CN108456689A

CN108456689A - 提高安丝菌素p-3生物合成产量的方法

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Publication number: CN108456689A
Application number: CN201710095370.1A
Authority: CN
Inventors: 钟建江; 杜志强
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2037-02-22
Also published as: CN108456689B

Abstract

一种提高安丝菌素P‑3生物合成产量的方法，通过构建asm13‑17基因的表达质粒pIB139‑asm13‑17、构建asmUdpg基因的表达质粒pIB139‑asmUdpg以及构建共表达asm13‑17基因和asmUdpg基因所对应的整合型表达质粒pIB139‑asm13‑17:asmUdpg，并将上述表达质粒分别转入珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中，实现生物合成表达量的提高，本发明能够显著提高安丝菌素P‑3的发酵水平。

Description

提高安丝菌素P-3生物合成产量的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种通过提高前体供应的代谢工程手段来改善安丝菌素P-3生物合成产量的方法。

背景技术

放线菌(Actinomycete)是合成抗炎症、抗肿瘤药物的重要微生物。作为原核生物类群之一的放线菌在自然界分布很广，已发现的抗生素中约有三分之二是放线菌产生，与人类关系十分密切。安丝菌素是珍贵橙色束丝放线菌中产生美登醇类抗肿瘤化合物(Higashide E等，Nature，2002，270(5639)：721-722)，其中的主要成分是P-2，P-3和P-4，药理研究报道表明该类化合物具有治疗白血病和肺癌的作用，其中以安丝菌素P-3(AP-3)的抗肿瘤活性为最佳。AP-3抗体偶联药物曲妥珠单抗在欧美作为乳腺癌的靶向治疗药物已于2013年2月经美国FDA批准上市(Chari R等，Angewandte Chemie International Edition，2014，53(15)：3796-3827)。近年的研究发现，AP-3的侧链修饰结构类似物，对肺癌和肾癌具有很强的抗增殖活性(Taft F等，Chemistry-A European Journal，2012，18(3)：880-886)，展示了AP-3及其衍生物良好的应用前景。但是，目前AP-3生物合成产量仍较低，这限制了其广泛的商业化应用，因此，提高AP-3的生物合成产量具有重要的应用价值。

为了进一步提高AP-3的发酵水平，目前报道提高的AP-3产量的方法主要集中在突变株筛选、培养基优化以及培养工艺优化等方面。通过紫外和MNNG诱变技术结合得到一株高产突变株Actinosynnema pretiosum PF4-4(ATCC PTA 3921)摇瓶发酵20mL/250mL条件下最终确认有效的产量最高可以达到401mg/L，在1500L发酵罐中通过优化分批补料工艺，最终产量为304mg/L。而使用常用的菌种Actinosynnema pretiosum ATCC 31565生产AP-3，国内早期采用铺有可再生纤维素薄膜的固体发酵培养基平板培养下，产量最终可以达到4mg/g(干重)。

安丝菌素P-3的合成是一个典型的聚酮合酶I(PKS I)催化过程，它以3-氨基-5羟基苯甲酸(AHBA)作为起始单位，在PKS酶I催化下，延伸单位(3个丙二酰辅酶A，3个甲基丙二酰辅酶A以及1个特殊的羟乙酸盐单位-甲氧基丙二酰ACP)与起始单位进行缩合反应成环后，形成前安莎结构，然后经过氯化、甲氨酰化、O-甲基化、酰基化、环氧化和N-甲基化六步后修饰反应最终生成AP-3。其中小型基因簇asm13-17负责特殊前体羟乙酸盐单位合成，AHBA途径由主代谢中的UDP-葡萄糖起始，经过10步反应得到AHBA前体。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种提高安丝菌素P-3生物合成产量的方法，通过在生产菌株中引入不同前体的合成基因，通过代谢工程手段提高特殊的前体--羟乙酸盐单位的供给以及耦合AHBA前体途径供给增加，能够显著提高安丝菌素P-3的发酵水平。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明通过构建asm13-17基因的表达质粒pIB139-asm13-17、构建asmUdpg基因的表达质粒pIB139-asmUdpg以及构建共表达asm13-17基因和asmUdpg基因所对应的整合型表达质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，并将上述表达质粒分别转入珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中，实现生物合成表达量的提高。

所述的asm13-17基因是甲基丙二酰ACP合成酶基因，如Seq No.1所示。

所述的asmUdpg基因是UDP-葡萄糖磷酸酶酶基因，如Seq No.2所示。

所述的质粒构建，具体过程步骤包括：

①PCR扩增珍贵橙色束丝放线菌目的片段基因，将目的片段插入T载体中，采用NdeI/EcoRI酶切并连接至含有红霉素启动子PermE*的pIB139载体中，得到pIB139-asm13-17、pIB139-asmUdpg以及pIB139-asm13-17:asmUdpg质粒；

②将上述三种质粒分别转入含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567中，然后将等量混合收集大肠杆菌ET12567/PUZ8002和预先培养的珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565菌丝体混合均匀，再通过平板培养得到突变株结合子；

所述的平板培养是指：将大肠杆菌ET12567/PUZ8002和珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565菌丝体涂布于含有MgCl₂的YMG平板上，30℃培养16小时后用含有萘啶酮酸和阿泊拉霉素的无菌水涂布，最后置于30℃培养3～4天。

所述的YMG平板上含有0.4wt％酵母粉、1wt％麦芽糖提取物、0.4wt％葡萄糖、0.03wt％氯化镁。

③通过阿泊拉霉素抗性进行重组菌株的筛选，并通过PCR产物片段进一步验证得到橙色束丝放线菌的重组菌株，经发酵培养后，实现安丝菌素P-3生物合成产量的提高。

所述的珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)保藏于美国典型微生物菌种保藏中心，保藏编号为ATCC31565，保藏时间为：1979年9月11日。

所述的pIB139质粒具体通过文献：Zhao等，Chemistry&Biology，2008，15(8)：863-874中所记载的方式获得。

技术效果

与现有技术相比，本发明通过质粒串联表达的方法，在链霉菌强启动子PermE*控制下，使得甲基丙二酰ACP前体合成基因簇以及UDP-葡萄糖磷酸酶实现高表达。本发明通过在珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565中共表达甲基丙二酰ACP合成基因簇asm13-17以及asmUdpg基因，耦合增加了安丝菌素生物合成途径中起始单位途径中UDP-葡萄糖以及特殊延伸单位前体甲基丙二酰ACP的供应，实现安丝菌素P-3产量和产率的提高。

附图说明

图1为高表达质粒的构建示意图；

其中质粒pIB139-asm13-17转入野生型菌株ATCC31565后过表达asm13-17基因，得到AP-asm13-17菌株；质粒pIB139-asmUdpg转入野生型菌株ATCC31565中的过表达asmUdpg基因，得到AP-asmUdpg菌株；质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg转入ATCC31565中的共表达asm13-17以及asmUdpg基因，得到菌株AP-asm13-17:asmUdpg菌株；

图2为基因重组菌株与野生型菌株ATCC31565的安丝菌素P-3发酵动态示意图；

图3为野生型菌株ATCC31565与AP-asm13-17:asmUdpg工程菌在3-L发酵罐中发酵过程的溶氧，pH(图3a)、细胞量(图3b)以及AP-3变化的动态过程示意图；

图4为大孔树脂洗脱液中与经过制备液相制备后的AP-3的色谱图；

图5为AP-3的S1 ¹H NMR谱图；

图6为AP-3的S2 ¹³C NMR谱图；

图7为AP-3的S3 DEPT-135谱图；

图8为AP-3的S4 HMBC谱图；

图9为AP-3的S5 HSQC谱图；

图10为AP-3的S6 ¹H-¹H COSY谱图；

图11为AP-3的S7 NOESY谱图。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，本实施例通过以下具体步骤实现三个表达质粒以及相应的菌株的构建：

①构建表达质粒pIB139-asm13-17，具体为：以珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565的基因组DNA为模板，以137F/137R引物通过PCR扩增得到长度为4,451bp的两端含有NdeI/EcoRI酶切位点的asm13-17片段，将得到的基因片段，连接到pMD^@19-T载体上，得到asm13-17-19T；通过测序来验证其序列正确性，通过NdeI/EcoRI酶切，与相应酶切后的pIB139质粒的连接，得到用于asm13-17基因表达的质粒pIB139-asm13-17。

所述的137F/137R引物包括：asm13-17-上游引物(137F)，如Seq ID No.3所示，具体为：5’-GGGAATTCCATATGGTGCCCGGCGACACCGAC-3’；asm13-17-下游引物(137R)，如Seq IDNo.4所示，具体为：5’-CCGGAATTCTCACTGGTCTCCAAGGCGCG-3’，其中划线部分是相应的酶切位点。

②构建质粒pIB139-asmUdpg以及质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，具体包括：

2.1)通过PCR扩增珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565基因组中asmUdpg基因，具体为：在珍贵橙色束丝放线菌asmUdpg基因片段两端设计UdF/UdR引物，分别在基因前后分别加上NdeI和EcoRI酶切位点，将扩增到的不带原始启动子的asmUdpg片段(883bp)插入T载体中构建的UDP-T质粒；

2.2)用NdeI和EcoRI将asmUdpg片段切下插入含有红霉素启动子PermE*的pIB139载体中，得到pIB139-asmUdpg质粒；

2.3)用含有酶切位点的MunI-ermE-F/UdR-EcoRI引物以pIB139-asmUdpg质粒为模板扩增(MunI)-PermE-asmUdpg-(EcoRI)片段，连接T载体后构建UDP-T2质粒，用MunI和EcoRI将PermE-asmUdpg(1,383bp)片段切下插入EcoRI单酶切的pIB139-asm13-17质粒中，验证方向后，得到pIB139-asm13-17:asmUdpg质粒。

所述的UdF/UdR引物包括：Udpg-上游引物(UdF)，如Seq ID No.5所示，具体为：5’-CGCCATATGGCAGGACAGCCTAAGGAC-3’；Udpg-下游引物(UdR)，如Seq ID No.6所示，具体为：5’-CCGGAATTCTGTGCTCATACCTCGTTCATGC-3’。

所述的ermE-F/UdR引物包括：ermE-上游引物(ermE-F)，如Seq ID No.7所示，具体为：5’-CCGCAATTGTATGCATGCGAGTGTCCGTT-3’,其中划线部分是相应的酶切位点。

③表达质粒转入珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565菌株，具体为：

3.1)将已构建完成的表达质粒pIB139-asm13-17、pIB139-asmUdpg、pIB139-asm13-17:asmUdpg分别转化进入宿主，即含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567中，挑取其中任一含有相应表达质粒的ET12567单菌落分别于含有终浓度为25μg/μL的氯霉素,50μg/μL卡那霉素和30μg/μL阿泊拉霉素三种抗生素的LB培养基中37℃过夜培养，按10％的比例转接一次到相同的LB培养基中培养2.5小时；

3.2)用新鲜无抗的LB培养基分别洗涤步骤3.1中得到的含有表达质粒的ET12567菌体和预先培养12-16小时的珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565菌体以除去原培养基中的抗生素或其他杂质，共洗涤三次；

3.3)将上述步骤中等量收集的大肠杆菌ET12567/PUZ8002和珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565混合均匀，涂布于含有MgCl₂的YMG平板上(0.4wt％酵母粉、1wt％麦芽糖提取物、0.4wt％葡萄糖、0.03wt％氯化镁)。待平板吹干后转移至37℃培养箱中培养16小时后，用含有33μl Apr-(30mg/ml)和60μl萘啶酮酸(25mg/ml)的1ml无菌水覆盖，置于28℃恒温培养箱中培养3-4天可以长出单菌落。

3.4)挑取上述阿泊拉霉素抗性平板中长出的单菌落进一步种子液体培养24h后，采用ermE-F/137R、ermE-F/UdR、17F/UdR引物组合，通过下面所述的菌体PCR方法进一步验证结合子，验证正确后将上述种子液稀释10⁵～10⁶涂布与YMG平板培养基中培养2～3天得到的单菌落即为目标工程菌株。

所述的17F引物如Seq ID No.8所示，具体为：5’-ATGCTGGTCGCGCTCACC-3’。

基因片段PCR反应体系和条件：DNA模板30ng，引物30pmol，DMSO 1.25μl，25mM Mg²⁺2μl，10倍缓冲液3μl，KOD聚合酶1个单位，加纯水补齐至50μl；PCR条件：95℃2分钟；95℃30秒；60℃30秒；68℃2分30秒；循环30次。

菌株PCR体系和条件：DNA模板10～100ng，引物30pmol，DMSO 1.25μl，缓冲液3μl，Taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至25μl；PCR条件：95℃5分钟；95℃30秒；60℃30秒；72℃1分钟；循环30次；72℃10分钟。

实施例2

将野生型菌株与实施例1构建得到的工程菌分别摇瓶发酵培养，培养所采用的种子培养基含有(g/l)：酵母提取物10、牛肉浸膏10、无水葡萄糖5、甘油10和氯化钠3；发酵培养基(g/l)：无水葡萄糖5、甘油40、酵母提取物10、蔗糖2.5、碳酸钙2、磷酸氢二钾0.65、七水合硫酸镁0.5、七水合硫酸亚铁0.002、碳酸钙2、异丁醇200μl/60ml，分装60ml/250ml。

上述菌株的发酵培养按照文献(Lin JX等，Bioresource Technology，2011，102(2)：1863-1868)所述方法进行培养，分别经过一级、二级种子培养后，将野生型菌株ATCC31565与构建得到的工程菌的种子液接入发酵培养基中，28度，220rpm，发酵培养8-12天。

上述各个菌株发酵液经过离心后，吸取发酵液上清200μl与800μl乙腈混合，震荡混合，离心后上清过0.22μm有机相滤膜，用高效液相色谱分析AP-3产量。

使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC进行色谱分析，采用DAD二极管阵列检测器测定254nm下的色谱吸收峰。色谱柱的参数为：Agilent ZORBAX SB-C18，5μm，4.6×250mm；流动性流速为0.6mL/min；流动相：85％(v/v)的HPLC级乙腈和15％(v/v)的HPLC级水柱温：28℃。

如图2所示，在野生型菌株中导入pIB139-asmUdpg、pIB139-asm13-17以及pIB139-asm13-17:asmUdpg后，AP-3产量相比于野生型菌株(211.9mg/L)都有增加，AP-3产量分别为355.9mg/L、413mg/L、680.5mg/L，相比于野生型菌株产量分别提高了68％、95％、221％，显著提高了AP-3的生物合成，高于现有技术条件下的最高产量401mg/L。

实施例3

3L-发酵罐中AP-3的发酵

种子培养：根据实施例2中的进行种子培养液的培养，经过一级、二级种子培养，待二级种子培养36小时左右，按照1ml种子液/60ml培养基比例进行接种。

使用3L发酵罐(NBS BioFlo110)，按照实施例2中发酵培养基配方配制1.8L，121℃，灭菌30min，将实施例1中珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565以及导入pIB139-asm13-17:asmUdpg质粒的AP-asm13-17:asmUdpg工程菌种子无菌接入，同时加入6ml异丁醇，培养条件为温度28℃，pH 7.5，转速400rpm，通气量为1VVM，K_La＝70h^-1条件下进行批次发酵。HPLC测得发酵结束时AP-3产量为547mg/L。发酵过程的溶氧，pH、细胞量以及AP-3变化的动态过程见图3。

实施例4

发酵液中AP-3的分离纯化

将发酵结束后收集到的发酵液，常温10000g离心20min，0.45μm的滤膜抽滤，调整发酵液pH值为7左右，量取1L抽滤后发酵上清液通过含有50g HZ803大孔树脂(上海华震科技)的15cm*55cm大孔树脂层析柱，使AP-3吸附到层析柱上。通过溶剂的浓度梯度进行除杂和洗脱AP-3。初始溶剂为水，然后增加乙醇的浓度先除去杂质，最后用一定浓度的乙醇洗脱AP-3，洗脱后的AP-3的色谱图如图4A。合并含有AP-3的洗脱液进行旋转蒸发浓缩，将上述浓缩液取100mL上样到Agilent 1200系列半制备液相，制备柱为大连依利特ODS-BP 5μm10mm*250mm，收集纯的AP-3，并将多余溶剂旋转蒸发掉。最后经过真空冷冻干燥48h，得到9.7mg纯的AP-3，以高效液相检测其液相峰纯度为99.5％以上，具体见图4B。

同时将得到的物质(AP-3)全部用600μl氘代氯仿溶解,核实该产物(AP-3)的全套核磁图谱,具体如图6～图11所示,得到碳谱¹³C NMR(600MHz,Chloroform-d)δδ175.5,168.3,156,152,142.3,140,139.7,132.4,127.6,124.4,121.9,119.3,112.8,88.4,80.7,76.7,74.2,66.2,60.4,56.6,56.5,47.1,38.7,35.8,35.5,33.8,32.7,20,17.9,15.6,14.5,12.1。

氢谱为：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ6.88(1H,d,J51.6),6.84(1H,d,J51.6),6.44(1H,dd,J511.2,15.6),6.28(1H,s),6.16(1H,d,J510.8),5.46(1H,dd,J59.2,15.2),4.81(1H,dd,J53.0,11.9),4.28(1H,t,J511.2),3.99(3H,s),3.53(1H,d,J512.6),3.49(1H,d,J58.9),3.36(3H,s),3.20(1H,d,J512.4),3.16(3H,s),2.96(1H,d,J59.6),2.60(1H,m),2.56(1H,dd,J512.1,13.9),2.18(1H,dd,J52.8,14.0),1.69(3H,s),1.64(2H,d,J513.2),1.45(1H,m),1.29(3H,d,7.2),1.27(3H,d,J57.1),1.21(3H,d,J56.5),0.83(3H,s)。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 提高安丝菌素P-3生物合成产量的方法

<160> 7

<210> 1

<211> 4452

<212> DNA

<213> asm13-17

<400> 1

tcagcgcgtg cgacgggcca gggtcatgcc gtcggcgtgc gcgagcagca cggcctggac 60

ccggtcgtcg gcggcgatcc tgcggttgag ctcccggacg ccctcggtgt cggggtccac 120

cgcggcgggg tcggcgaccc ggccggagaa cagggtgttg tccacgacga ccagcccgcc 180

ggggcgcacc agctcgacgg ccagctcgta gtagcggggg tacccggcct tgtccgcgtc 240

cacgaacacc aggtcgaccc ggcccgcgag ctcgccggtc agcccggcga ggctgcccgc 300

ggcgtcgccg acgagcacct cgatccggtc cgcgacgccc gcgcgctccc agtgcggccg 360

ggcgatcgcg ggccacttgg ggctcagctc gcaggtgatc acccggccgc cgtcggggag 420

ggcggaggcc aggcacagcg tgctgcaccc ggtgaaggtg ccgacctcca cgaccagccg 480

ggccccggtg agcgcgacca gcatggcgag gaaagcgcct tcccccggtg ggacggggag 540

gacgccgccg ccgggcagca gcgcggtctc ggcgcgcagc tcggcgagcg ccgccggttc 600

cggctgggag acctcgcgca ggtagtcgag cagcgcgggc gtgacgacga cctgctcacc 660

cacgggtggg cacctccagc agcgacgggg cttcgacggt gaccgcgcgc ggggcgggtc 720

ggggcgcggg gcgcaggtgc agccgccgca ccgggttccc gctggcacgc gcctcgggaa 780

cctcggcgac ggggacatca gcggcgcggg gctcggcggt ccggggctca gccacgcgag 840

actcggcagc gcggggctca gccacgcgag actcggcagc gcggggctca gccacgcgag 900

actcggcagc gcgaggctcg gcagcgcgag tctcggcagc accggttcct ggagcaccgc 960

ccgcgggagc accgcccgcg ggagcaccgg ctcctgaagc accggctccc gaggcgccga 1020

tccccggagc gcccgcgcct ggggcgcctg ccgcagcgag gtgttcgggg ccgccgccca 1080

ccgccgccag ctcggcgcgg caggcgcagt cggcgtcgtc gtacccggcg aaccggtagg 1140

cgatctccat catgcggttg cggtcggtgc gccggaagtc ggccaccagg tgcgcgcccg 1200

cctccagcgc ctgcccgcac agccagtcca gcagcacgct gcccacgccg tagggcacca 1260

cccggcacga ggtcgccagc agcttcaggt gccacgcggc ggtgtgccgc tccagcagca 1320

cgatgccgat cgcgccgtgc ggcccgaacc ggtcggtcag gcccgccacc agcacctcgt 1380

gcgccgggtc gtccagcagg gcgcgcaact gcccgtgcgg gtagtgcacg ccggtcgcgt 1440

tcatctggct ggtgcgcgcg gtcagctcct cgacccggtg caggtcctcg ggcctggccc 1500

ggtcgatccg cagcaccagt cccagcgagc gcaggaactc ctcgtcgggc ccggtgaacg 1560

cggcctgctc ggcgccgcgc gcgaacccgg cccggtagag ggcgcggcgg ttgcgggcgt 1620

cctcggtgac gacggcgggg ctgaactcgg gcagcgagca cagctccagc acgcgctcgg 1680

ccgggtagca gcggacctcg ggcaggtgga aggcgacctc ggcgcgctcg gcgggccggt 1740

cgtcgacgaa cgcgatggcg cggtgcgcga agcccagccg gtcggcgatg cgggcgacgg 1800

cggcggactt gacgccccag ccgatctcgg gcagcacgaa gtactcggcg acgcccagcg 1860

cctccagcgc ggcgagggcg ggctcggggt cgttgcggct ggccaccgac tggagcacgc 1920

cgcgcgcgtc cagctcgacg atcgcggcgc ggacccgctc gtccagcacg ggcgcgtcgc 1980

cctcggcgag ggtgccgcgc cagagcgtgt cgtccaggtc ccacaccagg cacttgacca 2040

ggtcgccgct cacgccgtcg ccaccgcgtg ctcggccagc acgagcctgc acagctcgtt 2100

gctgccctcg atgatctcca tgagcttggc gtcccggtag gcgcgcgcga cggggtggcc 2160

gtcgtgggcg cccgccgagg cgagcacctg gacggcggtg gcggcggcgc gcgccgcgtg 2220

ccccgcgctc acgtgcttgg cgagcacggt ggcggtgacc agctcggccg agctctcgtc 2280

ccagcggcgg ctggcgtgct cgcacaccct ggtggagacc tgctcggcga ccagcaggtc 2340

ggcgaggtgg cccgcgacga gctggtgcgc ggccagcggc acgccgaact ggcggcgggt 2400

gcgggcgtgc tcggcggacg cggccaggca ggcgcgcagg atgccgacgc agccccacgc 2460

cacggacagc ctgccgtgcg cgaggaccgt ggtgaccagc agcgcggtgg agacgccgtc 2520

gccgcccagc accgaggtgg cgggcaggcg cacgtcgtcc agctcgacgt cggcgtggcc 2580

cgcggcccgg cagcccatcg ggttggcgac gggggtgatc gtgacaccgg gcgcggtggc 2640

gggcaccagc gcgaccgccg cgccgtcgcc gcgcctgccc gccacgagga gcaggtcggc 2700

gtagcgggcc gcggtggtcc acaccttgtg gccgcgcacc aggaccgtcc ccggttcgcc 2760

ggggtcgtcc tcgacggtgg tggccatggc ggacaggtcg ctgcccgcgc cgggctcgct 2820

gagcgccacg gcggccagcg agcccccggt gagcctgggc agcacggcgg cgcgctgcgc 2880

ctggtcgccg aggcggcgca cggtccaggc ggccatgccc tgcgaggtct ggacgctgcg 2940

caccgagccg cacagcgcgc cggtgcgggc ggtcagctcg ccgttgtcca ggctgccgag 3000

cccgaggccg ccgtgccgct cggcgacctc accgcacagc gcgcccgccg cgccgagctc 3060

gcggagcgcg gccaccggca gctcgcccgc caggtcccac tcccccgccc ggtcggcgac 3120

cacccgctcg accagcgcgg tcgcctcgtc cacccggtca gccaccggcg ccgcccgcgc 3180

ggagccggtc cacgagcgcg gtcatggcgc gcaccgtgcg gaagttgtcc agccgcaggt 3240

cggggcccgc gatctcgacg tcgaagcact gctccaggtg cacgaccagc tccatcgcga 3300

acagcgacga caggccgccc tcggcgaaca ggtcccgctc ggcgtcccac tcggcgccgg 3360

tgcgggcgcg caggaagtcc agcaccgcgc cctggacgtc gtcggtccgc gactccgtgc 3420

ccgaggtcat cgccccgtcc cttcacggcc ggggtggccg tagtcgtaga agccccggcc 3480

gctcttgcgc ccgaggtgcc ccgcgtcgac cttggccagc agcaggtcgc acggctcgca 3540

ccgctcgtcc ccggtgcgcc tgcgcagcac gcgcagcgag tcgacgaggt tgtcgatgcc 3600

gatcaggtcg gcggtgcgca gcgggccctc gcggtggccg aggcagtcgc gcatgagcgc 3660

gtcgacggcg gcggcgtcgg cggtgcccga ctccacgacg cgcgccgcgt cgttgatcat 3720

cgggtgcagc aggcggctgg tgacgaagcc cggcgcgtcg ccgacctgta ccggggcgcg 3780

gccgaggcgc gcgagcaggg cggtgagccc ggcgaacgcc gcgtccgagg tcagcgggcc 3840

gcgcgctacc tcgacggcgg ggatcaggta cggcgggttc atgaagtgcg cgcccacgag 3900

gtcgccgggc ctgggcagcg cgggggccag ctcgcccatg gggatggagg aggtgttgga 3960

gaccagcggg gtgcccggcg ggacggtggc gcagaccccg gtgagcgcct tggccttggt 4020

ctcggcgtcc tcggtgaccg cctcgaccac ggcgaccacc tcgcgggggc cgcccgtgtc 4080

ggtcgcggtg gtcagctcgc cgagcggccc ggcggcgacg ccgagcagct gggcggtccg 4140

caggtgcgcg cgcacgtcgg cgcgggccgc gtcgagccgg tcggcgtccg ggtccaccag 4200

gagcacgggc aggcccctgg agagcgcgag cgcggtgatc ccgcagccca tgacgcccgc 4260

gcccagcacc agcagcgggc gctccccggc cgggcggccc ggttcgccgg gcgacgcgcc 4320

gccgcgcgcc gcgccgccgg gcgacatgcc gccggaggac ggaccgaggg acgacgggcc 4380

gtcgggtggc gggccgtcgg gtgacgggct ggcgagcgct cgggccggtg ggtcgtcggt 4440

gtcgccgggc ac 4452

<210> 2

<211> 882

<212> DNA

<213> asmUdpg

<400> 2

tcaggagttg ccgaggcgac cccgcaacca ctcaccgagc tcgggcccgt agtccgggtg 60

ctccaacgcg aagtcaaccg cagccttgag gaaacctccc ggattgccca ggtcgtgtcg 120

cccaccgcgg tggaccacga cgtgcaccgg gtggccctcg gagatcagca gcgcgatggc 180

gtcggtgagc tggagctcgc cgcccgcgcc gggggtgatc cgcttgaggg cgtcgaagat 240

cgcccgatcg aggaggtagc ggcccgcggc ggcgtaggtg gacggagcgt cctcggcctt 300

gggcttctcg accatgccga cgacctgctt gacgtcgtcg tcgtcggtgt cgttcacgtc 360

gaacacgccg tacgcggata tctgctcgcg cgggatgtcg aacgcgcaca gcacgctgcc 420

gccgaagcgg tcgcgcacgg cggccatgcg ggagagcacg ccggtgggga gcaccaggtc 480

gtcgggcagc agcacggcga cggcctcgtc ggcgtcggtc aggttggcct cggcgcagcc 540

gacggcgtgg ccgagcccga gggccttctc ctggagcgcg gtctccacgt cgagcagggc 600

gggggcgcgg cggaccttgg cgaccaggtc ggacttgccg cggctctcca gggtctcctc 660

cagctcgggc tgggggcgga agtactgcgc caccgactcc ttgccggggg aggtgacaat 720

gatcagcttg gtggcgcccg cctcggccgc ctcggtggcg acgagttcga tgccgggggt 780

gtcgacgacc ggcagcagct ccttgggcac ggccttggtg gtcgggagga agcgggtgcc 840

caacccggcc gcgggcacga ttgctgtcgt gaaggcgctc at 882

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 137F

<400> 3

gggaattcca tatggtgccc ggcgacaccg ac 32

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 137R

<400> 4

ccggaattct cactggtctc caaggcgcg 29

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> UdF

<400> 5

cgccatatgg caggacagcc taaggac 27

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> UdR

<400> 6

ccgcaattgt atgcatgcga gtgtccgtt 29

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> ermE-F

<400> 7

ccggaattct gtgctcatac ctcgttcatg c 31

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 17F

<400> 8

atgctggtcg cgctcacc 18

Claims

1.一种提高安丝菌素P-3生物合成产量的方法，其特征在于，通过构建asm13-17基因的表达质粒pIB139-asm13-17、构建asmUdpg基因的表达质粒pIB139-asmUdpg以及构建共表达asm13-17基因和asmUdpg基因所对应的整合型表达质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，并将上述表达质粒分别转入珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中，实现生物合成表达量的提高；

所述的asm13-17基因是甲基丙二酰ACP合成酶基因，如Seq No.1所示；所述的asmUdpg基因是UDP-葡萄糖磷酸酶酶基因，如Seq No.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的质粒构建，具体过程步骤包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的平板培养是指：将大肠杆菌ET12567/PUZ8002和珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565菌丝体涂布于含有MgCl₂的YMG平板上，30℃培养16小时后用含有萘啶酮酸和阿泊拉霉素的无菌水涂布，最后置于30℃培养3～4天。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的YMG平板上含有0.4wt％酵母粉、1wt％麦芽糖提取物、0.4wt％葡萄糖、0.03wt％氯化镁。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的pIB139-asm13-17，具体通过以下方式得到：以137F/137R引物通过PCR扩增得到长度为4,451bp的两端含有NdeI/EcoRI酶切位点的asm13-17片段，将得到的基因片段，连接到pMD@19-T载体上，得到asm13-17-19T；通过NdeI/EcoRI酶切，与相应酶切后的pIB139质粒的连接，得到用于asm13-17基因表达的质粒pIB139-asm13-17。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的137F/137R引物包括：asm13-17-上游引物(137F)，如Seq ID No.3所示，具体为：5’-GGGAATTCCATATGGTGCCCGGCGACACCGAC-3’；asm13-17-下游引物(137R)，如Seq ID No.4所示，具体为：5’-CCGGAATTCTCACTGGTCTCCAAGGCGCG-3’，其中划线部分是相应的酶切位点。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的pIB139-asmUdpg，具体通过以下方式得到：

2.1)通过PCR扩增珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565基因组中asmUdpg基因，具体为：在珍贵橙色束丝放线菌asmUdpg基因片段两端设计UdF/UdR引物，分别在基因前后分别加上NdeI和EcoRI酶切位点，将扩增到的不带原始启动子的asmUdpg片段插入T载体中构建的UDP-T质粒；

2.2)用NdeI和EcoRI将asmUdpg片段切下插入含有红霉素启动子PermE*的pIB139载体中，得到pIB139-asmUdpg质粒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述的UdF/UdR引物包括：Udpg-上游引物(UdF)，如Seq ID No.5所示，具体为：5’-CGCCATATGGCAGGACAGCCTAAGGAC-3’；Udpg-下游引物(UdR)，如Seq ID No.6所示，具体为：5’-CCGGAATTCTGTGCTCATACCTCGTTCATGC-3’。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述的pIB139-asm13-17:asmUdpg，具体通过用含有酶切位点的MunI-ermE-F/UdR-EcoRI引物以pIB139-asmUdpg质粒为模板扩增(MunI)-PermE-asmUdpg-(EcoRI)片段，连接T载体后构建UDP-T2质粒，用MunI和EcoRI将PermE-asmUdpg片段切下插入EcoRI单酶切的pIB139-asm13-17质粒中，验证方向后，得到pIB139-asm13-17:asmUdpg质粒。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征是，所述的ermE-F/UdR引物包括：ermE-上游引物(ermE-F)，如Seq ID No.7所示，具体为：5’-CCGCAATTGTATGCATGCGAGTGTCCGTT-3’,其中划线部分是相应的酶切位点。