CN115322918B - 一种高产安丝菌素p-3的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物制药领域，提供了一种高产安丝菌素P‑3的菌株及其应用。所述高产安丝菌素P‑3菌株为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)，由土壤样品中分离的原始菌种经复合诱变筛选获得，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.21355。该菌株连续传代6代，安丝菌素P‑3的发酵水平仍大于300μg/mL，是相同培养条件下原始菌种的2～3倍，可用作安丝菌素P‑3工业化生产菌株。

Description

一种高产安丝菌素P-3的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物制药领域，具体地涉及一种高产安丝菌素P-3的菌株及其应用。
背景技术
安丝菌素(ansamitocin)是一种美登素类抗生素，母核为19-C的大环内酰胺环，按C-3连接不同长度的碳链，可分为AP-0，AP-1、AP-2、AP-3、AP-4和AP-4’。安丝菌素P-3(AP-3)经过特定化学修饰之后可以合成一种化学小分子美登素Mertansine(DM1)。DM1是一种微管蛋白抑制剂，也是一种抗体可缀合的美登木素生物碱，用于克服与美登素相关的全身毒性并增强肿瘤特异性递送。DM1通过连接体连接到单克隆抗体上，形成抗体药物结合物(ADC)，比如全球首个应用于实体瘤的抗体药物偶联剂T-DM1，由靶定乳腺癌的抗体曲妥珠单抗结合微管抑制剂美登素衍生物DM1(trastuzumab-DM1)通过连接子偶联而成，具有靶向性和细胞毒杀伤双重抗肿瘤作用。早在2013年2月已经获美国FDA批准用于治疗已经接受过曲妥珠单抗和一线紫杉烷类化疗无效的HER2阳性晚期乳腺癌患者。
安丝菌素P-3结构稳定、疏水性强易于萃取，是合成美登素的最佳前体，其制备方法主要有微生物发酵法、前体诱导法、化学合成、半合成等途径。因美登木素结构复杂存在全合成和半合成工艺复杂、过程繁琐、产率很低、反应专一性差等缺点；微生物发酵法具有污染低，生产不受地域限制等特点，因而是目前较为常用的方法。通常珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素总量一般在10-50mg/L，AP-3占比一般不到50％。CN102732581B提供了一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素的方法，通过优化发酵培养基的成分及发酵条件可提升安丝菌素P-3的产量，提升后安丝菌素P-3的表达量最高达到150mg/L左右；CN105907681B提供了一种高产安丝菌素P-3的突变株及安丝菌素P-3的制备方法，该方法必须要在补料分批发酵5～7天的情况下，安丝菌素P-3发酵量最高才可达到200mg/L左右。已知的关于束丝放线菌发酵生产安丝菌素的报道中，安丝菌素P-3产量仍需提高，因此挖掘高产菌株继续提高发酵安丝菌素P-3产量的技术研究仍具有重要价值。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种高产安丝菌素P-3的菌株，其分类命名为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)，该菌株已于2020年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC NO.21355。
本发明的另一个目的在于提供一种安丝菌素P-3的制备方法，所述制备方法使用了上述高产菌株，其包括以下步骤：
步骤一：取土壤样，制成土壤混悬液，梯度稀释后，通过含抗高氏培养基培养、菌落生长形态筛选、16s-rDNA菌种鉴定序列、液相分析确定发酵产物，得到产安丝菌素的原始菌株；
步骤二：将原始菌株经过高氏固体培养基、种子培养基、发酵培养基培养，分离筛选得到安丝菌素P3产量大于100μg/mL的优化菌株；
步骤三：将优化菌株通过紫外照射、异丁醇筛选，最后发酵培养，筛选得到安丝菌素产量大于300μg/mL的高产菌株；
步骤四：将该高产菌株连续培养6代，通过摇瓶检测安丝菌素P-3产量，鉴定菌种传代稳定性。
具体地，所述高氏固体培养基成分包含：硝酸钾1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂20.0g/L，pH值7.2-7.4。
具体地，所述种子培养基成分包含：可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，黄豆粉20g/L，氯化钠5g/L,磷酸氢二钾5g/L，余量为水，消毒前pH为6.0。
具体地，所述发酵培养基成分包含：可溶性淀粉20g/L，蔗糖10g/L，棉籽精粉20g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钙5g/L,磷酸氢二钾5g/L，余量为水，消毒前pH为6.0。
具体地，步骤一中所述含抗高氏培养基培养是指：含有50μg/mL氨苄青霉素钠和25μg/mL的卡那霉素的高氏固体培养基。
具体地，步骤一中所述根据菌落生长形态筛选的菌落为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)，其生长形态特征为：起初呈浅黄色，后期颜色逐步变深为橘黄色，菌落近圆形，表面干燥凸起，中央或有开裂，培养7天以后菌落周边可能形成散环形菌丝圈或在表面出现白粉状气生菌丝。
具体地，步骤一中所述液相分析确定发酵产物是指：将16s-rDNA鉴定验证过的纯化单菌落挑取到种子培养基，28℃、220rpm培养40hr，再以10％的接种量接入发酵培养基，28℃、220rpm培养7～10天。然后取上述发酵液处理后送HPLC检测，与安丝菌素对照品进行对比确认。
具体地，步骤一中所述液相分析条件为：C18柱(2.7μm 4.6mm*100mm)，检测波长252nm，柱温40℃，流速1.0mL/min，进样体积5μL，流动相为乙腈：水＝42：58。
具体地，步骤三中所述紫外照射条件为：15W紫外灯下30cm处照射0s～3min(例如30s，1min，3min，不含0s)。
具体地，步骤三中所述异丁醇筛选指的是：用含有0～0.2％(V:V，不含0)异丁醇的高氏固体培养基培养筛选耐异丁醇的菌株。
本发明还提供了所述珍贵束丝放线菌CMC2003-A3-86在发酵生产安丝菌素P-3中的应用。
具体地，所述应用是珍贵橙色束丝放线菌CMC2003-A3-86的发酵液中可提取安丝菌素P-3，用于工业生产安丝菌素P-3。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种高产安丝菌素P-3的菌株及其应用，利用抗性初筛以及16s-rDNA鉴定确认产安丝菌素P-3的珍贵束丝放线菌原始出发菌株，其产安丝菌素P-3的效价约为100μg/mL；经过诱变筛选培养后获得的高产安丝菌素菌株，不需要补料发酵，简单发酵10天安丝菌素P-3产量可达335μg/mL，是相同培养条件下原始菌种的3倍，可用作安丝菌素工业化生产菌株，大幅度降低安丝菌素P-3规模化生产成本。
附图说明：
图1为本发明实施例1菌种CMC2003-A0在固体培养基上的菌落形态
图2为本发明实施例1对照品溶液HPLC图
图3为本发明实施例1原始菌种发酵液HPLC图
图4为本发明实施例4菌株传代稳定性趋势图
具体实施方式：
以下将结合具体实施方式详细说明本发明内容，但本发明的范围不限于此。
以下具体实施例中，如无具体说明，使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；所使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例内容可以知道如何具体实现所述方法，并实现相应的结果。
下面实施例中所用培养基配方组成如下：
高氏固体培养基：硝酸钾1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂20.0g/L，pH值7.2-7.4。
液体种子培养基：可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，黄豆粉20g/L，氯化钠5g/L,磷酸氢二钾5g/L，余量为水，消毒前pH为6.0。
发酵培养基：可溶性淀粉20g/L，蔗糖10g/L，棉籽精粉20g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钙5g/L,磷酸氢二钾5g/L，余量为水，消毒前pH为6.0。
实施例1.安丝菌素原始产生菌的分离鉴定及菌株保存
(1)原始菌株Actinosynnema pretiosum CMC2003-A0的分离、筛选
土壤样品取自浙江省杭州市莫干山风景区腐化树叶下层，取样量5g，用20mL含抗无菌水(含有50μg/mL氨苄青霉素钠和25μg/mL的卡那霉素)制备成土壤悬液，静置10分钟后过滤，菌悬液梯度稀释成原液、10-2、10-4、10-6，分别取100μL的原液及不同梯度菌悬液，均匀涂布到含抗高氏培养基(含50μg/mL氨苄青霉素钠和25μg/mL卡那霉素)上，于28℃、60％相对湿度的恒温恒湿厢内倒置培养3天。观察有单独分布的不同形态单菌落平板，将所能看到的浅黄色有气生菌丝形态的单菌落在含抗高氏培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素钠和25μg/mL卡那霉素)上划线，于28℃、60％相对湿度的恒温恒湿厢内倒置培养9天，每天观察。挑取纯化后的单菌落制片，镜检。
(2)原始菌株Actinosynnema pretiosum CMC2003-A0的鉴定
对该菌株从形态生长特征、16s-rDNA序列鉴定和液质分析确定，分离所得CMC2003-A0为产安丝菌素的珍贵橙色束丝放线菌Actinosynnema pretiosum。
形态生长特征：菌落起初呈浅黄色，后期颜色逐步变深为橘黄色，菌落近圆形，表面干燥凸起，中央或有开裂，培养7天以后菌落周边可能形成散环形菌丝圈或在表面出现白粉状气生菌丝(图1)。
16s-rDNA菌种序列鉴定：挑选镜检呈丝状放线菌的单菌落对应编号，对此类菌株进行16s-rDNA菌种鉴定并分析。将检测菌株16s-rDNA序列测定结果与GeneBank上已知序列的Actinosynnema pretiosum菌株进行同源性比较，其与Actinosynnema pretiosumstrain X47chromosome,complete genome同源性最高，达到99.71％。根据菌株形态生长特征及16s-rDNA序列的测定结果，鉴定该菌株为珍贵束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)。
安丝菌素产物确认：将16s-rDNA验证过的纯化单菌落挑取到种子培养基，28℃、220rpm培养40hr，再以10％的接种量接入发酵培养基，28℃、220rpm培养7～10天。取上述发酵液1mL，用2倍体积无水乙醇混匀后超声30min，24000rpm离心15min，取上清液用0.45μm膜过滤后进行HPLC检测，与安丝菌素对照品进行对比确认。检测结果发现发酵液在RT2.53min有明显出峰，与安丝菌素对照品的RT2.54min在误差范围内认为基本一致(图2，图3)。通过该方式获得一株产安丝菌素的珍贵橙色束丝放线菌。该菌种保藏于本公司菌种保藏管理中心，内部编号Actinosynnema pretiosum CMC2003-A0。
HPLC检测条件：C18柱(2.7μm 4.6mm*100mm)，检测波长252nm，柱温40℃，流速1.0mL/min，进样体积5μL，流动相为体积比42：58的乙腈-水溶剂。
实施例2.Actinosynnema pretiosum CMC2003-A0菌株初次筛选
将Actinosynnema pretiosum CMC2003-A0菌株涂布在高氏固体培养基上，于28℃、60％相对湿度的恒温恒湿厢内倒置培养7天，得到48颗单菌落。
选取培养成熟单菌落，无菌竹铲挖下整颗单菌落，分别接种于装有20mL种子培养基的250mL锥形瓶中，置于28℃，220rpm摇床上培养48h至对数生长期。将上述种液分别吸取0.2mL接种到装有20mL发酵培养基的250mL锥形中，置于28℃，220rpm摇床上培养10天。余下种液各取1mL加入1mL 40％无菌甘油制成菌丝冻存管，放置超低温冰箱保存。
取上述发酵液各1mL，用2倍体积无水乙醇混匀后超声30min，14000rpm离心15min，取上清液用0.45μm膜过滤后高效液相检测，获得一株产量为115μg/mL的原始Actinosynnema pretiosum CMC2003-A0-35.
实施例3.安丝菌素高产菌种制备与验证
取出Actinosynnema pretiosum CMC2003-A0-35菌丝冻存管为原始出发菌株，吸取菌丝液100μL梯度稀释成10-4、10-5，不同梯度各取100μL涂布在高氏固体培养基上，于28℃、60％相对湿度的恒温恒湿厢内倒置培养7天，得到新鲜单菌落。
取生长好的固体培养单菌落1皿，用无菌竹铲将整皿单菌落刮下，转移到加有玻璃珠和15mL无菌生理盐水的锥形瓶中，包扎好置于摇床上振荡打散30min，得到分散良好的菌悬液。
取制备好的菌悬液倒入无菌平皿中，放入一无菌磁力搅拌子，置于磁力拌器上、15W紫外线下30cm处分别照射0s，30s，1min，3min，取未照射的样品100μL梯度稀释成10-4、10-5，然后各取100μL涂布到高氏培养基上；取照射30s，1min和3min的样品分别稀释成成原液、10-2、10-3、10-4，然后各取100μL分别涂布到含有0.1％和0.2％(V:V)异丁醇的高氏固体培养基上；将所有涂布好的固体培养基于28℃、60％相对湿度的恒温恒湿厢内倒置培养7天。
在上述未照射样品涂布的高氏培养基上挑取单菌落各15株，照射30s、1min、2min含有0.1％、0.2％(V:V)异丁醇的高氏固体培养基上挑取单菌落各20株，将这些单菌落整颗挖下分别接种到含有25mL液体种子培养基的锥形瓶中，置于28℃，220rpm摇床上培养48h，即制备得到不同来源菌株的种子培养液。
发酵培养基的成分和配比：可溶性淀粉20g/L，蔗糖10g/L，棉籽精粉20g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钙5g/L,磷酸氢二钾5g/L，余量为水，消毒前pH为6.0，消后加异丁醇1g/L。
将上述150瓶种子培养液各吸取0.2mL分别接种到装有20mL发酵培养基的250mL锥形中，置于28℃，220rpm摇床上培养10天。余下种液各取1mL加入1mL40％无菌甘油制成菌丝冻存管，放置超低温冰箱保存。发酵培养结束后，将150瓶发酵摇瓶分别吸取1mL发酵液，用2倍体积无水乙醇混匀后超声30min，14000rpm离心15min，取上清液用0.45μm膜过滤后高效液相检测。根据检测结果对比，获得一株高产菌株，发酵10天安丝菌素效价为335μg/mL，内部编号CMC2003-A3-86。该菌种已于2020年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.21355。
实施例4.安丝菌素高产菌种传代稳定性研究
将经实施例3验证过的高产安丝菌素菌株CMC2003-A3-86进行连续培养6代，通过摇瓶鉴定检测菌种传代稳定性。以上面筛选到的CMC2003-A3-86(标为F0代)为参照，菌株传代6代发酵实验结果见下表1，菌株传代稳定性趋势图见附图(图4)。通过实验可知，CMC2003-A3-86菌株稳定性好，传了6代基本维持在同一较高水平，满足工业化菌株要求。
表1
尽管本发明已经对上述各实施案例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施案例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江珲达生物科技有限公司
杭州中美华东制药有限公司
<120> 一种高产安丝菌素P-3的菌株及其应用
<130> P0102021060455
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccccttgcg ggttgggcca cgggcttcgg gtgttaccga ctttcgtgac gtgacgggcg 60
gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcagcgttgc tgatctgcga ttactagcga 120
ctccgacttc acggggtcga gttgcagacc ccgatccgaa ctgagaccgg ctttatggga 180
ttcgctccac ctcacggctt agcagccctt tgtaccggcc attgtagcat gtgtgaagcc 240
ctggacataa ggggcatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccgag ttgaccccgg 300
cagtctccca tgagtccccg ccataacgcg ctggcaacat ggaacgaggg ttgcgctcgt 360
tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca ccacctgtac 420
accggccaca agggggccaa tatctctact ggtttccagt gcatgtcaag cccaggtaag 480
gttcttcgcg ttgcatcgaa ttaatccaca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540
ttcctttgag ttttagcctt gcggccgtac tccccagggc ggggtgctta atgcgttagc 600
tgcggcacgg aggacgggga agtcccccac acctagccac ccaccgttta cggcgtggac 660
taccaggggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg ctcctcagcg tcagtatcgg 720
cccagagacc cgccttcgcc accggtgttc ctcctgatat ctgcgcattt caccgctaca 780
ccaggaattc cagtctcccc tgccgaactc aagtctgccc gtatcgaccg caggctcggg 840
gttaagcccc aagttttcac ggccgacgcg acaaaccgcc tacgagctct ttacgcccaa 900
taattccgga caacgctcgc accctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960
gtgcttcttc tgcaggtacc gtcacttgcg cttcgtccct gctgaaagag gtttacaacc 1020
cgaaggccgt cgtccctcac gcggcgtcgc tgcatcaggc tttcgcccat tgtgcaatat 1080
tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccggtca 1140
ccctctcagg ccggctaccc gtcgtcgcct tggtaggcca ttaccccacc aacaagctga 1200
taggccgcgg gtccatcctg taccgccgga actttccaac ccaccccatg cggggaaggc 1260
tcgtatccgg tattagacct agtttcccag gcttatccca gagtacaggg caggttaccc 1320
acgtgttact cacccgttcg ccgctcgtgt accccgaagg gccttaccgc tcgacttgca 1380

Claims (10)

1.一种生产安丝菌素 P-3 的菌株， 其特征在于： 所述菌株为珍贵束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum）CMC2003-A3-86, 该菌株于 2020 年 12 月 11 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为： CGMCC NO.21355。
2.权利要求 1 所述的菌株在生产安丝菌素 P-3 中的应用。
3.一种使用权利要求1所述的菌株制备安丝菌素 P-3 的方法，其特征在于：将所述珍贵束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum）CMC2003-A3-86 接种至发酵培养基， 发酵培养， 获得含安丝菌素 P-3 的发酵液，将发酵液经分离纯化，得到所述安丝菌素 P-3。
4.根据权利要求 3 所述制备安丝菌素 P-3 的方法， 其特征在于， 所述发酵培养的接种量在5%- 15%。
5.根据权利要求 3 所述制备安丝菌素 P-3 的方法， 其特征在于，所述发酵培养基的组成为缓释碳源、速效碳源、缓释氮源、速效氮源、无机盐及水，消毒前发酵培养基 pH 为6.0~7.5。
6.根据权利要求 5 所述制备安丝菌素 P-3 的方法， 其特征在于，所述发酵培养基中的缓释碳源为可溶性淀粉,玉米淀粉，麦芽糊精中的一种或几种， 比例 10~30g/L。
7.根据权利要求 5 所述制备安丝菌素 P-3 的方法， 其特征在于，所述发酵培养基中的速效碳源为蔗糖，葡萄糖， 甘油中的一种或几种，比例 10~40g/L。
8.根据权利要求 5 所述制备安丝菌素 P-3 的方法， 其特征在于，所述发酵培养基中的缓释氮 源为黄豆粉， 豆粕粉， 大豆蛋白粉， 麸质粉， 棉籽精粉中的一种或几种， 比例10~40g/L；速效氮源为酵母抽提物，酵母浸出粉，蛋白胨中的一种或几种，比例 5~10g/L。
9.根据权利要求 5 所述制备安丝菌素 P-3 的方法， 其特征在于，所述发酵培养基中的无机盐为碳酸钙， 磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，硫酸镁中的一种或几种。
10.根据权利要求 3 所述制备安丝菌素 P-3 的方法， 其特征在于，所述发酵培养基的组成为： 可溶性淀粉 10~30g/L，蔗糖 10~40g/L，棉籽精粉 10~40g/L，酵母抽提物 5~10g/L，氯化钙 2~8g/L, 磷酸氢二钾 2~8g/L，余量为水，消毒前发酵培养基的 pH 为 6.0。
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