CN107652262B - 一种Amicoumacin异香豆素类化合物的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于农药技术领域，涉及一种天然amicoumacin异香豆素类化合物PM‑94128的制备方法和用途。该化合物具有如式I所示化学结构，本发明提供了一种从类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）菌株发酵产物中制备该类化合物的方法，以及其在制备农作物杀菌剂中的用途。实验研究表明，该化合物对水稻稻瘟病（Pyricularia oryzae）、玉米柄锈(Puccinia polysra)和黄瓜霜霉病（Pseudoperonospora cubenis）均具有不同程度的抗菌作用，可开发其在制备农作物杀菌剂中的用途。

Description

一种Amicoumacin异香豆素类化合物的制备方法及用途

技术领域

本发明属于农药技术领域，涉及从植物内生细菌Paenibacillus sp.xy-2发酵产物中提取分离得到的一种amicoumacin异香豆素类化合物PM-94128的制备方法和在制备农用杀菌剂中的用途。

背景技术

Amicoumacin异香豆素类化合物是一类化学结构独特、生物活性显著的微生物次级代谢产物。目前从自然界中发现的该类化合物约有40余个，且大多从Bacillus属海洋细菌中发现。据文献报道，这类化合物具有显著的抗溃疡、抗肿瘤、抗细菌等医用生物活性。特别是最初分离自海洋细菌Bacillus sp.发酵液的PM-94128，能通过抑制DNA及蛋白质合成(对DNA的IC₅₀＝2.5μM，对蛋白质的IC₅₀＝0.1μM)，对多种肿瘤细胞具有极强的细胞毒活性(对P388,A549,HT29,MEL28的IC₅₀均为0.05μM)。本发明所涉及的amicoumacin异香豆素类化合物的制备方法及其抗农作物病原菌活性迄今在国内外尚未见有相关专利或文献报道。

发明内容

本发明提供一种从类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)发酵产物中提取分离得到amicoumacin异香豆素类化合物的方法及其在制备农作物杀菌剂中的用途。

本发明是为了从植物内生菌次级代谢产物中寻找具有显著生物活性的物质，对由中国各地区采集到的植物的内生菌(细菌、真菌和放线菌)进行了筛选，发现植物内生菌类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)发酵提取物具有较好的农用病原菌生长抑制活性，进而对该菌株进行大量培养发酵和代谢产物的系统分离，进而从中得到了本发明所涉及的化合物，并通过各种波谱手段鉴定其为amicoumacin异香豆素类化合物PM-94128，其结构如式I所示。

本发明的制备技术方案包括如下步骤：

(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)菌株接种到液体培养基中发酵培养，得发酵培养液，发酵培养液经离心得到发酵液和菌丝体。

(2)向发酵液中加入HP20大孔树脂，摇床震荡吸附。过滤去除发酵液，向吸附后的HP20大孔树脂中加入有机溶剂，解吸，摇床震荡，过滤，得到解吸液，将解吸液减压浓缩得到粗提物。

(3)将粗提物经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0～0:100的二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:5～100:6的洗脱物再经二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:9～100:11的溶液洗脱，洗脱物再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用甲醇洗脱，并经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积配比为70:30～60:40的甲醇-水溶液为流动相洗脱，得式I化合物。

其中，步骤(1)中，所述的发酵培养为：类芽孢杆菌Paenibacillus sp.经复苏后，从斜面转移到装有培养液(培养基重量体积百分组成：淀粉0.8～1.2％，酵母膏0.3-0.5％，蛋白胨0.1～0.3％，加水配制)的三角瓶中，于25～30℃摇床上150～200rpm振荡培养2～3天后作为种子培养液。然后将种子培养液按5～10％的接种量接种到含有新鲜、灭菌的液体培养基(培养基重量体积百分组成：淀粉0.8～1.2％，酵母膏0.3-0.5％，蛋白胨0.1～0.3％，加水配制)的三角瓶中，在室温条件下150～200rpm摇床培养5～7天,获得发酵培养液。

步骤(2)中HP20大孔树脂的用量为15～25g/L；摇床震荡吸附的转数为150～200rpm，吸附时间为1～2h。

所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮等，解吸2～3次，每次150～200rpm摇床震荡解吸1～2h/次。

式I化合物为白色结晶(甲醇)，10％硫酸乙醇溶液(v/v)不显色，茚三酮加热显紫红色。

(C 0.08，CH₃OH)。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)谱中，δ_Η7.41(1Η,d,J＝7.6Hz,-CONH)为酰胺质子信号；δ_Η7.42(1Η,t,J＝8.0Hz,H-6),6.88(1H,d,J＝8.0Hz,H-7),6.70(1H,d,J＝8.0Hz,H-5)为邻三取代苯环质子信号；δ_Η4.63(1H,d,J＝12.4Hz,H-3),4.11(1H,d,J＝8.4Hz,H-8′),3.32(1H,dd,J＝8.4,6.2Hz,H-9′)为连氧次甲基质子信号；δ_Η4.35(1H,m,H-5′),2.99(1H,m,H-10′)为两个次甲基质子信号；δ_Η3.08(1H,dd,J＝16.2,2.7Hz,H-4a),2.83(1H,dd,J＝16.2,2.7Hz,H-4b)为相互偶合的亚甲基质子信号；δ_Η1.85(2H,m,H-4′a,11′a),1.75(1H,m,H-3′),1.64(1H,m,H-12′),1.50(1H,m,H-4′b),1.21(1H,m,H-11′b),0.90-0.98(12H,m,H-1′,2′,13′,14′)为两组异丁基信号。其¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)谱中，有2个羰基碳信号δ_C 175.1(C-7′),169.6(C-1)；6个sp²杂化碳信号δ_C 162.1(C-8),139.4(C-4a),136.6(C-6),118.2(C-5),116.2(C-7),108.1(C-8a)；14个sp³杂化碳信号δ_C 81.0(C-3),74.6(C-8′),73.5(C-9′),54.9(C-10′),48.6(C-5′),43.7(C-11′),40.4(C-4′),30.3(C-4),24.8(C-3′),24.0(C-12′),23.6(C-13′),23.0(C-14′),21.9(C-1′),21.0(C-2′)。以上数据与文献对照基本一致，故确定了该化合物的平面结构。

该化合物的8′,9′位的相对构型是通过偶合常数确定的，根据capon规则，用Newman投影式，得到该化合物的优势构象，一般苏式构象偶合常数小于4Hz，赤式构象偶合常数大于5Hz，该化合物8′与9′偶合常数为8.4Hz，因此8′,9′位为赤式构象。该化合物的绝对构型是通过CD谱数据和文献对比确定的，即在其CD谱中，259nm处呈现负的Cotton效应(Δε-37.29)，确定3位为S构型；同时，在221,240,315nm分别呈现正的和负的Cotton效应(Δε+11.13,+39.11,-12.99)，确定8′,9′,10′位分别为S,S,S构型，故鉴定该化合物为PM-94128。

本发明还提供所述化合物在制备农作物杀菌剂中的应用。

本发明对所得到的式I化合物进行了抗农作物病原菌活性的研究。实验结果表明，该化合物对水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae，RB)、玉米柄锈(Puccinia polysra，CSR)和黄瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubenis，CDM)，均具有不同程度的生长抑制作用，特别是较低浓度下(25mg/L)，对水稻稻瘟病的抑制率为100％。因此，本发明所述的amicoumacin异香豆素类化合物具有制备农作物杀菌剂的前景。

本发明的优点在于，所述提取分离方法简易高效，重现性好，化合物含量高，且具有很好的抗农作物病原菌的活性。

本发明的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，菌株已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期：2016年4月25日，保藏编号为CGMCC No.12403。

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：式I化合物的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：类芽孢杆菌Paenibacillus sp.xy-2经复苏后，从斜面转移到装有液体培养基的三角瓶中(每瓶培养基组成：淀粉1.0％，酵母膏0.4％，蛋白胨0.2％，加水配制至150mL)，于28℃摇床上180rpm振荡培养2～3天后作为种子培养液。然后将种子液按5～10％的接种量接种到含有新鲜、灭菌的液体培养基(培养基组成如上)的三角瓶中，在28℃下180rpm摇床培养5天,共获得发酵培养液约30L。

2粗提物的获得

发酵培养液经6000rpm离心得到菌丝体和发酵液。向发酵液中加入HP20大孔树脂(20g/L)，180rpm摇床震荡约2h。过滤去除发酵液，向吸附后的HP20大孔树脂中加入适量的甲醇解吸三次，每次180rpm摇床震荡2h，过滤，得到甲醇解吸液，将甲醇解吸液减压浓缩得到粗提物19.6g。

3化合物的分离精制

甲醇粗提物(19.6g)经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0～0:100的二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:5～100:6的洗脱物再经二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:9～100:11洗脱，洗脱物再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用甲醇洗脱，并经半制备高效液相色谱进行纯化，使用长度为250mm，内径为10mm的色谱柱，以粒径为5μm的ODS为填料，以甲醇-水70:30～60:40为流动相洗脱，t_R为10～15min，得式I化合物约300mg，纯度>90％。

实施例2：式I化合物对水稻稻瘟病、玉米柄锈病和黄瓜霜霉病的抑菌实验：

a.离体孢子萌发测定法：将化合物溶解在甲醇中作为供试品溶液。在无菌条件下，将供试品溶液和水稻稻瘟菌孢子悬液分别加入到96孔板中，并将96孔板放入恒温培养箱中，24h后检测化合物对孢子萌发的抑制情况。化合物对病原菌的抑制率用0-100％来表示，抑制率为0％表示侵染病原菌组孢子萌发率和空白对照组没有差别，抑制率为100％表明能完全抑制孢子的萌发。

b.活体喷雾保护测定法：将化合物溶解在2mL丙酮中，加入含0.05％Tween-80的水配置成400mg/L的药液20mL，用立体作物喷雾机分别均匀喷洒到两叶期黄瓜苗和玉米苗上，自然阴干。24h后，用接种器将黄瓜霜霉和玉米柄锈病原菌的孢子悬浮液喷雾于上述寄主植物上，然后移入人工气候室培养。实验材料培养24h后，移置温室正常管理。4-7d后，考察化合物的杀菌活性。以未加药液处理的、全部变黄或有明显病变的叶子作为空白对照，通过目测抑制病原菌生长的百分比(没有被感染的叶片面积与空白对照进行比较)来估算化合物的活性，化合物对病原菌的抑制率可用0-100％来表示。如果抑制率为0％，表明处理后的植株和没有加药的空白植株没有区别；如果抑制率为100％，表明这个化合物可以完全抑制病原菌的感染。

表1.式I化合物的对水稻稻瘟菌(Pyricularia oryzae，RB)、玉米柄锈菌(Puccinia polysra，CSR)和黄瓜霜霉菌(Pseudoperonospora cubenis，CDM)的抑制率(％)

实验结果(表1)表明，式I化合物显示出对水稻稻瘟病、玉米柄锈和黄瓜霜霉病均具有不同程度的的生长抑制作用，特别是较低浓度下(25mg/L)，对水稻稻瘟病的抑制率为100％，有望开发其在制备农用杀菌剂中的用途。

Claims (4)

1.式I所示的amicoumacin异香豆素类化合物的制备方法，其特征在于，

（1）将类芽孢杆菌Paenibacillus sp.菌株接种到液体培养基中发酵培养，得发酵培养液，发酵培养液经离心得到发酵液和菌体，所述类芽孢杆菌的保藏编号为：CGMCC No.12403；

（2）向发酵液中加入HP20大孔树脂，摇床震荡吸附，过滤去除发酵液，向吸附后的HP20大孔树脂中加入有机溶剂解吸，摇床震荡后过滤，得到解吸液，将解吸液减压浓缩得到粗提物；

（3）将粗提物经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:5-100:6的洗脱物再经二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:9-100:11的溶液洗脱，洗脱物再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用甲醇洗脱，并用半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积配比为70:30-60:40的甲醇-水溶液为流动相洗脱，即得

步骤（1）中所述的发酵培养为：类芽孢杆菌属菌株Paenibacillus sp.经复苏后，从斜面转移到装有液体培养基的三角瓶中，于25-30 °C摇床上150-200 rpm振荡培养2-3天后作为种子培养液，然后将种子液按5-10 %的接种量接种到含有新鲜、灭菌的液体培养基的三角瓶中，在室温条件下150-200 rpm摇床培养, 即得；

所述液体培养基的重量体积百分组成为：淀粉 0.8-1.2%，酵母膏0.3-0.5%，蛋白胨0.1-0.3%，加水配制。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，大孔树脂的加入量为15-25 g/L，摇床振荡的转数为150-200 rpm，时间为1-2 h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮；有机溶剂解吸的次数为2-3次，摇床振荡的转数为150-200 rpm，时间为1-2 h/次。

4.权利要求1所述的制备方法制备的式I所示的amicoumacin异香豆素类化合物在制备抑制水稻稻瘟病、玉米柄锈病或黄瓜霜霉病的农药中的应用；

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