CN110092758B - 一种新型生物碱化合物及发酵制备该化合物的疣孢菌株 - Google Patents

一种新型生物碱化合物及发酵制备该化合物的疣孢菌株 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物代谢技术领域，具体涉及一种新型生物碱化合物，并进一步公开了一种用于发酵制备该化合物的疣孢菌株。本发明所述生物碱化合物是基于申请人筛选的疣胞菌Verrucosispora gifhornensis.FIM06‑0036进行发酵代谢所得，所得生物碱类化合物具有较强的革兰氏阴性杆菌幽门螺杆菌抑制活性，可作为潜在的具有抗菌活性药物，以应对日益严重的细菌耐药性问题，为新药创制提供候选化合物，具有较高的要用应用价值。

Description

一种新型生物碱化合物及发酵制备该化合物的疣孢菌株
技术领域
本发明属于微生物代谢技术领域，具体涉及一种新型生物碱化合物，并进一步公开了一种用于发酵制备该化合物的疣孢菌株。
背景技术
从微生物次生代谢产物中寻找有活性的化合物作为先导化合物创制新药是世界药学工作者公认的有效途径之一，而微生物资源更是为创新药物研究提供无穷的源泉。微生物丰富多样的次生代谢产物为化学药物新药研究与开发提供了大量极为珍贵的模式结构和药物前体小分子，是药物发现源头创新和持续创新的重要物质基础，对整个创新药物的研究具有决定性意义。
细菌和真菌是当今感染的最主要的感染因子，抗菌治疗是针对感染性疾病的最主要手段，临床上用于抗菌治疗的药物品种众多，但也导致病原菌的耐药率逐年升高。因此，不断开发新的具有抗菌活性的先导化合物，为新药研发提供研究方向具有重要且积极的意义。
长期以来，陆生资源尤其是链霉菌是筛选天然活性化合物的主要来源菌，然而，随着大多数链霉菌菌株被反复研究，从陆生资源中发现新活性化合物的难度越来越大，因而，人们把开发海洋天然产物作为寻找新活性化合物的重要突破口。由于海洋环境具有高盐、低温、黑暗、低氧、寡营养等特点，使得海洋微生物形成了有别于陆地微生物的代谢机制，并且能够代谢产生更多有别于陆生微生物的结构新颖、活性独特的天然产物。目前已从海洋放线菌中发现许多新的活性化合物，如含氮杂环类、大环内酯类、肽类、氨基糖苷类、醚类、酮类和萜类等，并以此开发出诸多具有抗菌活性的先导并实现临床应用。
疣孢菌(Verrucosispora)属于放线菌目小单孢菌科(Micromonosporaceae)，是近年来发现的新种属。1998年Rheims等从沼泽淤泥中最早分离到疣孢菌，之后国内外研究者陆续从海洋沉积物、红树林、海鞘和海绵等中分离到该属菌种，并经代谢获得诸多结构新颖且有活性化合物。例如，2004年Riedlinger等从一株来自日本海289米深海底泥样的疣孢菌AB-18-032的代谢产物中分离得到一类多环聚酮类抗生素abyssomicin B-D，并验证abyssomicin C可强烈抑制革兰氏阳性菌的生长。又如，2008年德国Tübingen大学Fiedler教授等从来自挪威250米深海泥的Verrucosispora sp.MG-37的代谢物中分离得到三个抗癌活性很强的新化合物proximicin A-C，Proximicins是一类呋喃衍生物，其特征性结构元件4-氨基呋喃-2-羧酸是一种罕见的γ-氨基酸，国外已将它作为新的抗肿瘤候选药物进行深入研究，而其产生菌Verrucosispora sp.MG-37后被鉴定为疣孢菌的新种Verrucosispora feidleri sp.Nov。另外，2011年报道来自日本广岛海鞘的Verrucosispora gifhornensis YM28-088产生了雄激素拮抗剂萜类新化合物gifhornenolone A、B以及已知化合物cyperusol C；2011年Thomas从一株分离自美国佛罗里达群岛海绵的Verrucosispora sp.的代谢产物中得到五个新的环二聚硫环缩肽类的thiocoraline类似物，对A549肺腺癌细胞具有显著的细胞毒活性。可见，基于疣孢菌进行发酵代谢，并从中筛选结构新颖或者新作用机制的抗菌药物以应对多药耐药菌具有积极的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种新型生物碱化合物，该化合物具有较好的抗菌活性，并进一步提供一种基于微生物发酵方法制备该生物碱化合物的方法；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种疣孢菌株，并进一步提供该疣孢菌株用于发酵代谢制备所述生物碱化合物的用途和方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种新型生物碱化合物，具有如下所示的结构：
Figure BDA0002009273470000031
本发明还公开了所述的生物碱化合物用于制备抗菌药物的用途。
本发明还公开了由所述生物碱化合物制备的具有抗菌活性药物制剂。
本发明还公开了一种疣孢菌株，其分类命名为Verrucosisporagifhornensis.FIM06-0036，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16548，保藏日期为2018年09月28日。
本发明还公开了所述的疣孢菌株用于发酵制备所述生物碱化合物的用途。
本发明还公开了一种发酵代谢生产所述生物碱化合物的方法，包括将所述的疣孢菌株接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
具体的，所述发酵培养基包括如下组分：蛋白胨1.0-3.0g/L，糖蜜4.0-6.0g/L，蔗糖15.0-25.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.05-0.2g/L，CaCO3 4.0-6.0g/L，KI 0.4-0.7g/L，海水配制，调pH7.5。
优选的，所述发酵培养基包括如下组分：蛋白胨2.0g/L，糖蜜5.0g/L，蔗糖20.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO3 5.0g/L，KI 0.5g/L，海水配制，灭菌前pH7.5，121℃高温灭菌30min，备用。
具体的，所述方法还包括将所述菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下组分：可溶性淀粉12.0-18.0g/L，酵母粉4.0-6.0g/L，蛋白胨4.0-6.0g/L，葡萄糖4.0-6.0g/L，K2HPO4 0.4-0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g/L，海盐15.0-18.0g/L，(NH4)2SO4 0.4-0.6g/L，CaCO3 0.8-1.2g/L，纯水配制，调pH7.5。
更优的，所述种子培养基包括如下组分：可溶性淀粉15.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，海盐16.5g/L，，(NH4)2SO40.5g/L，CaCO3 1.0g/L，纯水配制，灭菌前pH7.5，121℃高温灭菌30min，备用。
具体的，所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述固体斜面培养基包括如下组分：可溶性淀粉15.0-25.0g/L，天冬素0.4-0.6g/L，海盐15.0-18.0g/L，KNO3 0.8-1.2g/L，K2HPO4 0.4-0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g/L，CaCO3 0.8-1.2g/L，琼脂10.0-15.0g/L，纯水配制，自然pH值。
更优的，所述固体斜面培养基包括如下组分：可溶性淀粉20.0g/L，天冬素0.5g/L，海盐16.5g/L，KNO3 1.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO3 1.0g/L，琼脂12.0g/L，纯水1000mL，自然pH值。
进一步的，所述方法还包括对所述生物碱化合物进行提取的步骤，具体包括：
(1)收集发酵液经固液分离，分别得到菌丝体和上清夜；
(2)取收集的菌丝体加甲醇进行超声提取，并经减压浓缩去除甲醇得到浸膏Ⅰ；
(3)将所得浸膏Ⅰ与收集的上清液合并，并加入乙酸乙酯进行萃取，并经减压浓缩去除乙酸乙酯，得到浸膏Ⅱ；
(3)将所得浸膏Ⅱ加入硅胶拌样，以干湿法装柱后，用体积比为10：1-1：1的氯仿-甲醇溶剂进行洗脱；
(4)收集洗脱液，以体积比1：2的石油醚：乙酸乙酯为展层剂、紫外灯显色进行TLC检测，合并相同组份，并收集TLC检测Rf值为0.44的组分；
(5)取组份3经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，合并相同组份，并收集Rf值为0.48的组分；
(6)收集组份2经反相C18色谱柱层析制备，以体积比75：100的乙腈-水进行洗脱，合并相同组分，并收集Rf值为0.52的组分，获得所需生物碱化合物。
本发明所述生物碱化合物是基于申请人筛选的疣胞菌Verrucosisporagifhornensis.FIM06-0036进行发酵代谢所得，并利用正相硅胶、反相C18柱层析和SephadexLH-20柱层析等方法，对该疣孢菌株的抗菌活性次级代谢产物进行分离和纯化，所得生物碱类化合物具有较强的革兰氏阴性杆菌幽门螺杆菌抑制活性，可作为潜在的具有抗菌活性药物，以应对日益严重的细菌耐药性问题，为新药创制提供候选化合物，具有较高的要用应用价值。
本发明筛选的疣胞菌Verrucosispora gifhornensis.FIM06-0036菌株，经由常规发酵代谢，其次级代谢产物中可分离得到新型生物碱化合物，进一步验证了海洋微生物作为抗菌化合物代谢菌株的多样性，也为从疣孢菌次生代谢产物中筛选新型抗菌活性化合物并建立抗菌活性化合物的分离纯化工艺做出了贡献。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1是菌株FIM06-0036的系统发育树；
图2是菌株FIM06-0036在营养琼脂培养基中的单菌落形态图；
图3是菌株FIM06-0036的扫描电镜图；
图4是化合物FW-1的HRESI-TOF-MS谱；
图5是化合物FW-1的1H-NMR谱；
图6是化合物FW-1的13C-NMR谱；
图7是化合物FW-1的DEPT135谱；
图8是化合物FW-1的1H-1H COSY谱；
图9是化合物FW-1的HMBC谱；
图10是化合物FW-1的HSQC谱；
图11是化合物FW-1的NOESY谱；
图12是化合物FW-1主要的1H-1H COSY和HMBC相关。
具体实施方式
实施例1 菌株筛选及培养
申请人从福建东海海绵中筛选获得一株菌株，菌株编号为FIM06-0036。
无菌条件下，将菌株FIM06-0036用接种环接种到如下ISP1-ISP7的琼脂斜面培养基上，于32℃培养2-5d，观察记录FIM06-0036在不同培养基中的培养特征(见表1)。
ISP1培养基(g/L)：胰胨0.5，酵母膏0.3，琼脂2，蒸馏水1L，灭菌前pH7.2-7.5；
ISP2培养基(g/L)：酵母膏0.4，麦芽膏1，葡萄糖0.4，琼脂2，蒸馏水1L，灭菌前pH7.3；
ISP3培养基(g/L)：燕麦粉2，琼脂2，微量元素1mL，琼脂2，蒸馏水1L，灭菌前pH7.4；
ISP4培养基(g/L)：可溶性淀粉10.0，K2HPO4 1.0，MgSO4 1.0，NaCl 1.0，(NH4)2SO42.0，CaCO3 2.0，微量元素1mL，琼脂2，蒸馏水1L，灭菌前pH 7.2；
ISP5培养基(g/L)：L-天冬素1.0，K2HPO4 1.0，甘油10.0，琼脂20.0，微量元素1mL，琼脂2，蒸馏水1L，灭菌前pH 7.2-7.4；
ISP6培养基(g/L)：胨-铁-琼脂36.0，酵母膏1.0，琼脂2，蒸馏水1L，灭菌前pH 7.2-7.4；
ISP7培养基(g/L)：甘油1.5，L-酪氨酸0.05，L-天冬素0.1，K2HPO4 0.05，MgSO40.05，NaCl 0.05，微量元素1mL/L，琼脂1.5，蒸馏水1L，灭菌前pH 7.2-7.4；微量元素溶液(g/L)：FeSO4·7H2O 0.1，MnCl·4H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，蒸馏水100mL。
表1 FIM06-0036在不同培养基中的培养特征
培养基 生长状况 基丝颜色
ISP1 ++ Moderate Orange Yellow(71)
ISP2 +++ Deep Brown(56)
ISP3 +++ Deep Orange Yellow(69)
ISP4 +++ Moderate Orange(53)
ISP5 + Light Orange(52)
ISP6 +++ Deep Orange Yellow(69)
ISP7 +-++ Light Orange(52)
注：+++，生长良好；++，生长一般；+，生长差；-，不生长；颜色与色值参照ISCC-NBC标准。注：+++表示生长良好；++表示生长一般；+表示生长差；-表示不生长；颜色与色值参照ISCC-NBC标准。
本实施例中以微生物在单一碳源条件下的生长速率来表征微生物对这种碳源的利用强度。
选用如下ISP9基础培养基进行测试，选取如下21种碳源进行碳源的筛选：包括蜜二糖、棉籽糖、D-甘露糖、L-木糖、肌醇、水杨素、L-鼠李糖、卫矛醇、山梨醇、二硫苏糖醇、D-半乳糖、甜醇、七叶苷、赤藓醇、纤维二糖、阿东糖醇、松三糖、海藻糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖和甲壳素。每种碳源添加量为0.8g/L，以不加碳源作为对照，每个处理进行3个重复。
ISP9基础培养基(g/L)：K2HPO4 5.65，KH2PO4 2.38，(NH4)2SO4 2.64，MgSO4·7H2O1.0，琼脂12.0，碳源1.0，微量元素1mL，蒸馏水1000mL，pH 7.5；微量元素配制：CuSO4·5H2O0.64g，FeSO4·7H2O 0.11g，ZnSO4·7H2O 0.15g，MnCl2·4H2O 0.79g，蒸馏水100mL。
在无菌条件下，将保存的菌株FIM06-0036用接种环接种到上述含有不同碳源的ISP9基础培养基培养皿平板上，于32℃倒置培养，不同培养时间记录结果并同空白比较，分析碳源利用的结果(见下表2)。
表2 菌株FIM06-0036碳源利用情况
碳源 FIM06-0036
蜜二糖 -
棉籽糖 -
D-甘露糖 -
L-木糖 -
肌醇 -
水杨素 -
L-鼠李糖 +
卫矛醇 +
山梨醇 -
二硫苏糖醇 -
D-半乳糖 +
甜醇 -
七叶苷 ±
赤藓醇 -
纤维二糖 +
阿东糖醇 -
松三糖 -
海藻糖 +
L-阿拉伯糖 -
D-葡萄糖 +
甲壳素 +
空白对照 -
注：+表示可以完全利用；±表示可以部分利用；-表示完全不能利用
实施例2 菌株16S rRNA鉴定
取上述培养至对数生长期的FIM06-0036菌液5mL，8000r/min离心15min，倾去上清液，收集菌体。采用CTAB/NaCl法提取菌体基因组DNA，具体操作步骤如下：菌体中加入1.35mLTE溶液(pH8.0)，悬浮，加入0.3mL10％十二烷基硫酸钠(SDS)和150μL、100mg/ml溶菌酶和150μL、100mg/mL蛋白酶K，混匀，于60℃水浴1h，加0.25mL、5mol/LNaCl和0.2mLCTAB/NaCl溶液，于65℃进行水浴10min，并以等体积的苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇各抽提3次，于10000r/min离心10min，吸取上清液，加入0.6倍体积异丙醇，放置于-20℃沉淀DNA，收集DNA溶于50μL TE中，-20℃保存备用。
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增后的DNA产物送至上海生物工程有限公司进行测序。用BLAST软件与NCBI的GenBank数据库收录的16S rRNA序列进行比对分析，Blast搜索同源序列。
本实施例菌株FIM06-0036的系统发育树如图1所示，其与疣胞菌Verrucosisporagifhornensis DSM 44337T的16S rRNA基因序列的相似性为99.79％，综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，确定菌株FIM06-0036为疣胞菌Verrucosispora。
筛选菌株FIM06-0036在营养琼脂培养基中的单菌落形态图如图2所示，其扫描电镜图如附图3所示。
将上述鉴定后的疣胞菌Verrucosispora gifhornensis.FIM06-0036保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.16548，保藏日期为2018年09月28日。
实施例3 菌株的发酵
将上述筛选的菌株FIM06-0036置于高氏天冬素琼脂斜面进行活化保存。
所述高氏天冬素琼脂斜面培养基包括如下组分(g/L)：可溶性淀粉20.0g，天冬素0.5g，海盐16.5g，KNO3 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0g，琼脂12.0g，纯水1000mL，自然pH值。
取一铂环上述保存的菌株FIM06-0036高氏天冬素琼脂斜面培养物接入种子培养液中，于32℃-35℃、220-240rpm条件下进行摇床培养培养2-3d，得到菌株FIM06-0036的种子培养液。
所述种子培养液包括如下组分(g/L)：可溶性淀粉15.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5，海盐16.5g，，(NH4)2SO4 0.5g，CaCO31.0g，纯水配制，灭菌前pH7.5，121℃高温灭菌30min，备用。
将上述菌株FIM06-0036的种子培养液以5-10％的接种量接种到如下发酵培养基中于，于28℃、240rpm条件下进行摇床培养培养4-5d，得到菌株FIM06-0036的发酵培养液。
所述发酵培养基包如下组分(g/L)：蛋白胨2.0g，糖蜜5.0g，蔗糖20.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.1g，CaCO3 5.0g，KI 0.5g，海水配制，灭菌前pH7.5，121℃高温灭菌30min，备用。
实施例4 化合物的提取
将上述实施例3中得到的疣孢菌Micromonospora sp.FIM06-0036的发酵培养液(20L)于4500rpm条件下进行离心处理15min，得到菌丝体和上清夜；取菌丝体加入2.0倍体积的甲醇超声提取2次，控制超声温度低于40℃，超声时间30min，随后于低于40℃进行减压浓缩以去除甲醇，得到浸膏Ⅰ(150g)；将所得浸膏Ⅰ与前述收集的上清液合并，并加入3.0倍体积的乙酸乙酯(1：1，v:v)进行萃取3次，在低于40℃进行减压浓缩以去除乙酸乙酯得到浸膏Ⅱ(123g)；所得浸膏Ⅱ用等量的200-300目硅胶拌样，并以湿法装柱后，用氯仿/甲醇(9：1，v：v)进行洗脱，洗脱液经TLC检测，展层剂为石油醚/乙酸乙酯＝1：2(v：v)，紫外灯显色，合并相同组份，收集TLC检测Rf值为0.44的组分(112mg)，再经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂进行洗脱处理，合并相同组份，收集Rf值为0.48的组分(63mg)，最后经反相C18色谱柱层析制备，以乙腈/水(75：100，v：v)进行洗脱，合并相同组分，收集Rf值为0.52的组，分获得单体化合物FW-1(12.4mg)。
实施例5 化合物结构鉴定
对上述提取得到的化合物FW-1进行质谱和核磁共振等数据测试，从而确定化合物的结构。
提取所得化合物FW-1为淡黄色油状物，其UV(MeOH)，λmax：220nm，274nm和325nm；如图4给出的HRESI-TOF-MS谱，HR-TOF-MS(m/z 225.1595[M+H]+(Calcd for 224.1523)，推测化合物的相对分子量为224，再结合如图5所示的1H-NMR和图6所示的13C-NMR波谱数据(详见表3)，确认化合物分子式为C12H20N2O2，计算其不饱和度为4。
如图5所示的1H NMR(CDCL3-d6，500MHz)显示有10组氢信号[δ7.77,d(J＝0.8)、δ7.85,d(J＝0.8)、δ4.22,m、δ1.68,m、δ1.34,m、δ0.89,t(J＝7.5)、δ1.42,m、δ1.30,m、δ1.31,m和δ0.93,t(J＝7.5)]。由图6所示的13C-NMR(in CDCL3-d6,125MHz)和图7所示的DEPT135(CDCL3-d6,125MHz)谱图可以得出，化合物FW-1总共含有12个碳信号，其中2个季碳信号(δ130.4和δ162.6)、3个次甲基碳信号(δ126.1、δ137.2和δ38.9)、5个亚甲基碳信号(δ67.1、δ30.4、δ23.8、δ22.9和δ28.9)和2个甲基碳信号(δ11.0和δ14.0)。
在如图8所示的1H-1H COSY谱图中，根据H-H偶合关系可以得到片段H10-H9-H8、片段H4’-H3’-H2’-H1’以及片段H7-H8；在如图9所示的HMBC谱图中，根据C-H耦合关系可以看出以上片段通过-8C-即H4’-H3’-H2’-H1’-C8-H9-H10进行连接，再结合如图10所示的HSQC谱图和图11所示的NOESY图谱，进一步确认以上片段间的连接关系。而在HMBC图谱中还可以得到7位H与6位C有耦合关系，再者5位H同6位C和4位C也有耦合关系，这又可以得到以下结构片段7C-O-6C-4C-5C。
综合以上分析，得到化合物FW-1的全部碳信号和氢信号归属(见表3)。最后依据不饱和度以及分子量确定了化合物FW-1的主要的1H-1H COSY和HMBC相关如图12所示，可见，所提取化合物的结构如下：
Figure BDA0002009273470000121
表3 化合物FW-1的1H NMR和13C NMR核磁数据
δ<sub>C</sub> δ<sub>H</sub> COSY HMBC
1
2 126.1,CH 7.77,d(J＝0.8) 5H 4C,5C
3
4 130.4,qC
5 137.2,CH 7.85,d(J＝0.8) 2H 2C,4C,6C
6 162.6,qC
7 67.1,CH<sub>2</sub> 4.22,m 8H 6C,8C
8 38.9,CH 1.68,m 7H,9H,1’H 7C,9C,1’C
9 30.4,CH<sub>2</sub> 1.34,m 8H,10H 8C,10C
10 11.0,CH<sub>3</sub> 0.89,t(J＝7.5) 9H 9C
1’ 23.8,CH<sub>2</sub> 1.42,m 8H,2’H 7C,8C,9C,2’C
2’ 22.9,CH<sub>2</sub> 1.30,m 1’H,3’H 8C,1’C,3’C
3’ 28.9,CH<sub>2</sub> 1.31,m 2’H,4’H 2’C,4’C
4’ 14.0,CH<sub>3</sub> 0.93,t(J＝7.5) 3’H 2’C,3’C
经SciFinder和INSPEC等数据库检索，未发现有与其相同结构的化合物，表明其是一个新结构的生物碱类化合物。
实施例6 化合物抗菌活性测试
采用微量肉汤稀释法，以头孢噻肟钠为阳性对照品，测试本发明提取化合物FW-1的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。测试菌包括：
革兰氏阴性菌:幽门螺杆菌(H.pylori)ATCC 43504、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC 4352；
革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 25923和粪肠球菌(E.faecalis)ATCC 2921。具体操作步骤如下：
MH肉汤培养基配制：称取MH肉汤培养基21.0g，加入到1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于试管中，121℃高压灭菌15min，备用；
测试菌前期培养：无菌条件下，将测试菌接种到100mL MH肉汤培养基中，置于35℃培养箱培养12h备用；
贮存液制备：分别称取适量待测样品和阳性对照品，阳性对照品用1mL无菌水溶解，待测样品用1mL甲醇溶解，各自贮存液的初浓度应该大于1000μg/mL；
测试菌溶液的制备：无菌条件下，将上述培养好的大肠杆菌(CMCC 44113)用MH肉汤校正到0.5麦氏单位浊度标准后按1：20的比例进行稀释，此时菌液浓度约为5×106CFU/mL，备用；
贮存液稀释和接种测试菌：无菌操作，取无菌的96孔板一个，除第一孔加入160μLMH肉汤外，其余每孔均加入MH肉汤100μL，在第1孔加入待测样品原液40μL混匀，然后吸取100μL至第2孔，混匀后在吸取100μL至第3孔混匀，如此连续倍比稀释至倒数第3孔，并从倒数第3孔总吸取100μL弃去。倒数第2孔为不含药物的生长对照，最后1孔为未接种的对照。然后在每孔中加入上述制备好的测试菌液，使每孔最终的菌液浓度约为5×105CFU/mL；
孵育：将已接种测试菌的96孔板盖好盖子，置35℃生化培养箱中培育16-20h，记录结果；
MIC终点判读：用肉眼在96孔板中所见能完全抑制细菌生长的为该样品对该种细菌的最低抑制浓度。
测试结果如下表4所示。
表4 抑菌试验测定结果
类别 FW-1 头孢噻肟钠
幽门螺杆菌 8μg/ml 28μg/ml
肺炎克雷伯氏菌 64μg/ml 30μg/ml
金黄色葡萄球菌 16μg/ml 6μg/ml
粪肠球菌 256μg/ml 128μg/ml
可见，本发明经代谢筛选的生物碱化合物对革兰氏阴性杆菌幽门螺杆菌具有较强的抑制活性，具有作为抗菌先导药物的研发潜力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种生物碱化合物用于制备抗菌药物的用途，其特征在于，所述生物碱化合物具有如下所示的结构：
Figure FDA0003060942460000011
2.一种疣孢菌株，其分类命名为Verrucosispora gifhornensis.FIM06-0036，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16548。
3.权利要求2所述的疣孢菌株用于发酵制备权利要求1中所述生物碱化合物的用途。
4.一种发酵代谢生产权利要求1中所述生物碱化合物的方法，其特征在于，包括将权利要求2所述的疣孢菌株接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分：蛋白胨1.0-3.0g/L，糖蜜4.0-6.0g/L，蔗糖15.0-25.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L，FeSO4·7H2O0.05-0.2g/L，CaCO3 4.0-6.0g/L，KI 0.4-0.7g/L，海水配制，调pH7.5。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下组分：可溶性淀粉12.0-18.0g/L，酵母粉4.0-6.0g/L，蛋白胨4.0-6.0g/L，葡萄糖4.0-6.0g/L，K2HPO4 0.4-0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g/L，海盐15.0-18.0g/L，(NH4)2SO4 0.4-0.6g/L，CaCO3 0.8-1.2g/L，纯水配制，调pH7.5。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述固体斜面培养基包括如下组分：可溶性淀粉15.0-25.0g/L，天冬素0.4-0.6g/L，海盐15.0-18.0g/L，KNO3 0.8-1.2g/L，K2HPO4 0.4-0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g/L，CaCO3 0.8-1.2g/L，琼脂10.0-15.0g/L，纯水配制，自然pH值。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述生物碱化合物进行提取的步骤，具体包括：
(1)收集发酵液经固液分离，分别得到菌丝体和上清夜；
(2)取收集的菌丝体加甲醇进行超声提取，并经减压浓缩去除甲醇得到浸膏Ⅰ；
(3)将所得浸膏Ⅰ与收集的上清液合并，并加入乙酸乙酯进行萃取，并经减压浓缩去除乙酸乙酯，得到浸膏Ⅱ；
(3)将所得浸膏Ⅱ加入硅胶拌样，以干湿法装柱后，用体积比为10：1-1：1的氯仿-甲醇溶剂进行洗脱；
(4)收集洗脱液，以体积比1：2的石油醚：乙酸乙酯为展层剂、紫外灯显色进行TLC检测，合并相同组份，并收集TLC检测Rf值为0.44的组分；
(5)取组份3经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，合并相同组份，并收集Rf值为0.48的组分；
(6)收集组份2经反相C18色谱柱层析制备，以体积比75：100的乙腈-水进行洗脱，合并相同组分，并收集Rf值为0.52的组分，获得所需生物碱化合物。
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