CN103409358A

CN103409358A - 一株高产自溶霉素的基因工程菌

Info

Publication number: CN103409358A
Application number: CN2013102021154A
Authority: CN
Inventors: 鲁涛; 张呈波; 尹敏
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明公开了一株自溶链霉菌的基因工程菌株，该菌株是利用分子生物学手段敲除了自溶链霉菌中参与格尔德霉素生物合成的单加氧酶基因所构建的。该菌株通过发酵可大量产生具有很强抗肿瘤活性的化合物自溶霉素。采用本发明所提供的菌株可大大提高自溶霉素的产量，用于生产自溶霉素比其它方法更加经济和环保。

Description

一株高产自溶霉素的基因工程菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体来说，涉及利用分子生物学方法构建链霉菌工程菌株，该工程菌可发酵产生自溶霉素。

背景技术

以格尔德霉素（geldanamycin）为代表的苯醌安莎霉素类化合物（benzoquinone ansamycin）是目前研究最多、效果很好的抗肿瘤化合物之一。此类化合物的抗肿瘤机制是与肿瘤细胞中的热休克蛋白（heat shock protein）Hsp90特异结合，导致肿瘤细胞内许多需要Hsp90维持功能的重要蛋白质迅速降解，从而抑制肿瘤细胞的生长或引发肿瘤细胞死亡。由于这类化合物对肿瘤细胞具有很高的特异性和极强的抗肿瘤活性，同时具有比传统的抗肿瘤药物更加广谱的抗肿瘤活性并且不容易产生抗药性，因此引起了人们的高度关注，成为近年来肿瘤治疗药物中的研究热点。目前，这类化合物中的17-AAG、17-DMAG及IPI-504等正由美国NCI主导的研究机构进行临床研究，有望成为新的抗肿瘤药物。

自溶霉素（autolytimycin）是我们从放线菌新种自溶链霉菌（Streptomyces autolyticus CGMCC 0516）（ZL 00134063.8）的次生代谢产物中发现的一个具有自主知识产权、具有很强抗肿瘤活性的格尔德霉素结构类似物。自溶霉素与格尔德霉素以及目前正在美国进行临床研究的17-AAG和17-DMAG等其它结构类似物的主要区别在于其发色基团是苯酚而不是苯醌，这一结构差异使自溶霉素具有比格尔德霉素以及17-AAG更强的靶目标结合活性。同时由于具有苯酚结构的安莎霉素类化合物通常比具有苯醌结构的安莎霉素类化合物毒性更低，因而自溶霉素的毒副作用也可能更小。这些特性使自溶霉素具有良好的开发应用前景。然而，自溶霉素存在产率低的缺点，严重妨碍了对它的进一步研发，再加上自溶霉素的化学合成非常困难，所以有必要对其产生菌进行改良以提高自溶霉素产率。

苯醌安莎霉素类化合物的生物合成是以3-氨基-5-羟基苯甲酸（3-amino-5-hydroxybenzoic acid，AHBA）为起始物，通过聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）逐步加入一些延伸元件如乙酸、丙酸和羟基乙酸等，形成一个聚酮的核心结构，最后再经过后修饰酶进行修饰而成。目前国内外对于此类化合物的生物合成已经有了一些研究，数个安莎霉素类化合物生物合成的基因簇已经被克隆，如S. hygroscopicus NRRL 3602 中格尔德霉素基因簇、S. hygroscopicus AM 3672 中的除莠霉素（herbimycin）基因簇、S. hygroscopicus 17997 中部分格尔德霉素基因簇以及S. autolyticus 中格尔德霉素基因簇。对格尔德霉素和除莠霉素的生物合成途径研究表明，其合成核心结构的PKS 酶很相似，主要区别在于后修饰，即C-17位O-甲基化、C-21位氧化、C-7位甲氨酰化和C-4,5位氧化等，这些修饰对此类化合物的抗肿瘤活性及细胞毒性具有很重要的影响。自溶霉素与格尔德霉素在结构上最大的区别在于苯酚转变为苯醌，而在此过程中控制苯醌氧化的单加氧酶及其作用机制还不是很清楚。

我们克隆了自溶链霉菌格尔德霉素生物合成的全基因簇并进行了序列测序，通过生物信息学分析，选择了编码单加氧酶的基因almM，对自溶链霉菌野生型菌株进行了遗传改造。该基因被敲除后，菌株完全丧失了产生格尔德霉素的能力，同时能够产生大量的自溶霉素。

本发明涉及的自溶霉素可以通过构建almM基因敲除工程菌大量发酵产生，与化学合成方法相比，更加经济、环保，并可持续利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够大量产生自溶霉素的链霉菌基因工程菌。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

a）采用Red/ET一步PCR法，以质粒pHY773为模板，通过PCR扩增获得两端带有与almM基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒。

b）通过电转化把所扩增片段导入含pIJ790和almM基因粘粒质粒的大肠杆菌（Escherichia coli）中，筛选阿泊拉霉素（Apramycin）抗性的转化子获得含有插入突变的almM基因。

c）从上述转化子中制备含有插入突变的almM基因的粘粒质粒，通过电转化导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中。

d）利用接合转移把含有插入突变的almM基因导入野生型自溶链霉菌中，筛选阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌素敏感的接合转移子。

e）此突变株经PCR和Southern杂交验证为almM基因敲除的自溶链霉菌突变株。

f）采用MS培养基培养获得自溶链霉菌almM基因突变株的新鲜孢子，接种新鲜孢子至TSB培养基中培养制备发酵种子液，然后接种种子液至发酵培养基中发酵培养。

g）收集发酵液上清，用乙酸乙酯抽提两次。发酵产物经旋转蒸发仪45℃ 减压蒸干后溶于适量甲醇。采用HPLC对发酵产物进行分析。然后经正相硅胶柱层析及重结晶分离纯化发酵产物。

h）所分离纯化的化合物结构经质谱和¹H、¹³C 核磁共振分析确认。

本发明构建的自溶链霉菌单加氧酶基因突变工程菌命名为自溶链霉菌TL472（⊿almM）Streptomyces autolyticus TL472(⊿almM)，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：武汉大学，保藏编号：CCTCC NO: M 2013156，保藏日期：2013年4月24日。

附图说明

图1. 自溶链霉菌almM基因敲除突变株的构建及Southern杂交分析。（A）突变株的构建策略；（B）Southern杂交分析，其中1）DNA Molecular Weight Marker VII, DIG labeled；2）BssH II酶切的野生型菌株基因组DNA；3）BssH II酶切的突变株基因组DNA。

图2. 自溶链霉菌almM基因敲除突变株的产物检测。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围不限于此。实施例中所提到的制备、转化、接合转移、电泳和Southern杂交等过程，如无特殊说明，则采用本领域的常规方法均可实现，故不再赘述。

实施例1：

自溶链霉菌单加氧酶基因（almM）敲除突变株的构建：借助NCBI网站的ORF finder，glimmer和BLAST等工具对所克隆格尔德霉素基因簇进行分析，推测各开放阅读框架（open reading frame，ORF）功能。根据氨基酸序列同源性确定编码单加氧酶的基因almM。采用Red/ET 一步PCR法构建almM基因的插入突变（图1A）。在此方法中，首先以pHY773为模板，采用PCR扩增两端带有与almM基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒。PCR扩增的引物为：5′- GTT CCA GGA CAC GGT CGA TCT GAT CCT GGC GGG CGA ATG ATT CCG GGG ATC CGT CGA CC -3′和5′- GAA GGG GAC CAG TTC GTG TTC GGG TGG GGG AGT GCC TCA TGT AGG CTG GAG CTG CTT C -3′，PCR扩增条件为：95℃预热5分钟，1个循环；94℃变性1分钟，50℃复性45秒，72℃扩增2.5分钟，10个循环；94℃变性1分钟，55℃复性45 秒，72℃扩增1分钟，20个循环；72℃扩增5分钟；4℃ 1小时。然后通过电转化把PCR扩增片段导入含pIJ790和almM基因粘粒质粒的大肠杆菌中，筛选阿泊拉霉素抗性的转化子，获得含有插入突变的almM基因。从上述转化子中制备含有插入突变的almM基因的粘粒质粒，通过电转化导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中。利用接合转移把含有插入突变的almM基因导入野生型自溶链霉菌中，筛选阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌素敏感的接合转移子，即可能的自溶链霉菌almM基因敲除突变株。采用Southern杂交验证自溶链霉菌almM敲除突变株（图1B）。首先通过PCR扩增制备Southern杂交探针， PCR引物为：5′- GAC CTG GTG TTC GAG CAT GTG G -3′和5′- GCC GAT CAG CAC GAT CTT TCC -3′，PCR扩增条件为：95℃预热5分钟，1个循环；94℃变性1分钟，50℃复性45秒，72℃扩增2.5分钟，10个循环；94℃变性1分钟，55℃复性45 秒，72℃扩增1分钟，20个循环；72℃扩增5分钟；4℃ 1小时。然后制备自溶链霉菌almM突变株及野生型菌株的基因组DNA，DNA经限制性内切酶BssH II完全酶切，电泳后转移至硝酸纤维素膜，以上述探针进行Southern杂交。

实施例2：

自溶链霉菌野生型菌株及almM基因敲除突变株发酵产物的检测：自溶链霉菌野生型菌株及almM基因敲除突变株的新鲜孢子分别接种至50 mL TSB 培养基中，于28^oC、200 rpm培养72小时制备发酵种子液，然后以1 %的接种量接种0.5 mL种子液至发酵培养基中（2 % 豆粉，0.2 % 蛋白胨，2 % 葡萄糖, 0.5 % 可溶性淀粉，0.2 % 酵母浸膏，0.4 % NaCl，0.05 % K₂HPO₄，0.05 % MgSO₄，0.2 % CaCO₃），于28^oC、250 rpm发酵培养7天。发酵液离心（3500 g，30分钟）取上清，用乙酸乙酯抽提两次，然后经旋转蒸发仪45℃ 减压蒸干。发酵产物分别溶于适量甲醇并采用HPLC进行分析（图2），自溶霉素在自溶链霉菌野生型菌株发酵产物中未检测到，而在almM基因敲除突变株中自溶霉素的产量为每毫升发酵液33.8微克。自溶霉素经氯仿:甲醇（20:1）的正相硅胶柱层析及重结晶分离纯化后，其结构经质谱和¹H、¹³C 核磁共振分析确认。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一株高产自溶霉素的基因工程菌

<130> 单加氧酶

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1623

<212> DNA

<213> 自溶链霉菌 (Streptomyces autolyticus)

<400> 1

gtggacgtcg cgcgggacac ggacaacggc gggcccaaga ccgatgtgct gatcgtcggg 60

tacggaccgg tggggcagct gctgtcggtg ctgctggccc agcgcggccg ccgggtgacg 120

gtggtggagc gctggccgga gccgtaccgg cacccccggg cggtcgggtt cgacagtgag 180

gccgcgcgca tcctggcctc ggccgggatc ggcgactcgc tcgagaagtt caccgaaccc 240

gcgcgggacc acgcctggca gaacaccaag ggcgagacgc tgatcgacca cgaggtcgcc 300

gaccgggggc actgcacctg gccggaggcg ctgtcggcct atcagccggc cctggagtcc 360

gcactgatcg aacacggggc gacgctgccg cggctgcggg tgctgcgcgg ctacgaggcg 420

gtgggactcg cggacaacgg tgaccgggtg accttgaccg tggtcggtcc ggacggcgag 480

aggacggacc tcatcgcttc gtgggtggtc ggctgcgacg gcgccaacag cctggtgcgg 540

gcgagtgtcg gcaccacggt gacggacctc gacttctcct acgactggct gatctgcgat 600

gtgcggctgc atgagcaccg cgagttccgg ccgaacaatc tggagatctg cgatccggcc 660

cgcccgcgga ccgcggtgtc cgcggggccc ggacaccggc ggtacgagtt catgcgggtg 720

cccgcggacg accccgcgca cttcggcacc gtggagagcg cgtgggagct gctgcggctg 780

ttcgacgtga cgcccgacaa cggcgtcctg gaccggcatg cggtctacac cttccaggcc 840

cgctgggcgg agcactggcg ggccggacgg ctgctgctgg ccggggactc ggcgcacctc 900

atgccgccgt tcgcggggca gggcatgtgc tccggattcc gtgacgcggc gaatctggcc 960

tggaagctgg acctggtgct gagcgggcac gcggcaccgg cgctgctgga cacctacacc 1020

agcgagcggc gggcgcatgt gcggcacgcg gtggagatgt ccgtgggcct gggccgggtg 1080

gtgtgcatgg cggacccggc cgcggcggcg gaccgggacg cggcgatgct ggccgcgcgg 1140

aagcggaaca tcgggccgag cgccgcgcgc cgctcggtgg tgcgcccgct cgtggacggg 1200

ttgctgcggc gggacgggca gggccggccg gcgccgtacg ccggacaggc ggccccacag 1260

tggcgggtgg gccgcgcggg cggcaccggg ctgttcgacg atgtggtggg caccggtttc 1320

atcctgctgt acggcgagga cgtggtcccg gcgctggacg cgcggcagct gacgttcctc 1380

gacaacatcg gggcccggct ggtgcgtgtg gtgcgcgcgg aaacgcccgc ggccgacctg 1440

gaaccagggg acgcgcggga cgtggagggc cggtatctgc cgtatctgtc ggagatgggc 1500

gcgctggcgg tgctggtacg cccggacttc tacgtgttcg gcatcgcggg cgacaaggcc 1560

gaactgccct cgctggtgga cgacttggcg gaacaactca ccccgaccgc cgccccgtcc 1620

tga 1623

<210> 2

<211> 540

<212> PRT

<213> 自溶链霉菌 (Streptomyces autolyticus)

<400> 2

Val Asp Val Ala Arg Asp Thr Asp Asn Gly Gly Pro Lys Thr Asp Val

1 5 10 15

Leu Ile Val Gly Tyr Gly Pro Val Gly Gln Leu Leu Ser Val Leu Leu

20 25 30

Ala Gln Arg Gly Arg Arg Val Thr Val Val Glu Arg Trp Pro Glu Pro

35 40 45

Tyr Arg His Pro Arg Ala Val Gly Phe Asp Ser Glu Ala Ala Arg Ile

50 55 60

Leu Ala Ser Ala Gly Ile Gly Asp Ser Leu Glu Lys Phe Thr Glu Pro

65 70 75 80

Ala Arg Asp His Ala Trp Gln Asn Thr Lys Gly Glu Thr Leu Ile Asp

85 90 95

His Glu Val Ala Asp Arg Gly His Cys Thr Trp Pro Glu Ala Leu Ser

100 105 110

Ala Tyr Gln Pro Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ile Glu His Gly Ala Thr

115 120 125

Leu Pro Arg Leu Arg Val Leu Arg Gly Tyr Glu Ala Val Gly Leu Ala

130 135 140

Asp Asn Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Val Gly Pro Asp Gly Glu

145 150 155 160

Arg Thr Asp Leu Ile Ala Ser Trp Val Val Gly Cys Asp Gly Ala Asn

165 170 175

Ser Leu Val Arg Ala Ser Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Leu Asp Phe

180 185 190

Ser Tyr Asp Trp Leu Ile Cys Asp Val Arg Leu His Glu His Arg Glu

195 200 205

Phe Arg Pro Asn Asn Leu Glu Ile Cys Asp Pro Ala Arg Pro Arg Thr

210 215 220

Ala Val Ser Ala Gly Pro Gly His Arg Arg Tyr Glu Phe Met Arg Val

225 230 235 240

Pro Ala Asp Asp Pro Ala His Phe Gly Thr Val Glu Ser Ala Trp Glu

245 250 255

Leu Leu Arg Leu Phe Asp Val Thr Pro Asp Asn Gly Val Leu Asp Arg

260 265 270

His Ala Val Tyr Thr Phe Gln Ala Arg Trp Ala Glu His Trp Arg Ala

275 280 285

Gly Arg Leu Leu Leu Ala Gly Asp Ser Ala His Leu Met Pro Pro Phe

290 295 300

Ala Gly Gln Gly Met Cys Ser Gly Phe Arg Asp Ala Ala Asn Leu Ala

305 310 315 320

Trp Lys Leu Asp Leu Val Leu Ser Gly His Ala Ala Pro Ala Leu Leu

325 330 335

Asp Thr Tyr Thr Ser Glu Arg Arg Ala His Val Arg His Ala Val Glu

340 345 350

Met Ser Val Gly Leu Gly Arg Val Val Cys Met Ala Asp Pro Ala Ala

355 360 365

Ala Ala Asp Arg Asp Ala Ala Met Leu Ala Ala Arg Lys Arg Asn Ile

370 375 380

Gly Pro Ser Ala Ala Arg Arg Ser Val Val Arg Pro Leu Val Asp Gly

385 390 395 400

Leu Leu Arg Arg Asp Gly Gln Gly Arg Pro Ala Pro Tyr Ala Gly Gln

405 410 415

Ala Ala Pro Gln Trp Arg Val Gly Arg Ala Gly Gly Thr Gly Leu Phe

420 425 430

Asp Asp Val Val Gly Thr Gly Phe Ile Leu Leu Tyr Gly Glu Asp Val

435 440 445

Val Pro Ala Leu Asp Ala Arg Gln Leu Thr Phe Leu Asp Asn Ile Gly

450 455 460

Ala Arg Leu Val Arg Val Val Arg Ala Glu Thr Pro Ala Ala Asp Leu

465 470 475 480

Glu Pro Gly Asp Ala Arg Asp Val Glu Gly Arg Tyr Leu Pro Tyr Leu

485 490 495

Ser Glu Met Gly Ala Leu Ala Val Leu Val Arg Pro Asp Phe Tyr Val

500 505 510

Phe Gly Ile Ala Gly Asp Lys Ala Glu Leu Pro Ser Leu Val Asp Asp

515 520 525

Leu Ala Glu Gln Leu Thr Pro Thr Ala Ala Pro Ser

530 535 540

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于：该菌为敲除了单加氧酶基因的自溶链霉菌（Streptomyces autolyticus），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2013156。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌的用途，其特征在于：将所述菌株用于自溶霉素的发酵生产中。