)、DEPT谱(图6、图14、图22)、1H-1HCOSY相关谱(图7、图15、图23)、1H-13C相关谱HSQC(图8、图16、图24)、反向检测远程1H-13C异核多键相关谱HMBC(图9、图17、图25)、旋转坐标系中的二维核间奥氏效应谱(ROESY)(图10、图18、图26)的分析结果，确定了HetiamacinB、C、D的结构。
HetiamacinB为白色粉末，不溶于水，易溶于甲醇、氯仿、二甲基亚砜等有机溶剂。紫外吸收光谱显示其也在203nm，247nm和314nm有最大吸收(图1)，表明HetiamacinB具有Amicoumacin类化合物的母核结构。根据HR-ESI-MS数据(图3)，[M+H]+测量值为464.2389，理论值为464.2391，可知其分子量为463，分子式为C23H33O7N3,不饱和度为8。
HetiamacinB的13C-NMR和DEPT谱数据表明其23个碳信号中，含7个季碳，9个叔碳，3个仲碳，4个伯碳，结合1H-NMR、1H-1HCOSY、可知HetiamacinB有4个甲基碳，3个羰基碳，6个苯环碳，6个连接氮或氧的脂肪碳。1H-1HCOSY中化学位移为6.84的H-5和化学位移为6.81的H-7分别与化学位移为7.48的H-6耦合，形成t峰，耦合常数分别为8.4，7.2；HMBC中H-5与化学位移为108.3的C-8a远程耦合，H-6分别与140.7的C-4a和160.8的C-8远程耦合，表明HetiamacinB的结构中含有邻位的三取代苯环。在DMSO-d6溶剂中，C-8的化学位移160.8，表明C-8上连接一个酚羟基。在1H-1HCOSY中，H-1′，H-2′和H-4′都与化学位移为1.66的H-3′相关，表明3′-CH与1′-CH3，2′-CH3和4′-CH2相连接；在HMBC中，0.84的H-1′与0.88的H-2′都与化学位移为39.1的C-4′相关；同时1H-1HCOSY中化学位移为1.66的H-4′和化学位移为4.20的H-5′的相关峰表明了结构中4′-CH2与5′-CH相连，再加上1′-CH3，2′-CH3,3′-CH和4′-CH2的片段，构成了一个异戊基。在1H-1HCOSY(DMSO-d6溶剂)中，化学位移为2.85和3.03的H-4与4.69的H-3相关；在HMBC中，H-4与C-3、C-5′、C-4a、C-8a、C-5都相关，表明C-4应与C-4a和C-3相连。H-3和C-3的低场化学位移(4.69，81.1)表明C-3应与内酯环的氧原子连接，构成3，4-二氢-8-羟基异香豆素结构。在1H-1HCOSY(DMSO-d6溶剂)中，H-5′与7.64的6′-XH质子有相关峰，在HMBC中，6′-XH又与化学位移为172.7的7′-C＝O有相关峰，同时H-6′的低场位移7.64表明6′-XH为6′-NH，其与7′-C＝O相连形成一个酰胺基。通过HetiamacinB的1H-NMR、13C-NMR谱图与已经发表的Amicoumacin类抗生素相比对，发现其含有Amicoumacin化合物的骨架结构：甲基丁基氨基-3，4-二氢-8-羟基异香豆素。
1H-1HCOSY中，H-8′与H-9′，H-10′与H-11′相关，HMBC中H-8′与C-9′，H-9′与C-8′，H-8′与C-10′，H-9′与C-10′，H-9′与C-11′，H-11′与C-10′，H-11′与C-9′相关，推断存在结构片段-CH(8′)-CH(9′)-CH(10′)-CH2(11′)-。13C-NMR中低场化学位移为169.1的季碳信号表明12′-C＝O的存在，但是与已经发表的HetiamacinA(参见发明人的专利申请CN102977082A)谱图相比，缺少了相应1H-NMR图谱中与12′-C＝O相连的-OH的低场宽峰信号，推断12′-C＝O非羧基碳，而可能是酰胺基碳。HMBC中H-11′和C-12′有弱相关峰推测C-12′与H-11′相连。根据1H和13C-NMR数据，H-9′和C-9′的化学位移分别为3.64，73.5，H-8′和C-8′的化学位移分别为3.9，72.4，H-10′和C-10′的化学位移分别为3.19，48.2，且1H-1HCOSY中H-8′与8′-OH(5.59,d,6.0)相关，H-9′与9′-OH(4.97,d,5.4)相关，推测H-8′与8′-OH相连，H-9′与9′-OH相连。
在1H-NMR中，化学位移1.18和1.27处有两个明显的甲基单峰信号，在HSQC中，两个甲基质子信号分别与位移为28.4和30.6的碳信号相关，在HMBC中，化学位移为1.18和1.27的H均与化学位移为66.8的季碳信号有弱相关，说明存在14′-C(CH3)2的结构片段。66.8的14′-季碳信号在HMBC中还与化学位移为7.74，积分为1H的活泼氢(该信号在HSQC相关谱中无对应C信号)有弱相关，结合HetiamacinB的元素组成和低场的化学位移，推断该活泼氢信号为13′-NH。在HMBC中可见13′-NH也与C-11′相关，说明C-14′，13′-NH，C-12′相连。根据N规则，分子量为463的HetiamacinB应有奇数个N，所以，结构中应还存在一个N原子。通过元素组成和不饱和度计算，推测侧链中应存在一个六氢嘧啶环，由10′-CH，11′-CH，12′-C＝O，13′-NH，14′-CH2和一个化学位移在1.92左右的15′-NH组成，在1H-NMR中可见15′-NH被邻位10′-H裂分为二重峰(J＝12.6Hz)，另外在HMBC中，化学位移1.92的15′-NH与化学位移为28.4的C-16′相关，化学位移为1.27的H-17′与化学位移为169.1的12′-C＝O相关，佐证了这个六氢嘧啶环结构。同时，也说明了化学位移为1.27的为H-17′，化学位移为1.18为H-16′。HetiamacinB的结构如式(1)所示。其在DMSO-d6的NMR数据如表1所示。
表1.和田霉素(Hetiamacin)B在DMSO-d6中的NMR数据
注a.1H-NMR数据为600MHz采集；b.13C-NMR为150MHz采集c.酚羟基质子在DMSO-d6中未观察到，但在CDCl3为溶剂可观察到
化合物HetiamacinC与HetiamacinD均为淡黄色粉末。不溶于水，易溶于甲醇、氯仿、二甲基亚砜、吡啶等有机溶剂，在203nm，247nm和314nm有最大紫外吸收。根据HR-ESI-MS数据，HetiamacinC的[M+H]+测量值为450.2252，理论值为450.2248，推出HetiamacinC分子量为449，结合13C-NMR谱和DEPT谱，推出HetiamacinC分子式为C22H31O7N3,不饱和度为8；HetiamacinD的[M+H]+测量值为464.2388，理论值为464.2391，推出HetiamacinD分子量为463，结合13C-NMR谱和DEPT谱，推出HetiamacinD分子式为C23H33O7N3,不饱和度为8。
根据HetiamacinC和HetiamacinD的紫外光谱，结合1H-NMR、13C-NMR的化学位移和1H-1HCOSY、HSQC、HMBC谱图数据，可知HetiamacinC和HetiamacinD含有Amicoumacin化合物的骨架结构：甲基叔丁基氨基-3，4-二氢-8-羟基异香豆素。对照已解析的HetiamacinB在CDCl3中的1H-NMR和13C-NMR图谱，表明HetiamacinC、HetiamacinD与HetiamacinB的结构极其相似。
HetiamacinC分子量为449，分子式为C22H31O7N3。分析HetiamacinC的13C-NMR和DEPT谱，发现HetiamacinC的22个碳信号中，含6个季碳，10个叔碳，3个仲碳，3个伯碳，相比HetiamacinB，HetiamacinC在化学位移20～30间少了一个甲基碳。1H-NMR中，在δ(0.8-1.5)内只含有3个甲基氢信号，比HetiamacinB少一个甲基信号，HetiamacinC的分子量(MW＝449)相比HetiamacinB(MW＝463)少14，也印证了这一推测。DEPT谱中，HetiamacinB在60～70间的14’位季碳消失，而在63.9多了一个叔碳信号，该信号在HSQC中与化学位移为4.44积分为1个质子氢信号相关，说明14’位为CH。在1H-1HCOSY中，化学位移为1.33的H-16’与化学位移为4.44的H-14’相关，说明16’-CH3与14’-CH相连，而14’-CH由于缺少一个甲基相连，化学位移从HetiamacinB中的68.2移向高场63.9。以上分析证明HetiamacinC的结构如式(2)所示。
HetiamacinD分子量为463，分子式为C23H33O7N3。分析HetiamacinD的13C-NMR和DEPT谱，发现HetiamacinD的23个碳信号中，含6个季碳，10个叔碳，4个仲碳，3个伯碳。对比HetiamacinB和HetiamacinC的谱图，HetiamacinD在13C-NMR的高场明显多出一个化学位移为8.64的伯碳，其在HSQC中与化学位移为1.00左右，积分为3个氢质子信号17’-CH3相连。13C-NMR和DEPT显示化学位移68.8处的14’-C为叔碳，在HSQC中与化学位移为4.26，积分为1个氢质子信号14’-CH相连；同时，化学位移29.4处(16’-C)存在一个仲碳，且在HMBC中与末端甲基17’-H有弱相关，根据元素组成和分子量计算，16’应该存在一个亚甲基结构(16’-CH2),在HSQC中，16’-C与化学位移1.63的质子信号相关，通过1H-NMR积分面积观察，发现化学位移1.63附近峰覆盖了3个积分的氢质子，推断16’-CH2中的2个质子被H-3’峰所覆盖。1H-1HCOSY显示16’-CH2与17’-CH3和H-14’相关；表明存在CH(14’)—CH2(16’)—17’(CH3)。根据以上结果，推断HetiamacinD的结构如式(3)所示。HetiamacinC和HetiamacinD在CDCl3溶剂的1H-NMR和13C-NMR的信号归属如表2所示。
实施例4HetiamacinB、C、D的抗菌谱活性测定
利用实施例2所得化合物进行活性测定。最低抑菌浓度(MIC)的测定按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法进行。具体实施步骤为：分别将HetiamacinB、C、D溶解在DMSO中，母液浓度为1.28mg/ml，用培养基溶液将药物倍比稀释，倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔100μl，第12孔不加药作为生长对照。细菌的活性测定培养基使用NCCLS推荐的Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基，pH7.2-7.4。直接取培养18～24h的菌落用生理盐水调配成0.5麦氏比浊标准(1～2×108CFU/ml)的菌悬液。用MH肉汤将待测细菌菌悬液进行1:1000稀释后，每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16～20h判断结果。结果判定：在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。HetiamacinB、C、D对常见临床致病菌的抑菌活性如表3所示。
表2.和田霉素(Hetiamacin)C和D在CDCL3中的NMR数据
注a.1H-NMR数据为600MHz采集；b.13C-NMR为150MHz采集
表3.和田霉素(Hetiamacin)B、C、D的抗菌谱
结果表明，HetiamacinB、C、D对革兰氏阳性菌葡萄球菌属具有抑制作用，对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)都有一定的抑制活性，其中HetiamacinB的抑菌活性最强，MIC值均在1-2μg/ml范围内；HetiamacinC的抑菌MIC值在4-8μg/ml范围内；HetiamacinD的抑菌MIC值在8-16μg/ml范围内。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详细的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.和田霉素B、C、D的制备方法，所述和田霉素B、C、D的结构如式(1)、(2)、(3)所示：
(1)和田霉素B
(2)和田霉素C
(3)和田霉素D
其特征在于，制备方法包括如下步骤：
首先发酵培养保藏编号为CGMCCNo.6688的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilissubsp.inaquosorum)PJS；
然后从发酵物中提取、分离所述的和田霉素B、C、D；
所述发酵培养步骤为：将保藏编号为CGMCCNo.6688的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilissubsp.inaquosorum)PJS接种于种子培养基上培养，然后转入发酵培养基培养，培养成熟后收获发酵液；
所述提取、分离步骤包括：发酵液经离心、布氏漏斗抽滤后，以3-4BV/h的速度通过HP-20型大孔树脂，流出液弃去；用1-2BV体积的蒸馏水洗涤树脂层，再分别用2-3BV的30％、50％、80％丙酮-水溶液洗脱树脂，除去洗脱液中丙酮，获得的水溶液经冷冻干燥后分别获得30％丙酮-水溶液、50％丙酮-水溶液、80％丙酮-水溶液洗脱出的粉末状粗品；而后50％丙酮-水溶液洗脱的粉末状粗品用甲醇溶解，湿法上样于RP-C18中压柱，用甲醇-水进行分级梯度洗脱，即30％甲醇-水溶液150mL，60％甲醇-水溶液200mL，90％甲醇-水溶液200mL，按5-6mL/管收集洗脱液；60％甲醇-水洗脱液进行LC-MS的检测，含相同成分的管合并后减压浓缩，得到分别含有不同目标化合物的半纯品，其中所述目标化合物的MW＝449或463；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，以48％甲醇-水溶液，2mL/min的流速进行等度洗脱，分别收集254nm紫外波长下出现在29min、26min、33min附近的色谱峰，除去甲醇的水溶液经冷冻干燥，得到白色或浅黄色粉末状的成品化合物即和田霉素B、C、D。
2.枯草芽孢杆菌在生产由权利要求1所述方法制备的和田霉素B、C、D中的应用，所述枯草芽孢杆菌为保藏编号为CGMCCNo.6688的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilissubsp.inaquosorum)PJS。
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