CN103319496B - 来源于海洋疣孢菌的多环聚酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类来源于海洋疣孢菌的多环聚酮类化合物及其制备方法与应用。所述化合物的结构式如式I所示，其中，R为式II或OH或OCH3。该类化合物是从疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS100128 CGMCC No.5847发酵液中分离纯化得到的。活性测试结果表明，式I化合物具有抗结核活性。
Description
技术领域
本发明涉及一类来源于海洋疣孢菌的多环聚酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
疣孢菌属(Verrucosispora)属于放线菌目小单孢菌科(Micromonosporaceae)，目前只有3个种被正式报道，为Verrucosispora gifhornensis HR1-2T，Verrucosispora luteaYIM 013T和Verrucosispora sediminis MS426T，且已发现的疣孢菌属菌株不多，对其次生代谢产物的报道也很少。2004年Fiedler研究组从疣孢菌AB-18-032次级代谢产物中得到了结构新颖的多环聚酮类化合物abyssomicin B～D，其中abyssomicin C强烈抑制革兰氏阳性菌的生长，甚至对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的生长具有强烈的抑制作用。2008年Fiedler和Süssmuth还对另外一株疣孢菌V.gihornensis MG-37进行了深入的化学分离工作，得到一系列新型抗肿瘤的氨基呋喃化合物，命名为proximicinsA～C。选择该属的菌种进行深入的活性天然产物研究，对发现新结构、新活性的化合物具有良好的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一类来源于海洋疣孢菌的多环聚酮类化合物及其制备方法。
本发明所提供的多环聚酮类化合物，其结构式如式I所示：
(式I) (式II)
其中，R为式II或OH或OCH3。
当R为式II时(化合物MS100128-1)，其结构式如式III所示：
(式III)
当R为OH时(化合物MS100128-3)，其结构式如式IV所示：
(式IV)
当R为OCH3时(化合物MS100128-6)，其结构式如式V所示：
(式V)
上述式I化合物药学上可接受的盐、酯及溶剂合物也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的制备所述多环聚酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS100128进行液体发酵培养，收集发酵液；
2)对所述发酵液进行离心，取上清液，从上清液中分离得到所述多环聚酮类化合物。
其中，所述疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS100128也属于本发明的保护范围，其已于2012年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No.5847。
所述液体发酵培养的培养基由下述物质组成：淀粉、葡萄糖、甘油、玉米浆粉、细菌蛋白胨、酵母提取物、NaCl、CaCO3和水；
以上成分在培养基中的浓度分别为：淀粉10g/L、葡萄糖10g/L、甘油10g/L、玉米浆粉2.5g/L、细菌蛋白胨5g/L、酵母提取物2g/L、NaCl1g/L和CaCO33g/L。
所述培养基的pH值为7.2-7.5。
所述液体发酵培养的条件为：在28℃旋转震荡培养5-6天；所述旋转的转速为200-220rpm。
从上清液中分离得到多环聚酮类化合物的方法，包括如下步骤：
a)将所述上清液进行以大孔吸附树脂为吸附剂的柱层析分离，以丙酮-水为洗脱剂进行梯度洗脱，分别收集体积分数为55％-60％丙酮水溶液的洗脱组分和体积分数为75％-80％丙酮水溶液的洗脱组分；
b)将收集的体积分数为55％-60％丙酮水溶液的洗脱组分浓缩除丙酮后经反相硅胶柱层析，以乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集体积分数为30％-35％乙腈水溶液的洗脱组分；将体积分数为30％-35％乙腈水溶液的洗脱组分经反相HPLC分离，以体积分数为42％-45％的乙腈水溶液为流动相进行洗脱，得到式I中R＝OH的化合物和式I中R＝OCH3的化合物；
c)将收集的体积分数为75％-80％丙酮水溶液的洗脱组分浓缩除丙酮后经反相硅胶柱层析，以乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集体积分数为80％-90％乙腈水溶液的洗脱组分；将体积分数为80％-90％乙腈水溶液的洗脱组分经反相HPLC分离，以体积分数为85％-87％的乙腈水溶液为流动相进行洗脱，得到式I中R＝式II的化合物。
其中，步骤a)中所述大孔吸附树脂的型号具体可为HP-20。
步骤a)中梯度洗脱的具体条件如下：依次用H2O、体积分数20％、40％、60％、80％的丙酮水溶液进行洗脱，分别收集体积分数60％的丙酮洗脱组分和体积分数80％的丙酮洗脱组分；每个梯度可洗脱3-4倍柱体积。
步骤b)和步骤c)中所述反相硅胶柱层析中所用的硅胶柱具体可为ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)柱。
步骤b)中梯度洗脱的具体条件如下：依次体积分数20％、35％、50％、75％的乙腈水溶液进行洗脱，收集体积分数35％的乙腈洗脱组分；每个梯度可洗脱3-4倍柱体积。
步骤b)中反相HPLC分离的具体色谱条件如下：色谱柱为Agilent ZORBAX SB反相色谱柱，RP-18，9.4*250mm，检测波长254nm。
步骤c)中梯度洗脱的具体条件如下：依次体积分数40％、65％、90％的乙腈水溶液进行洗脱，收集体积分数90％的乙腈洗脱组分；每个梯度可洗脱3-4倍柱体积。
步骤c)中反相HPLC分离的具体色谱条件如下：色谱柱为AgilentZORBAX SB反相色谱柱，RP-18，9.4*250mm，检测波长254nm。
本发明的另一个目的是提供式I化合物的应用。
本发明所提供的式I化合物的一个应用为其在制备结核分枝杆菌抑制剂中的应用。
所述结核分枝杆菌具体可为Mycobacterium bovis牛型结核分支杆菌减毒株bacillus Calmette-Guérin BCG(Pasteur1173P2)菌株。
本发明提供的式I化合物的另一个应用为其在制备抗结核药物中的应用。
本发明还保护一种结核分枝杆菌抑制剂，它的有效成分为式I所示的多环聚酮类化合物。
此外，以式I所示的多环聚酮类化合物为有效成分制备的抗结核药物，也属于本发明的保护范围。
所述抗结核药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
上述抗结核药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明提供的化合物MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6，属于新的多环聚酮类化合物，该化合物具有抗结核活性。本发明所用的微生物发酵方法选择了能产生具有抗结核活性化合物的疣孢菌Verrucosispora sp.MS 100128，提取方法成熟，工艺简便，所得产物产率高，经核磁共振、质谱检测，其结构正确。
附图说明
图1为本发明制备的化合物MS100128-1的紫外谱图。
图2为本发明制备的化合物MS100128-3的紫外谱图。
图3为本发明制备的化合物MS100128-6的紫外谱图。
图4为本发明制备的化合物MS100128-1的质谱图。
图5为本发明制备的化合物MS100128-3的质谱图。
图6为本发明制备的化合物MS100128-6的质谱图。
图7为本发明制备的化合物MS100128-1溶于CDCl3中的1H-NMR谱图。
图8为本发明制备的化合物MS100128-3溶于CDCl3中的1H-NMR谱图。
图9为本发明制备的化合物MS100128-6溶于CDCl3中的1H-NMR谱图。
图10为本发明制备的化合物MS100128-1溶于CDCl3中的13C-NMR谱图。
图11为本发明制备的化合物MS100128-3溶于CDCl3中的13C-NMR谱图。
图12为本发明制备的化合物MS100128-6溶于CDCl3中的13C-NMR谱图。
图13为本发明制备的化合物MS100128-1溶于CDCl3中的1H-1HCOSY谱。
图14为本发明制备的化合物MS100128-3溶于CDCl3中的1H-1HCOSY谱。
图15为本发明制备的化合物MS100128-6溶于CDCl3中的1H-1HCOSY谱。
图16为本发明制备的化合物MS100128-1溶于CDCl3中的HSQC谱图。
图17为本发明制备的化合物MS100128-3溶于CDCl3中的HSQC谱图。
图18为本发明制备的化合物MS100128-6溶于CDCl3中的HSQC谱图。
图19为本发明制备的化合物MS100128-1溶于CDCl3中的HMBC谱图。
图20为本发明制备的化合物MS100128-3溶于CDCl3中的HMBC谱图。
图21为本发明制备的化合物MS100128-6溶于CDCl3中的HMBC谱图。
图22为本发明制备的化合物MS100128-1溶于甲醇中的圆二色谱(CD)图。
图23为本发明制备的化合物MS100128-3溶于甲醇中的圆二色谱(CD)图。
图24为本发明制备的化合物MS100128-6溶于甲醇中的圆二色谱(CD)图。
图25为疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS100128基于16S rRNA基因序列的系统进化树。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中所用的可溶性淀粉购自北京化工厂，产品目录号为K0800034；细菌蛋白胨购自碧迪医疗器械(上海)有限公司，产品目录号为211677；酵母提取物购自北京奥博星生物技术有限责任公司，产品目录号为01-012；麦芽酵母提取物购自北京奥博星生物技术有限责任公司，产品目录号为01-129。
实施例1、疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS100128的分离和鉴定
一、菌株疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS 100128的分离
菌株来源样品：采自中国南海深海(海拔-2733米)的海泥样品。
菌株分离方法：
湿热稀释涂布法，具体操作方法如下：
取1.0g土样，将其放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，180rpm摇2h，于20KHz、100W功率超声2min；取1.0ml悬浊液，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，混匀；取1.0ml悬浊液，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，混匀；系列稀释10-3和10-4；盖紧管盖，于100℃保温1h，取0.2ml涂板。
菌株分离培养基的配制方法如下：
燕麦片20g，人工海水1000ml，小火20min后过滤取滤液，定容到1000ml，加入琼脂粉20g。
菌株保藏方法：于25％甘油冻存管-80℃保藏。
二、菌株疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS 100128的鉴定
菌株16S rDNA序列为序列表中序列1所示。
菌株16S rDNA序列测定及其系统发育分析方法如下：
用TINAamp Bacteria DNA Kit试剂盒，按试剂盒说明提取MS100128基因组DNA，用通用引物(27f：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492r：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)对其进行16S rDNA扩序。16S rDNA的PCR扩增反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler上进行[25μL扩增体系：0.4μL 20μM引物，2.5μL 10×缓冲液(TaKaRa，中国大连)，2.5μL 2.5nM dNTP(TaKaRa，Dalian，China)，2U rTap聚合酶(TaKaRa，中国大连)，1μL DNA模板]，94℃初次变性5分钟，然后94℃变性1min，循环30次，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟15秒，最后72℃延伸10min.将PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆送测序公司。利用CLSSTAL W序列分析软件对将获得的16SrRNA序列进行多序列比对分析。并利用MEGA4.0软件中的邻接法生成系统发育树(图25)，步缺值设定：1000。
结果：根据菌落形态特征及16S rRNA基因序列结果表明MS100128属于疣孢菌，与模式菌株Verrucosispora gifhornensis HR1-2T在16S rRNA基因序列相似性达100％。
三、菌株疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS 100128的保藏
疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS 100128已于2012年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5847。
实施例2、制备多环聚酮类化合物
一、发酵制备多环聚酮类化合物
1、种子培养
(1)将平板培养基在121℃下灭菌20分钟，制成平板，于37℃恒温培养3天。至表面水分稍干，无杂菌生长时，将疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS100128(保藏编号：CGMCC No.5847)菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养7天，外观为橘黄至橘红色，气生菌丝丰满，无染菌时即可收取使用，即得到平板菌种。
所述平板培养基由以下成分组成：酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为(g/L)：酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、葡萄糖4g/L和琼脂20g/L；所述斜面培养基的pH值为7.2。
(2)在多个250mL玻璃瓶中分别装入40mL种子培养基，于121℃下灭菌20分钟，由平板挖块接种。于28℃在旋转摇床旋转培养(转速为220rpm)48小时，得到种子液。
所述种子培养基由以下成分组成：淀粉、葡萄糖、甘油、玉米浆粉、细菌蛋白胨、酵母提取物、NaCl、CaCO3和水；
以上成分在所述液体培养基中的浓度分别为：淀粉10g/L、葡萄糖10g/L、甘油10g/L、玉米浆粉2.5g/L、细菌蛋白胨5g/L、酵母提取物2g/L、NaCl1g/L和CaCO33g/L。所述种子培养基的pH值为7.5。
2、发酵培养
然后配制发酵培养基(培养基成份：淀粉10g/L；葡萄糖10g/L；甘油10g/L；玉米浆粉2.5g/L；细菌蛋白胨5g/L；酵母提取物2g/L；NaCl1g/L；CaCO33g/L，其余为水，调pH值为7.5)。在1000mL的三角瓶中分装300mL发酵培养基，灭菌后按照5％(体积百分比)的接种量将上述步骤1得到的种子液接种于发酵培养基，于28℃旋转培养(转速为220rpm)5天后收获发酵液。发酵液为容器内的所有物质。
二、分离纯化多环聚酮类化合物并鉴定
1、分离纯化多环聚酮类化合物
将上述实验一得到的发酵液于4℃条件下进行离心，8000转/min，离心15min，收集上清液。将上清液通过三菱HP-20大孔吸附树脂(购自北京慧德易科技有限公司)(1升)吸附，水洗后用分别用体积百分比为20％、40％、60％和80％的丙酮水溶液(各3升)洗脱，取各洗脱液50-100mL用旋转蒸发仪浓缩蒸干，称重，并分别用DMSO溶解配制成4mg/mL的溶液，然后用细胞培养液梯度稀释成浓度分别为2000μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL和3.125μg/mL的待测样品溶液，用于抗BCG的活性测试。抗BCG活性测试对Mycobacterium bovis牛型结核分支杆菌减毒株bacillus Calmette-Guérin BCG(Pasteur 1173P2)菌株的抑制活性，结果显示活性部分集中在60％和80％丙酮洗脱部分。
抗BCG活性测试具体操作为：将Mycobacterium bovis牛型结核分支杆菌减毒株bacillus Calmette-Guérin BCG(Pasteur 1173P2)菌株接入含有40mL 7H9培养基(培养基成份：4.7g 7H9培养基粉末，2mL甘油，0.5mL Tween80，900mL水和100mL经过滤灭菌的增菌剂OADC)的250mL规格三角瓶中，于37℃旋转培养(转速为60rpm)7天后获得BCG菌液。分装40μL 7H9培养基到96孔培养板各个孔；转移2μL待测化合物的DMSO溶液(浓度为4mg/mL开始，进行二倍梯度稀释8次，浓度依次为2000μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL和31.25μg/mL)到96孔培养板中；配OD600为0.50-0.55之间浓度的BCG菌液，加入96孔培养板中每孔40μL。96孔培养板置于37℃培养箱中培养72小时后，使用酶标仪测定吸光度值OD600。异烟肼为正对照，DMSO为负对照。生长被抑制90％以上的孔所对应的化合物终浓度即为该化合物对BCG的最低抑菌浓度MIC值。结果显示活性部分集中在60％和80％丙酮洗脱部分，其MIC值分别为100μg/mL和50μg/mL。
收集60％丙酮洗脱液(约3升)，将收集的60％丙酮洗脱液通过旋转蒸发仪除去丙酮后，浓缩，将浓缩液进行ODS(5μm)中压柱层析(购自北京慧德易科技有限公司)，依次用体积百分比为20％、35％、50％、75％的乙腈水溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3倍柱体积，收集体积分数为35％乙腈水溶液的洗脱组分，浓缩后经反相HPLC制备，分别收集具备如所述化合物类似紫外特征的部分，得到17.5mg纯化产物MS 100128-3和15.1mg纯化产物MS100128-6。反相HPLC的制备条件为：AgilentZORBAX SB反相色谱柱，RP-18，9.4*250mm，检测波长254nm，流动相为体积百分比浓度为45％乙腈水溶液。
收集80％丙酮洗脱液(约3升)，将收集的80％丙酮洗脱液通过旋转蒸发仪除去丙酮后，浓缩，将浓缩液进行ODS(5μm)中压柱层析(购自北京慧德易科技有限公司)，依次用体积百分比为40％、65％、90％的乙腈水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱3倍柱体积，收集90％的乙腈洗脱液，浓缩后再经反相HPLC制备，收集具备如所述化合物类似紫外特征的部分，得到23.0mg纯化产物MS 100128-1。反相HPLC的制备条件为：Agilent ZORBAX SB反相色谱柱，RP-18，9.4*250mm，检测波长254nm，流动相为体积百分比浓度为85％乙腈水溶液。
2、鉴定多环聚酮类化合物MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6
将上述得到的MS 100128-1进行鉴定：
(1)外观：均为无定形白色粉末。
(2)溶解性：易溶于甲醇、氯仿，难溶于水。
(3)紫外光谱：MS100128-1甲醇溶液的紫外光谱在296.0，267.0和202.0nm处有最大吸收峰。MS100128-3甲醇溶液的紫外光谱在296.0，264.0和202.0nm处有最大吸收峰。MS100128-6甲醇溶液的紫外光谱在296.0，265.0和204.0nm处有最大吸收峰。三者紫外光谱分别见图1、图2和图3。紫外光谱测试仪器为Mariner System 5304instrument。
(4)质谱：图4是MS100128-1的HRESIMS质谱图，显示其[M+H]+峰为m/z749.2602，并提供MS100128-1的最可能分子式为C38H46O12S。图5是MS100128-3的HRESIMS质谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 363.1449，并提供MS100128-3的最可能分子式为C19H24O7。图6是MS100128-6的HRESIMS质谱图，显示其[M-H]-峰为m/z377.1606，并提供MS100128-6的最可能分子式为C20H26O7。HRESIMS图谱测试采用Bruker APEX III7.0T spectrometer。甲醇为溶剂。
(5)核磁共振谱：图7、图8和图9分别是MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6的1H-NMR谱图。图10、图11和图12分别是MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6的13C-NMR谱图。根据化合物的1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY(图13、图14和图15)，HSQC(图16、图17和图18)和HMBC(图19、图20和图21)，对3个化合物的核磁共振谱进行了研究并对13C信号进行了归属，见表1和表2。并最终确定结构如下(式III为MS100128-1的结构式；式IV为MS100128-3的结构式；式V为MS100128-6的结构式)：
(式III)
(式IV)
(式V)
表1MS100128-113C-NMR谱各峰归属
表2MS100128-3和MS100128-613C-NMR谱各峰归属
MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6的NMR测试采用Bruker 600MHz (1H600MHz；13C150MHz)。溶剂为CDCl3(溶剂峰校正δH7.26/δC 77.00)。
(6)CD谱特征：MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6的CD谱特征见图22、图23和图24。测试仪器为JASCOJ-815Spectropolarimeter，CH3OH为溶剂。
(7)旋光值：MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6的[α]24 D值分别为+188、+44和+101。测试仪器为Perkin-Elmer Model 343polarimeter。采用钠光谱D线(589.3nm)测定，测定管长度1dm。溶剂为甲醇，浓度0.05g/mL。
3、检测化合物MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6的抗结核活性
抗BCG活性测试法检测了MS100128-1、MS100128-3和MS100128-6对BCG菌株的生存抑制活性(检测方法与上述步骤1相同)。结果显示3个化合物的MIC值分别为3.125μg/mL、25μg/mL和大于100μg/mL。
Claims (8)
1.结构式如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R为式Ⅱ或OH或OCH3。
2.制备权利要求1中式I所示化合物的方法，包括下述步骤：
1)将疣孢菌(Verrucosispora sp.)MS100128 CGMCC No.5847进行液体发酵培养，收集发酵液；
2)对所述发酵液进行离心，取上清液，从上清液中分离得到式I所示化合物；
步骤2)中所述从上清液中分离得到式I所示化合物的方法，包括如下步骤：
a)将所述上清液进行以大孔吸附树脂为吸附剂的柱层析分离，以丙酮-水为洗脱剂进行梯度洗脱，分别收集体积分数为55％-60％丙酮水溶液的洗脱组分和体积分数为75％-80％丙酮水溶液的洗脱组分；
b)将收集的体积分数为55％-60％丙酮水溶液的洗脱组分浓缩除丙酮后经反相硅胶柱层析，以乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集体积分数为30％-35％乙腈水溶液的洗脱组分；将体积分数为30％-35％乙腈水溶液的洗脱组分经反相HPLC分离，以体积分数为42％-45％的乙腈水溶液为流动相进行洗脱，得到式Ⅰ中R＝OH的化合物和式Ⅰ中R＝OCH3的化合物；
c)将收集的体积分数为75％-80％丙酮水溶液的洗脱组分浓缩除丙酮后经反相硅胶柱层析，以乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集体积分数为80％-90％乙腈水溶液的洗脱组分；将体积分数为80％-90％乙腈水溶液的洗脱组分经反相HPLC分离，以体积分数为85％-87％的乙腈水溶液为流动相进行洗脱，得到式Ⅰ中R＝式Ⅱ的化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述液体发酵培养的培养基由下述物质组成：淀粉、葡萄糖、甘油、玉米浆粉、细菌蛋白胨、酵母提取物、NaCl、CaCO3和水；所述物质在培养基中的浓度分别为：淀粉10g/L、葡萄糖10g/L、甘油10g/L、玉米浆粉2.5g/L、细菌蛋白胨5g/L、酵母提取物2g/L、NaCl1g/L和CaCO3 3g/L；
所述培养基的pH值为7.2-7.5；所述液体发酵培养的条件为：在28℃旋转震荡培养5-6天；所述旋转的转速为200-220rpm。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述大孔吸附树脂的型号为HP-20；
步骤a)中所述梯度洗脱的条件如下：依次用H2O、体积分数20％、40％、60％、80％的丙酮水溶液进行洗脱，分别收集体积分数60％的丙酮洗脱组分和体积分数80％的丙酮洗脱组分；每个梯度可洗脱3-4倍柱体积。
步骤b)中梯度洗脱的条件如下：依次体积分数20％、35％、50％、75％的乙腈水溶液进行洗脱，收集体积分数35％的乙腈洗脱组分；每个梯度可洗脱3-4倍柱体积；
步骤c)中梯度洗脱的具体条件如下：依次体积分数40％、65％、90％的乙腈水溶液进行洗脱，收集体积分数90％的乙腈洗脱组分；每个梯度可洗脱3-4倍柱体积。
5.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备结核分枝杆菌抑制剂中的应用。
6.一种结核分枝杆菌抑制剂，其活性成分为权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
7.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗结核药物中的应用。
8.一种抗结核药物，其活性成分为权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
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