JP5826406B2 - ストレプトマイセス、抗腫瘍化合物スピロインディマイシン（Ｓｐｉｒｏ−Ｉｎｄｉｍｙｃｉｎ）Ａ−Ｄ、その製造方法及び使用、並びに、該スピロインディマイシンを含む抗腫瘍剤及び薬物 - Google Patents

Description

本発明は、工業微生物分野に関し、特に、多種抗腫瘍化合物を生産することができるストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株、当菌により生産した抗腫瘍化合物スピロインディマイシンＡ−Ｄ、並びに、その製造方法及び使用に関する。

近年、新たな海洋放線菌資源の発見とそこからの新規な活性二次代謝産物のスクリーニングが、国際海洋微生物研究の重要な方向性となっている。海洋放線菌から発見された新規構造を有し高効率で低毒性の代謝物は、薬物の新たな供給源となりつつある。

本発明の第１の目的は、２０１１年７月１８日に中国典型培養保蔵センター（住所：中国武漢市武漢大学、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関）に受託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１１２５８として寄託した新規ストレプトマイセス属菌、ＳＣＳＩＯ０３０３２株を提供することである。

本発明の新規ストレプトマイセス属菌、ＳＣＳＩＯ０３０３２株は、インド洋（Ｅ８７°５９．７’、Ｎ９°５９．３’）の深さ３４１２メートルの海底堆積物から分離して獲得した。

１．形態学的性質並びに生理学的及び生化学的分析
ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株は、グラム陽性の好気性放線菌である。その基生菌糸は僅かに黄色の分枝であり、気菌糸は灰色の分枝でコイル状の胞子鎖に分化する。胞子は、楕円状（図２）で、０．４−０．７μｍの長さで、滑らかな表面を有している。ＰＤＡ培地上での成長は弱い。ＩＳＰ５上では成長がみられ、可溶性色素を産生する。カタラーゼ、ウレアーゼ、牛乳の凝固及びペプトン化反応は陽性であり、ゼラチン液化、メラニン産生、及びオキシダーゼ反応は陰性である。また、デンプン、セルロース、Ｔｗｅｅｎ２０、４０、８０を加水分解することができ、硫化水素の生成と硝酸塩還元反応は陰性である。Ｄ−アラビノース、Ｄ−セロビオース、フルクトース、イノシトール、ピルビン酸ナトリウム、Ｄ−ラフィノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルボース、及びキシリトールを、唯一の炭素源およびエネルギー源として利用し成長できるが、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−トレハロース、及びＤ−キシロースを利用することはできない。メトキシピリミジン及びリンコマイシンへの感受性がある。ｐＨ、塩濃度、及び温度の許容範囲は、それぞれ、ｐＨ６．０−９．０、０−９％、及び１５−４０℃である。細胞壁にＬ−ＤＡＰを含有する。主なキノンはＭＫ−９（Ｈ６）及びＭＫ−１１であり、主な脂肪酸はｉ−Ｃ_１５：０（８％）、ｉ−Ｃ_１６：０（２４％）、ｉ−Ｃ_１６：１Ｇ（１４％）、ａｉ−Ｃ_１７：０（１５％）、及びａｉ−Ｃ_１７：１Ａ（１２％）である。Ｇ＋Ｃのモル含有量は７１．６（±０．５）％である。

２．分子生物学的同定
ＳＣＳＩＯ０３０３２株の１６Ｓ ｒＤＮＡを従来のＰＣＲ法で増幅し配列を決定した。その配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す。その後、ＧｅｎＢａｎｋ中の１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列を用いてＢＬＡＳＴ解析を行った。その結果、当株はストレプトマイセス・スペシャリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉａｌｉｓ）ＧＷ４１−１５６４Ｔ株と９７％の類似性を示した。ストレプトマイセス属の進化系統樹を作成すると、そのグループの一つにＳＣＳＩＯ０３０３２株がまとまることから、ＳＣＳＩＯ０３０３２株がストレプトマイセス属に所属することが分かった。図１に示すように、近隣結合法による結果は当株とストレプトマイセス属種との系統進化関係を明らかに表しており、当株がストレプトマイセス属の一種であることを示している。

上記の形態学的、生理学的、化学的分析などによれば、当菌は、最も類縁のストレプトマイセス・スペシャリスＧＷ４１−１５６４Ｔ株との間に、比較的大きな差異を有し、それらのゲノムハイブリダイゼーションは、２３％のハイブリダイゼーション値という、種内差異の標準値である７０％（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ、Ｅ．＆Ｅｂｅｒｓ、Ｊ．Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｔｏｄａｙ．（２００６）．３３、１５２−１５５．）より極めて低い結果を示した。以上のように、多岐に渡る分類データを総合的に分析した結果、当株がストレプトマイセス属に所属する新規菌種であることを同定し、ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株と命名し、２０１１年７月１８日に中国典型培養保蔵センター（住所：中国武漢市武漢大学）に受託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１１２５８として寄託した。

本発明のストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株は４種類の新規構造を有する抗腫瘍剤化合物スピロインディマイシン（Ｓｐｉｒｏ−Ｉｎｄｉｍｙｃｉｎ）Ａ−Ｄを産生することができる。

そこで、本発明の第２の目的は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する化合物であるスピロインディマイシンＡ−Ｄを提供することである。

（但し、スピロインディマイシンＡの場合、Ｒ_１はＮを表し、Ｒ_２はＨを表し、Ｒ_３はＣＯＯＣＨ_３を表し、ＸとＺは結合しており、スピロインディマイシンＢの場合、Ｒ_１はＮＣＨ_３を表し、Ｒ_２はＨ_２を表し、Ｒ_３はＨを表し、ＸとＹは結合しており、スピロインディマイシンＣの場合、Ｒ_１はＮＨを表し、Ｒ_２はＨ_２を表し、Ｒ_３はＨを表し、ＸとＹは結合しており、スピロインディマイシンＤの場合、Ｒ_１はＮＣＨ_３を表し、Ｒ_２はＨ_２を表し、Ｒ_３はＣＯＯＣＨ_３を表し、ＸとＹは結合している。）

発明者らは、スピロインディマイシンＡ−Ｄが、人癌細胞、例えば、乳癌ＭＣＦ−７細胞、ヒト膵癌１９９０細胞、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞、ヒト子宮頚癌Ｈｅｌａ細胞、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、ヒト肺癌Ｈ４６０細胞、及びヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔリンパ細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対して選択的な細胞毒性を有することを実験により見出した。スピロインディマイシンＢは、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、ヒト肺癌Ｈ４６０細胞、及びヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔリンパ細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対するＩＣ_５０がそれぞれ１１μＭ、３６．６μＭ、及び４．５μＭであったが、その他の被試験細胞株に対しては有意な成長阻害活性を示さなかった。スピロインディマイシンＣは、ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２細胞とヒト肺癌Ｈ４６０細胞に対するＩＣ_５０がそれぞれ１４．１μＭと３５．４μＭであったが、その他の被試験細胞株に対して有意な成長阻害活性を示さなかった。スピロインディマイシンＤは、ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、及びヒト肺癌Ｈ４６０細胞に対するＩＣ_５０がそれぞれ４４．４μＭ、４０．４μＭと３６．３μＭであったが、その他の被試験細胞株に対して有意な成長阻害活性を示さなかった。スピロインディマイシンＡは、ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔリンパ細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対するＩＣ_５０が４４．４μＭであるが、その他の被試験細胞株に対して有意な成長阻害活性を示さなかった。上記の結果は表３を参照。

本発明の第３の目的は、抗腫瘍剤の製造におけるスピロインディマイシンＡ−Ｄの使用を提供することである。

好ましくは、スピロインディマイシンＡを、ヒト急性リンパ芽球性白血病を治療するための薬物の製造において使用する。

好ましくは、スピロインディマイシンＢを、ヒト黒色腫、ヒト肺癌、またはヒト急性リンパ芽球性白血病を治療するための薬物の製造において使用する。

好ましくは、スピロインディマイシンＣを、ヒト肝細胞癌、またはヒト肺癌を治療するための薬物の製造において使用する。

好ましくは、スピロインディマイシンＤを、ヒト黒色腫、ヒト肝細胞癌、またはヒト肺癌を治療するための薬物の製造において使用する。

本発明の第４の目的は、スピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤの製造におけるストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の使用を提供することである。

本発明の第５の目的は、ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の発酵培養物から単離してスピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤを得ることを特徴とするスピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤの製造方法を提供することである。

好ましくは、以下の方法により、ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の発酵培養物からスピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤを単離して獲得する。具体的な手順は、以下のとおりである。

ａ）ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の発酵培養物を培養し、当該発酵培養物から発酵液と菌糸体を分離する。発酵液はマクロポーラス型樹脂に吸着させ、その後、マクロポーラス型樹脂からアセトンで溶出を行い，溶出液からアセトンを回収して残った残液を酢酸エチルで抽出し、その酢酸エチル層を蒸留濃縮してエキスＡを獲得する。菌糸体はアセトンで浸出し，その浸出液からアセトンを回収し残った残液をさらに酢酸エチルで抽出し、その酢酸エチル層を蒸留濃縮してエキスＢを獲得する。
ｂ）エキスＡとエキスＢからなる粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム／メタノールを溶離液として体積比１００：０〜０：１００で勾配溶出を行い、クロロホルム／メタノールの体積比が９５：５の際に勾配溶出した留出物Ｆｒ．１を集める。Ｆｒ．１をＯＤＳ逆相クロマトグラフィーにかけ、水／メタノールを溶離液として体積比１００：０〜０：１００で勾配溶出を行い、水／メタノールの体積比が３０：７０の際に勾配溶出した留出物Ｆｒ．１−１を集める。Ｆｒ．１−１をさらにＬＨ−２０ゲルカラムに通し、体積比１：１のクロロホルム／メタノールを流動相として溶出を行い、薄層クロマトグラフィーによるトラッキング分離を行う。薄層プレート上で、体積比９：１のクロロホルム／メタノールを展開剤とするとき、Ｒｆ値が０．８である留出物をスピロインディマイシンＢとして、Ｒｆ値が０．６である留出物をスピロインディマイシンＡとして、また、体積比４０：６０の石油エーテル／酢酸エチルを展開剤とするとき、Ｒｆ値が０．８である留出物をスピロインディマイシンＣとして、体積比５０：５０の石油エーテル／酢酸エチルを展開剤とするとき、Ｒｆ値が０．８である留出物をスピロインディマイシンＤとして、それぞれ、集める。

ａ）に記載のストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の発酵培養物を調製するにあたっては、以下の方法で調製することが好ましい。
活性化されたストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株を種培地に接種し、２８℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間培養して種液を獲得する。種液を１０％の接種量で発酵培地に接種し、２８℃、２００ｒｐｍの条件で１２０時間振とう培養して発酵培養物を得る。種培地と発酵培地は、共に１リットルの培地当たり、デンプン１０ｇ、酵母パウダー５ｇ、ペプトン４ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、粗塩３０ｇ、残量の水を含み、ｐＨは７．２である。

本発明により、新規なストレプトマイセス属菌であるＳＣＳＩＯ０３０３２株が提供され、当株から構造の新しい抗腫瘍活性を有するスピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤが得られる。スピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、特徴的なスピロ構造を有するほかに、腫瘍細胞特異的で、比較的高い活性を有するため、高効率で低毒性の抗腫瘍性化合物を開発するための理想的な候補化合物である。

本発明の新規ストレプトマイセス属菌、ＳＣＳＩＯ０３０３２株は、２０１１年７月１８日に中国典型培養保蔵センター（住所：中国武漢市武漢大学）に受託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１１２５８として寄託済みである。

ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づいて近隣結合法により作成された、類縁関係の最も近い種との関係を示す進化系統樹である。 ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の走査型電子顕微鏡ＳＥＭ写真である。 上澄みからの抽出物であるエキスＡと、菌糸体からの抽出物であるエキスＢの高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）図である。 高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）条件：クロマトカラムはｐｈｅｎｏｍｅｘ １５０Ｘ４．６ｍｍ（ＳｐｈｅｒｅＣｌｏｎｅ ＳＡＸ）であり、流動相は、流動Ａ相と流動Ｂ相を含む。流動Ａ相：１０％（体積分数）のアセトニトリル＋０．０８％（体積分数）のトリフルオロ酢酸を含有し、溶剤は水。流動Ｂ相：９０％（体積分数）のアセトニトリルを含有し、溶剤は水。サンプリングプログラム：０−２０分、流動相の比率Ａ相／Ｂ相（体積比）＝９５：５−０：１００；２０−２１分、流動相の比率Ａ相／Ｂ相（体積比）＝０：１００；２１−２２分、流動相の比率Ａ相／Ｂ相（体積比）＝０：１００−９５：５；２２−３０分、流動相の比率Ａ相／Ｂ相（体積比）＝９５：５。検出波長２５４ｎｍ、流速１ｍｌ／ｍｉｎ。図中、１は化合物１を、２は化合物２を、３は化合物３を、４は化合物４を表す。 化合物１のＸ線構造を示す図である。 化合物２のＸ線構造を示す図である。

以下の実施例を、本発明をさらに説明するために例示する。なお、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
Ｉ．ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の分離と同定
本発明の新規ストレプトマイセス属菌、ＳＣＳＩＯ０３０３２株は、インド洋（Ｅ８７°５９．７’、Ｎ９°５９．３’）の深さ３４１２メートルの海底堆積物から分離して獲得した。分離培地は、周知技術に基づいて最適化したＩＳＰ２培地であり、１リットルの培地に、酵母エキス２．０ｇ、モルトエキス２．０ｇ、グルコース１．０ｇ、寒天２０．０ｇ、蒸留水５００ｍｌ、天然海水５００ｍｌを含有し、ｐＨは７．２である。分離培養の条件は２８℃、１４日である。それによって、海底堆積物からＳＣＳＩＯ０３０３２株（ストレプトマイセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＣＳＩＯ０３０３２株）を分離純化して獲得した。

１．形態学的性質並びに生理学的及び生化学的分析
ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株は、グラム陽性の好気性放線菌である。その基生菌糸は僅かに黄色の分枝であり、気菌糸は灰色の分枝でコイル状の胞子鎖に分化する。胞子は、楕円状（図２）で、０．４−０．７μｍの長さで、滑らかな表面を有している。ＰＤＡ培地上での成長は弱い。ＩＳＰ５上では成長がみられ、可溶性色素を産生する。カタラーゼ、ウレアーゼ、牛乳の凝固及びペプトン化反応は陽性であり、ゼラチン液化、メラニン産生、及びオキシダーゼ反応は陰性である。また、デンプン、セルロース、Ｔｗｅｅｎ２０、４０、８０を加水分解することができ、硫化水素の生成と硝酸塩還元反応は陰性である。Ｄ−アラビノース、Ｄ−セロビオース、フルクトース、イノシトール、ピルビン酸ナトリウム、Ｄ−ラフィノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルボース、及びキシリトールを、唯一の炭素源およびエネルギー源として利用し成長できるが、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−トレハロース、及びＤ−キシロースを利用することはできない。メトキシピリミジン及びリンコマイシンへの感受性がある。ｐＨ、塩濃度、及び温度の許容範囲は、それぞれ、ｐＨ６．０−９．０、０−９％、及び１５−４０℃である。細胞壁にＬ−ＤＡＰを含有する。主なキノンはＭＫ−９（Ｈ６）及びＭＫ−１１であり、主な脂肪酸はｉ−Ｃ_１５：０（８％）、ｉ−Ｃ_１６：０（２４％）、ｉ−Ｃ_１６：１Ｇ（１４％）、ａｉ−Ｃ_１７：０（１５％）、及びａｉ−Ｃ_１７：１Ａ（１２％）である。Ｇ＋Ｃのモル含有量は７１．６（±０．５）％である。

２、分子生物学的同定
ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株を同定するにあたって、ゲノムＤＮＡの抽出、１６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅、配列比較、及び進化系統樹の構築、並びに、生理学的、化学的、及び形態学的同定などについては、文献［Ｔｉａｎ， Ｘ．Ｐ．，Ｚｈｉ，Ｘ．Ｙ．，Ｑｉｕ、Ｙ．Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｑ．，Ｔａｎｇ，Ｓ．Ｋ．，Ｘｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｗ．Ｊ．Ｓｃｉｓｃｉｏｎｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｍａｒｉｎｅ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｅｄｉｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００９， ５９（Ｐｔ２）：２２２−２２８］を参考にして行った。

上記参考文献に基づいてＳＣＳＩＯ０３０３２株のゲノムＤＮＡを抽出し、当株の１６Ｓ ｒＤＮＡをＰＣＲ法で増幅して配列を決定し、１４３０塩基の配列を獲得した。その配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す。その後、ＧｅｎＢａｎｋ中の１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列を用いてＢＬＡＳＴ解析を行った。その結果、当株はストレプトマイセス・スペシャリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉａｌｉｓ）ＧＷ４１−１５６４Ｔ株と９７％の類似性を示した。ストレプトマイセス属の進化系統樹を作成すると、そのグループの１つにＳＣＳＩＯ０３０３２株がまとまることから、ＳＣＳＩＯ０３０３２株がストレプトマイセス属に所属することが分かった。図１に示すように、近隣結合法による結果は当株とストレプトマイセス属種との系統進化関係を表しており、当株がストレプトマイセス属の一種であることを示している。ゲノムハイブリダイゼーションの結果は、ＳＣＳＩＯ０３０３２株と最も類縁のストレプトマイセス・スペシャリスＧＷ４１−１５６４Ｔ株との間に、比較的大きな差異があり、２３％のハイブリダイゼーション値という、種内差異の標準値である７０％（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ、Ｅ．＆Ｅｂｅｒｓ、Ｊ．Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｔｏｄａｙ．（２００６）．３３、１５２−１５５．）より極めて低くいことを示した。また、形態学、生理学、細胞化学などの面でも、既知の最も類縁の株と大きな差があった。以上のように、多岐に渡る分類データを総合的に分析した結果、当該株がストレプトマイセス属に所属する新規菌種であることを同定し、ストレプトマイセス属菌ＳＣＳＩＯ０３０３２株と命名し、２０１１年７月１８日に中国典型培養保蔵センター（住所：中国武漢市武漢大学）に受託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１１２５８として寄託した。

ＩＩ．活性代謝産物スピロインディマイシンＡ−Ｄの分離と調製
１．培地（種培地と発酵培地）
１リットル培地あたり、デンプン１０ｇ、酵母パウダー５ｇ、ペプトン４ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、粗塩３０ｇ、及び、残量の水を含有し、ｐＨは７．２。１２１℃で、３０分の滅菌を行った。

２．発酵
２．１．種培養
シャーレ上の活性化されたストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の単一コロニーを、５０ｍＬの培地がそれぞれ入っている２５０ｍｌ三角フラスコ、計１８本に接種し、２８°Ｃ、２００ｒ・ｍｉｎ^−１で４８時間培養して、種液９００ｍＬを得た。
２．２．発酵培養
種液を１０％（体積パーセント）の接種量で９Ｌの発酵培地（５０ｍＬの培地がそれぞれ入っている２５０ｍＬ三角フラスコ、計１８０本）となるよう接種し、２８°Ｃ、２００ｒ・ｍｉｎ^−１で１２０時間振とう培養して発酵培養物９Ｌを得た。

３．抽出
まず、発酵培養物を遠心分離して（３５００ｒ・ｍｉｎ^−１、８分）、９Ｌの上澄み液（発酵液）と菌糸体を得た。発酵液をマクロポーラス型樹脂ＸＡＤ１６で固相抽出してから、マクロポーラス型樹脂からアセトンで３回溶出を行い、溶出液からアセトンを回収し、残った残液を酢酸エチルで３回抽出して、その酢酸エチル層を蒸留濃縮してエキスＡ（４．１ｇ）を獲得した。菌糸体を２Ｌアセトンで室温下に３回（各回３時間）浸出し、浸出液をまとめ、減圧してアセトンを回収し、残った残液を６Ｌの酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を減圧蒸留して菌糸体抽出物、エキスＢ（０．９ｇ）を得た。

４．活性化合物の抽出分離と同定
４．１スピロインディマイシンＡ−Ｄの抽出分離と同定
エキスＡとエキスＢのサンプルをそれぞれ少量はかり、１００μＬのメタノールに溶かし、遠心分離により上澄み１０μＬを取り、ＨＰＬＣ測定を行った。その結果、エキスＡは、化合物１（１）と２（２）を含有し、エキスＢは化合物３（３）と４（４）を含有することが示唆された（図３）。エキスＡとエキスＢを１つにまとめた。このまとめた粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３００−４００メッシュ）にかけ、クロロホルム／メタノールを溶離液として体積比１００：０−０：１００で勾配溶出を行い、クロロホルム／メタノールの体積比が９５：５の際に勾配溶出した留出物Ｆｒ．１（３．０３ｇ）を集め、蒸発させた。Ｆｒ．１をＯＤＳ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ＊ＧＥＬ ＯＤＳ−Ａボール型充填剤、孔径１２０Ａ，粒径５０ｕｍ，２４０×４．０ｃｍ Ｉ．Ｄ．）にかけ、流速２５ｍｌ／ｍｉｎで、水／メタノールを溶離液として体積比１００：０−０：１００で勾配溶出を行い、水／メタノールの体積比が３０：７０の際に勾配溶出した留出物Ｆｒ．１−１（１．５７ｇ）を集めた。Ｆｒ１−１をさらにＬＨ−２０ゲルカラム（２．５＊１００ｃｍ）に通し、体積比１：１のクロロホルム／メタノールを流動相として溶出を行い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、１００ｍｌ毎に集め合併して１セットとし、順次にＦｒ．１−１−Ａ〜Ｇの７つのサンプルを得た。その中で、Ｆｒ．１−１−Ｃは３３１ｍｇ、Ｆｒ．１−１−Ｄは６２６ｍｇ、Ｆｒ．１−１−Ｅは２７ｍｇであった。Ｆｒ．１−１−Ｃについて、体積比９：１のクロロホルム／メタノールを展開剤として薄層調製により、Ｒｆ値が０．８であるストリップを集め、酢酸エチル溶出により化合物２（１８．０ｍｇ）（スピロインディマイシンＢ）を得、Ｒｆ値が０．６であるストリップを集め、酢酸エチル溶出により化合物１（５．０ｍｇ）（スピロインディマイシンＡ）を得た。Ｆｒ．１−１−Ｄについて、体積比４０：６０の石油エーテル／酢酸エチルを展開剤として薄層調製により、Ｒｆ値が０．８であるストリップを収集し、酢酸エチル溶出により化合物３（２２．０ｍｇ）（スピロインディマイシンＣ）を得た。Ｆｒ．１−１−Ｅについて、体積比５０：５０の石油エーテル／酢酸エチルを展開剤として薄層調製により、Ｒｆ値が０．８であるストリップを収集し、酢酸エチル溶出により化合物４（６．６ｍｇ）（スピロインディマイシンＤ）を得た。

本発明のストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の発酵培養物から調製し得た４つの化合物１−４であるスピロインディマイシンＡ−Ｄ（式（ＩＩ））について、構造分析により同定した結果は、以下のとおりである。

化合物１：白い結晶体。核磁気データの帰属を表１に示す。［α］^２０ _Ｄ＋４６．６９（ｃ０．１５、ＭｅＯＨ）、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ｌｏｇ ε）２７２ｎｍ（４．０５）、２２７ｎｍ（４．４０）、ＩＲ（ＫＢｒ）λｍａｘ３４４３、１７２５、１２２９ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ ＣＤ_３ＯＤ）を表１に、^１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ ＣＤ_３ＯＤ）を表２に示す。高分解能質量分析、ＨＲＥＳＩＭＳの結果はＣ_２４Ｈ_１５Ｃ_ｌ２Ｎ_３Ｏ_３のｍ／ｚ値（実測値［Ｍ−Ｈ］⁻４７８．０３５３、計算値４７８．０３６１）を示し、不飽和度は１８であった。化合物１の水素スペクトルから、２つのメトキシ［δＨ ３．５３（３Ｈ，ｓ），４．００（３Ｈ，ｓ）］、７つの芳香族プロトン、及び２つの活性水素［δＨ １１．４７（１Ｈ，ｓ），１２．２０（１Ｈ，ｂｒｓ）］を有することが分かる。^１３ＣＮＭＲ及びＤＥＰＴ ＮＭＲから、２つのカルボニル炭素［δＣ １５９．６（ｓ），１６０．３（ｓ）］、１３個の第四級の炭素、７つのメチレン炭素、及び２つのメチル炭素を有することが分かる。化合物１の水素スペクトル及び炭素スペクトルを、既知化合物リナミシンＤと比較すると、よく類似していた［ＭｃＡｒｔｈｕｒ Ｋ．Ａ．；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｓ．Ｓ．；Ｔｓｕｅｎｇ Ｇ．；Ｒｈｅｉｎｇｏｌｄ Ａ．；Ｗｈｉｔｅ Ｄ．Ｊ．；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ Ｊ．；Ｌａｍ Ｋ．Ｓ．；Ｐｏｔｔｓ Ｂ．Ｃ． Ｌｙｎａｍｉｃｉｎｓ Ａ−Ｅ ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｂｉｓｉｎｎｄｏｌｅ ｐｙｒｒｏｌｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｉｎｅ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ ２００８，７１，１７３２−７．］。両者の違いとして、化合物１では、水素が２つ少なく、不飽和結合が１つ多いこと、化合物１の炭素スペクトルでは、ｓｐ^３混成した第四級の炭素が１つ多く、リナミシンＤではｓｐ^２混成した第四級の炭素が１つ少ないこと、また、化合物１中のＣ−２′のケミカルシフトは、明らかに低場（δ_Ｃ１６９．２）に偏移していることが挙げられる。以上の証拠から、化合物１のＣ−３′とＣ−５″が連結して環になり、また元Ｃ−２′とＣ−３′の間にある共役が転移され、Ｃ−２′とＮ−１′の間の共役に変化したと推測される。この推測は、化合物１のＸ線測定結果（図４）によっても裏付けられている。また、分子中に存在する塩素原子により、Ｘ線測定結果から、化合物１の絶対配置ではＣ−３′がＳ配置を取ることが確定された。化合物１の構造を式（ＩＩ）に示す。化合物１をスピロインディマイシンＡと命名した。

化合物２：白い結晶体。［α］^２０ _Ｄ＋１６９．２（ｃ０．６７，ＭｅＯＨ）、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ｌｏｇε）２５２ｎｍ（４．７７）、２０９ｎｍ（４．６６）、ＩＲ（ＫＢｒ）λｍａｘ３４１８，１６９５，１２８４ｃｍ^−１。マイナスイオン高分解能質量分析によれば４３６．０６０２（計算値４３６．０６０２）に［Ｍ−Ｈ］⁻ピークが観察された。また、炭素スペクトル及び水素スペクトルを合わせて考えると、当該化合物の分子式はＣ_２３Ｈ_１６Ｃｌ_２Ｎ_３Ｏ_２であり、１６つの不飽和度を有することが分かった。化合物の１Ｄ ＮＭＲ（^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）を表１に、^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）を表２に示す）から、水素スペクトル中には以下のシグナルが観察された：１つの窒素メチル［δ_Ｈ ２．８８（１Ｈ，ｓ）］、１つの酸素メチル［δ_Ｈ ３．３６（３Ｈ，ｓ）］、７つのメチンプロトン、１つのメチレンプロトン［δ_Ｈａ ３．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）］及び［δ_Ｈｂ ４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）］並びに２つの交換可能なプロトン。また、炭素スペクトル中には以下のシグナルが観察された：１つのカルボニル炭素、１３個の第四級の炭素（１２個のｓｐ^２混成した第四級の炭素と１つのｓｐ^３混成した第四級の炭素を含む）、７つのメチン炭素、１つのメチレン炭素、１つの酸素メチル炭素及び１つの窒素メチル炭素。化合物２の水素スペクトルおよび炭素スペクトルを、既知化合物リナミシンＡと比較すると、よく類似していた［ＭｃＡｒｔｈｕｒ，Ｋ．Ａ．；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｓ．Ｓ．；Ｔｓｕｅｎｇ，Ｇ．；Ｒｈｅｉｎｇｏｌｄ，Ａ．；Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｊ．；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ，Ｊ．；Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．；Ｐｏｔｔｓ，Ｂ．Ｃ． Ｌｙｎａｍｉｃｉｎｓ Ａ−Ｅ， ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｂｉｓｉｎｄｏｌｅ ｐｙｒｒｏｌｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｉｎｅ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ，Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ，２００８，７１，１７３２−７．］。この結果から、化合物２と化合物リナミシンＡの構造が類似しており、ともにビスインドールアルカロイドに属することが示された。化合物２の水素スペクトルには２つのＡＢＸカップリング系（Ｈ−５′／Ｈ−７′／Ｈ−８′；Ｈ−５″／Ｈ−７″／Ｈ−８″）が存在し、リナミシンＡと類似していた。これは、化合物２が２つの１，２，４−三置換ベンゼン環を有することを示している。これらはそれぞれ１ａと１ｂ（式（ＩＩＩ））に帰属された。さらに、１ａ断片は以下のＨＭＢＣ相関から構築された：Ｈ−５′からＣ−６′／Ｃ−７′Ｃ−９′との間、Ｈ−７′からＣ−５′Ｃ−９′との間、Ｈ−８′からＣ−６′／Ｃ−４との間（この相関は同時に塩素がｃ−６′位で置換したことを示唆する）、及びＨ−２′からＣ−３′／Ｃ−４′／Ｃ−９′との間。Ｈ−１０′位の窒素メチルプロトン［δＨ ２．８８（ｓ）］からＣ−２′［δＣ ６４．３（ｔ）］及びＣ−９′［δＣ １５１．９（ｓ）］の間のＨＭＢＣ相関から、当該窒素メチルを１ａ断片のＮ−１′に定位した。１ｂ断片は以下のＨＭＢＣから得られた：Ｈ−５″からＣ−３″／Ｃ−７″／Ｃ−６″／Ｃ−９″との間、Ｈ−７″とＣ−５″Ｃ−６″／との間、及びＨ−８″からＣ−３″／Ｃ−５″／Ｃ−４″／Ｃ−６″／Ｃ−９″との間。１ｃ断片は、以下のＨＭＢＣ相関から得られた：Ｈ−２からＣ−３／Ｃ−４／Ｃ−５とＨ−２／ＮＨ−１のＣＯＳＹとの間。その他に、Ｈ−２′からＣ−３″の間の弱いＨＭＢＣ相関からＣ−５でメトキシに置換されたことが分かる。
既知の化合物リナミシンＡとの違いとして、化合物２は珍しい５／５スピロを形成していることが挙げられる。スピロ構造を形成することは、Ｈ−２′［δＨ ３．６３（ｄ）］からＣ−３［δＣ １４０．１（ｓ）］との間、Ｈ−２′［δＨ ４．０６（ｄ）］からＣ−２″［δＣ １５４．５（ｓ）］との間、及びＨ−２［δＨ ６．９１（ｄ）］からＣ−３″［δＣ １１２．１（ｓ）］との間の重要なＨＭＢＣ相関から支持される。この化合物２に関する推測は、Ｘ線測定結果（図５）によっても裏付けられている。また、分子中に存在する塩素原子により、Ｘ線測定結果から化合物２のＣ−３′の絶対配置はＲ配置であることが確定された。化合物２の構造を式（ＩＩ）に示す。化合物２をスピロインディマイシンＢと命名した。

化合物３：白色の固体。核磁気データの帰属を表１に示す。［α］^２０ _Ｄ＋１７４．１（ｃ ０．３１，ＭｅＯＨ）、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ｌｏｇ ε）２５１ｎｍ（４．４４）、２１０ｎｍ（４．６３）、ＩＲ（ＫＢｒ）λｍａｘ３４１７，１７０１，１２８５ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ ＣＤ_３ＯＤ）を表１に、^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ ＣＤ_３ＯＤ）を表２に示す。ＨＲＥＳＩＭＳの結果、［Ｍ−Ｈ］⁻のｍ／ｚは４２２．０４９９（Ｃ_２２Ｈ_１４Ｃｌ_２Ｎ_３Ｏ_２の予測値は４２２．０４６３）であり、その分子構造式は、化合物２とは、メチル基１つ分の差があった。Ｈ−スペクトル、Ｃ−スペクトル、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルを慎重に分析した結果、化合物３は、化合物２の１´−Ｎ メチルを欠如する同族体であることが分かった。化合物３の構造を式（ＩＩ）にす。化合物３をスピロインディマイシンＣと命名した。

化合物４：白色の固体。核磁気データの帰属を表１に示す。［α］^２０ _Ｄ＋１００．５（ｃ ０．４０，ＭｅＯＨ）、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ε）２６６ｎｍ（４．２３）、２４３ｎｍ（２６３７３）、２０８ｎｍ（４．４８）、ＩＲ（ＫＢｒ）λｍａｘ ３３０７，１７０８，１２６８ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ ＣＤ_３ＯＤ）を表１に、^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ ＣＤ_３ＯＤ）を表２に示す。ＨＲＥＳＩＭＳの結果、［Ｍ−Ｈ］⁻のｍ／ｚは４９４．０６６１（Ｃ_２５Ｈ_１８Ｃｌ_２Ｎ_３Ｏ_４の予測値は４９４．０６７４）であった。化合物４の水素スペクトルと炭素スペクトルを化合物２と比較すると、化合物２よりカルボメトキシ基が１つ多く、また化合物２中のＣ−２位にあるｓｐ^２混成したメチレン炭素［δＨ ６．９１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｈ−２）；δＣ １１０．３（ｄ，Ｃ−２）］がｓｐ^２混成した第四級炭素［δＣ １１１．５（ｓ，Ｃ−２）］に置換されている。以上から、化合物４は、化合物２の２位がメチルエステル置換構造の類似物であることが示された。化合物４の構造を式（ＩＩ）に示す。化合物４をスピロインディマイシンＤと命名した。

（実施例３：スピロインディマイシンＡ−Ｄの細胞毒性の測定）
７種の腫瘍細胞株：ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞、ヒト膵癌１９９０細胞、ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２細胞、ヒト子宮頚癌Ｈｅｌａ細胞、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、ヒト肺癌Ｈ４６０細胞、及びヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔリンパ細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への、スピロインディマイシンＡ−Ｄの活性を測定した。実験方法は、文献［Ｗｕ，Ｚ．Ｃ．；Ｌｉ，Ｄ．Ｌ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ．；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｍ．，Ａ ｎｅｗ ｉｓｏｆｕｒａｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｏｎｅ ａｎｄ ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．Ａ４ ｆｒｏｍ Ａｑｕｉｌａｒｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ２０１０，９３，（５），９２０−９２４］を参考にした。対照としてスタウロスポリンを用いた。

表３に示される結果から分かるように、スピロインディマイシンＢはマウス黒色腫Ｂ１６細胞、ヒト肺癌Ｈ４６０細胞、及びヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔリンパ細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対するＩＣ_５０がそれぞれ１１μＭ、３６．６μＭ、及び４．５μＭであるが、その他の被試験細胞株に対して有意な成長阻害活性を示さなかった。スピロインディマイシンＣは、ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２細胞とヒト肺癌Ｈ４６０細胞に対するＩＣ_５０がそれぞれ１４．１μＭと３５．４μＭであるが、その他の被試験細胞株に対して有意な成長阻害活性を示さなかった。スピロインディマイシンＤは、ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２細胞、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、及びヒト肺癌Ｈ４６０細胞に対するＩＣ_５０がそれぞれ４４．４μＭ、４０．４μＭ、及び３６．３μＭであるが、その他の被試験細胞株に対して有意な成長阻害活性を示さなかった。スピロインディマイシンＡは、ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔリンパ細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭに対するＩＣ_５０が４４．４μＭであるが、その他の被試験細胞株に対して有意な成長阻害活性を示さなかった。陽性対照であるスタウロスポリンと比べると、スピロインディマイシンＡ−Ｄは測定した７種類の細胞に対して選択的な抑制作用を表し、かつ、その活性は比較的に強く、生物工学や化学修飾によって新規抗腫瘍剤を開発するための有望な候補である。

Claims (10)

1. 受託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｍ２０１１２５８として寄託されたストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株。
2. 下記式で表される化合物であるスピロインディマイシンＡ−Ｄからなる群より選択されるスピロインディマイシン。
   

   
3. 請求項２に記載のスピロインディマイシンを含む抗腫瘍剤。
4. 請求項２に記載のスピロインディマイシンのうち前記スピロインディマイシンＡを含む、ヒト急性リンパ芽球性白血病を治療するための薬物。
5. 請求項２に記載のスピロインディマイシンのうち前記スピロインディマイシンＢを含む、ヒト黒色腫、ヒト肺癌、またはヒト急性リンパ芽球性白血病を治療するための薬物。
6. 請求項２に記載のスピロインディマイシンのうち前記スピロインディマイシンＣを含む、ヒト肝細胞癌またはヒト肺癌を治療するための薬物。
7. 請求項２に記載のスピロインディマイシンのうち前記スピロインディマイシンＤを含む、ヒト黒色腫、ヒト肝細胞癌、またはヒト肺癌を治療するための薬物。
8. スピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤの製造における、請求項１に記載のストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の使用。
9. 請求項１に記載のストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の発酵培養物から単離してスピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤを得ることを特徴とするスピロインディマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤの製造方法。
10. ａ）ストレプトマイセスＳＣＳＩＯ０３０３２株の発酵培養物を培養し、前記発酵培養物から発酵液と菌糸体を分離し、
    前記発酵液をマクロポーラス型樹脂に吸着させ、前記マクロポーラス型樹脂からアセトンで溶出を行い、該溶出液からアセトンを回収して残った残液を酢酸エチルで抽出し、該酢酸エチル相を蒸留濃縮してエキスＡを獲得し、
    前記菌糸体をアセトンで浸出し，該浸出液からアセトンを回収し残った残液をさらに酢酸エチルで抽出し、該酢酸エチル相を蒸留濃縮してエキスＢを獲得し、
    ｂ）前記エキスＡ及び前記エキスＢを含む粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム／メタノールを溶離液として体積比１００：０−０：１００で勾配溶出を行い、クロロホルム／メタノールの体積比が９５：５の際に勾配溶出した留出物Ｆｒ．１を集め、ＯＤＳ逆相クロマトグラフィーにかけ、水／メタノールを溶離液として体積比１００：０−０：１００で勾配溶出を行い、水／メタノールの体積比が３０：７０の際に勾配溶出した留出物Ｆｒ．１−１を集め、さらにＬＨ−２０ゲルカラムに通し、体積比１：１のクロロホルム／メタノールを流動相として溶出を行い、薄層クロマトグラフィーによるトラッキング分離を行い、薄層プレート上で、体積比９：１のクロロホルム／メタノールを展開剤とするとき、Ｒｆ値が０．８である留出物をスピロインディマイシンＢとして、Ｒｆ値が０．６である留出物をスピロインディマイシンＡとして集め、
    また、薄層プレート上で、体積比４０：６０の石油エーテル／酢酸エチルを展開剤とするときＲｆ値が０．８である留出物をスピロインディマイシンＣとして集め、体積比５０：５０の石油エーテル／酢酸エチルを展開剤とするときＲｆ値が０．８である留出物をスピロインディマイシンＤとして集める、
    ことを特徴とする請求項９に記載の製造方法。

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