CN101851591B - 一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素b的发酵方法及发酵培养基 - Google Patents
一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素b的发酵方法及发酵培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种纤维堆囊菌发酵培养基，其包括碳源、氮源、无机盐、大孔吸附树脂和水，其还含有氨基酸。其用于发酵培养纤维堆囊菌制备埃坡霉素B时，菌株性能稳定，生长快速，产品埃坡霉素B的产量明显提高。本发明还提供了使用本发明的纤维堆囊菌发酵培养基发酵培养纤维堆囊菌生产埃坡霉素B的发酵方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素B的发酵方法及发酵培养基。
背景技术
埃坡霉素B作为粘细菌纤维堆囊菌的次级代谢产物，是一种微管超稳定的新型抗肿瘤活性物质。埃坡霉素B的作用机制与紫杉醇相同，但其在抗肿瘤谱、抗肿瘤活性、安全性、水溶性及合成方法等方面均优于紫杉醇，是一类前景广阔的新型抗肿瘤药物。
为了进行埃坡霉素的大规模生产，生物发酵是理想的途径。埃坡霉素B一般由粘细菌纤维堆囊菌Sorangium cellulosum 90发酵生产。专利WO93/10121中报道，在含碳源、氮源和无机盐的介质中培养纤维堆囊菌的菌株，并在培养过程中加入吸附性树脂，可生产得到低产量的埃坡霉素B。文献《纤维堆囊菌的代谢产物及其生物学活性分析》(李越中，微生物学报，2001，41(6))，文献《粘细菌纤维堆囊菌降解纤维素多酶复合体的确证和性质分析》(侯配斌，博士毕业论文，山东大学)，以及文献《Mutation and ahigh-throughput screening method for improving the production of Epothilonesof Sorangium》(Guo-li Gong，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2007，34：615-623)均报道，使用M26培养基发酵粘细菌纤维堆囊菌，也可获得低产量的埃坡霉素B。
尽管使用M26培养基发酵粘细菌纤维堆囊菌可以生产埃坡霉素B，但产量较低；若采用诱变筛选，又由于粘细菌纤维堆囊菌难以培养，诱变筛选难度又很大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种纤维堆囊菌发酵培养基，其用于发酵培养纤维堆囊菌制备埃坡霉素B时，菌株性能稳定，生长快速，产品埃坡霉素B的产量明显提高。本发明还提供了一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素B的发酵方法。
本发明提供了一种纤维堆囊菌发酵培养基，其包括碳源、氮源、无机盐、大孔吸附树脂和水，还包括氨基酸。
其中，所述的氨基酸较佳的选自赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。
其中，所述的氨基酸的含量较佳的为0.1-500mg/L，更佳的为1-10mg/L。
其中，所述的纤维堆囊菌发酵培养基的pH值较佳的为3-9，更佳的为5-8。
其中，所述的纤维堆囊菌较佳的为Sorangium cellulosum 90。
其中，所述的碳源为本领域常规使用的碳源，较佳的为0.2-2wt％的土豆淀粉或玉米淀粉或麦芽糊精或土豆糊精，以及0.1-1wt％的葡萄糖。
其中，所述的氮源为本领域常规使用的氮源，较佳的为0.05-0.5wt％的大豆蛋白胨或胰胨，以及0.1-1wt％的酵母膏。
其中，所述的无机盐为本领域常规使用的无机盐，较佳的为0.05-0.5wt％的MgSO4·7H2O，0.05-0.5wt％的CaCl2·2H2O，以及0.5-5ml/L的微量元素液。所述的微量元素液为本领域常规使用的微量元素液，较佳的参考Reichenbach H.，Dworkin M.等人的《The Myxobacteria.The Prokaryote》(2nded.1992.3418-3487)中相关内容配制，标准微量元素液(1L体系)：MnCl2·4H2O 100mg，CoCl2 20mg，CuSO4 10mg，Na2MoO4·2H2O 10mg，ZnCl2 20mg，LiCl 5mg，SnCl2·2H2O 5mg，H3BO3 10mg，KBr 20mg，KI 20mg，EDTA Na-Fe3+8g。
其中，所述的大孔吸附树脂较佳的为非极性大孔吸附树脂，鉴于其用于发酵，为使之不易破碎，考虑其机械强度，更佳的选择使用XAD-16大孔吸附树脂。
其中，所述的大孔吸附树脂的用量较佳的为体积百分比2％。
其中，所述的水较佳的为去离子水；所述水的用量较佳的为补足质量百分比100％。
其中，更佳地，碳源、氮源、无机盐和大孔吸附树脂的优选组合为M26培养基，即指0.8wt％土豆淀粉、0.2wt％大豆蛋白胨、0.2wt％葡萄糖、0.2wt％酵母膏、0.1wt％MgSO4·7H2O、0.1wt％CaCl2·2H2O、1ml/L微量元素液和2％(V∶V)的XAD-16大孔吸附树脂。
本发明的纤维堆囊菌发酵培养基由下述方法制得：将上述成分简单均匀混合，用水补足含量至质量百分比100％，按照本领域常规方式杀菌消毒，即可。
本发明的发酵培养基特别适合纤维堆囊菌的发酵培养，本发明还提供了一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素B的发酵方法，其步骤包括：在本发明的纤维堆囊菌发酵培养基中接种纤维堆囊菌，培养，生产埃坡霉素B。
其中，所述的纤维堆囊菌较佳的为Sorangium cellulosum 90。
其中，所述的纤维堆囊菌的接种量为本领域常规使用接种量，较佳的为5％-50％，更佳的为10％-30％，百分比为质量百分比。
其中，所述的培养的温度较佳的为20-40℃，更佳的为25-30℃。
其中，所述的培养的pH值较佳的为3-9，更佳的为5-8。
其中，所述的接种使用的种子为经过二级培养的本领域常规使用的粘细菌纤维堆囊菌种子。其中，所述的二级培养为本领域常规方法培养，包括斜面菌种培养和种子培养。所述的斜面菌种培养为现有技术常规方法培养，即使用VY/2斜面培养基在30℃条件下，培养箱培养3-7天。所述的种子培养为现有技术常规方法培养，即使用M7种子培养基，30℃、200rpm培养2-5天。所述的VY/2培养基含有鲜酵母0.5wt％；CaCl2·2H2O 0.1wt％；VB120.00005wt％；琼脂1.5wt％；用3mol/L的KOH调pH至7.2。所述的M7种子培养基含有蛋白胨0.3wt％；胰胨0.3wt％；淀粉0.5wt％；葡萄糖0.2wt％；酵母膏0.1wt％；MgSO4·7H2O 0.1wt％；CaCl2·2H2O 0.1wt％；VB120.00001wt％；用3mol/L的KOH调pH至7.2。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明中，上述的各技术特征的优选条件可以任意组合，得到较佳的技术方案用于生产高产量的发酵埃坡霉素B。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种纤维堆囊菌发酵培养基及其生产埃坡霉素B的发酵方法。使用本发明纤维堆囊菌发酵培养基培养菌株时，菌株性能稳定，生长快速，制备埃坡霉素B相较于使用常规发酵培养基M26，在制备埃坡霉素B时的产量明显提高50-100％，效果显著。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例中的百分比，如无特殊说明，均为质量百分比。
实施例1-4
表1给出了本发明的发酵培养基实施例1～4的配方，按表1中所列组分及其含量(百分比均为质量百分比)简单混合均匀，用去离子水补足含量至质量百分比100％，杀菌消毒，即制得各发酵培养基。
其中，微量元素液配制(1L体系)：MnCl2·4H2O 100mg，CoCl2 20mg，CuSO4 10mg，Na2MoO4·2H2O 10mg，ZnCl2 20mg，LiCl 5mg，SnCl2·2H2O5mg，H3BO3 10mg，KBr 20mg，KI 20mg，EDTA Na-Fe3+8g。
实施例5
粘细菌纤维堆囊菌种子：美国菌种保藏中心ATCC购买，保存号为ATCC15384，种子的保存状态为甘油管保存或冻干管保存均可。
微量元素液配制(1L体系)：MnCl2·4H2O 100mg，CoCl2 20mg，CuSO410mg，Na2MoO4·2H2O 10mg，ZnCl2 20mg，LiCl 5mg，SnCl2·2H2O 5mg，H3BO3 10mg，KBr 20mg，KI 20mg，EDTA Na-Fe3+8g。
1、孢子培养：将粘细菌纤维堆囊菌接到VY/2固体斜面培养基培养上培养5-7天，待形成成片扩散状菌落，作为种子使用。VY/2培养基组成成分为：0.5wt％鲜酵母、0.1wt％CaCl2·2H2O、0.5mg/L VB12、1.5wt％琼脂，用KOH调pH至7.2，121℃灭菌20min。
2、种子培养：
i、用接种针在长好的粘细菌纤维堆囊菌VY/2斜面上刮取少许菌落接到M7液体种子培养基中，装瓶量为20ml/250ml，30℃、200rpm摇床培养5-7天。M7培养基组成成分为：0.3wt％蛋白胨、0.3wt％胰胨、0.5wt％淀粉、0.2wt％葡萄糖、0.1wt％酵母膏、0.1wt％MgSO4·7H2O、0.1wt％CaCl2·H2O、0.00001wt％VB12，用KOH调pH至7.2，121℃灭菌20min。
ii、按20wt％的接种量取培养好的M7种子重新接到新的M7种子培养基中，装瓶量为80ml/500ml，30℃、200rpm摇床培养2-4天。M7培养基组成成分为：0.3wt％蛋白胨、0.3wt％胰胨、0.5wt％淀粉、0.2wt％葡萄糖、0.1wt％酵母膏、0.1wt％MgSO4·7H2O、0.1wt％CaC12·2H2O、0.00001wt％VB12，用KOH调pH至7.2，加入10-15颗玻璃珠，121℃灭菌20min。
3、发酵培养：按20wt％的接种量取培养好的M7种子接到本发明的发酵培养基中，装瓶量为20ml/250ml，30℃、200rpm摇床培养7天。发酵培养基的组成成分为：0.8wt％土豆淀粉、0.2wt％大豆蛋白胨、0.2wt％葡萄糖、0.2wt％酵母膏、0.1wt％MgSO4·7H2O、0.1wt％CaCl2·2H2O、1ml/L微量元素液、2％(V∶V)的XAD-16树脂、2-10mg/L赖氨酸；pH值为7.0。
结果分析：培养7天后，收集发酵液中的树脂，用甲醇浸泡2小时，取浸泡液进行HPLC分析埃坡霉素B的产量，如下表所示。其中HPLC条件为：柱型Hypersil BDS C18 5μm 4.6mm×150mm、流动相为乙腈∶水＝50∶50、流速为1ml/min、检测波长250nm、柱温30℃。
| 赖氨酸(mg/L) | 0 | 0.5 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 500 |
| 菌体量(g) | 0.20 | 0.21 | 0.23 | 0.27 | 0.25 | 0.31 | 0.28 | 0.20 |
| 埃坡霉素B(mg/L) | 0.80 | 0.85 | 0.96 | 1.21 | 1.46 | 1.91 | 1.25 | 0.81 |
实施例6
除使用的发酵培养基以外，孢子培养、种子培养、以及结果分析的操作步骤和条件同实施例5。
其中，发酵培养基的组成成分为：0.8wt％土豆淀粉、0.2wt％大豆蛋白胨、0.2wt％葡萄糖、0.2wt％酵母膏、0.1wt％MgSO4·7H2O、0.1wt％CaCl2·2H2O、1ml/L微量元素液、2％(V∶V)的XAD-16树脂和2-10mg/L苏氨酸；pH值为7.0。
结果分析埃坡霉素B的产量如下表所示：
| 苏氨酸(mg/L) | 0 | 0.5 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 500 |
| 菌体量(g) | 0.20 | 0.21 | 0.25 | 0.31 | 0.30 | 0.25 | 0.23 | 0.20 |
| 埃坡霉素B(mg/L) | 0.80 | 0.90 | 1.18 | 1.63 | 1.31 | 1.29 | 1.21 | 0.82 |
实施例7
除使用的发酵培养基以外，孢子培养、种子培养、以及结果分析的操作步骤和条件同实施例5。
其中，发酵培养基的组成成分为：0.8wt％土豆淀粉、0.2wt％大豆蛋白胨、0.2wt％葡萄糖、0.2wt％酵母膏、0.1wt％MgSO4·7H2O、0.1wt％CaCl2·2H2O、1ml/L微量元素液、2％(V∶V)的XAD-16树脂、2-10mg/L甲硫氨酸；pH值为7.0。
结果分析埃坡霉素B的产量如下表所示：
| 甲硫氨酸(mg/L) | 0 | 0.5 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 500 |
| 菌体量(g) | 0.20 | 0.21 | 0.23 | 0.29 | 0.35 | 0.26 | 0.21 | 0.21 |
| 埃坡霉素B(mg/L) | 0.80 | 0.82 | 0.98 | 1.20 | 1.74 | 1.57 | 1.20 | 0.81 |
实施例8
除使用的埃坡霉素B发酵培养的温度条件为25-30℃以外，孢子培养、种子培养、以及结果分析的操作步骤和条件同实施例5，其中发酵培养基中的氨基酸含量为赖氨酸8mg/L。
结果分析埃坡霉素B的产量如下表所示：
| 温度(℃) | 20 | 25 | 28 | 30 | 32 | 40 |
| 菌体量(g) | 0.15 | 0.23 | 0.29 | 0.31 | 0.26 | 0.16 |
| 埃坡霉素B(mg/L) | 0.76 | 0.95 | 1.63 | 1.90 | 1.57 | 0.61 |
实施例9
除使用的埃坡霉素B发酵培养的pH条件为3-9以外，孢子培养、种子培养、以及结果分析的操作步骤和条件同实施例5，其中发酵培养基中的氨基酸含量为赖氨酸8mg/L。
结果分析埃坡霉素B的产量如下表所示：
| pH值 | 3 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 6.8 | 7.2 | 7.5 | 9 |
| 菌体量(g) | 0.12 | 0.17 | 0.19 | 0.19 | 0.21 | 0.28 | 0.20 | 0.18 |
| 埃坡霉素B(mg/L) | 0.62 | 0.75 | 0.83 | 0.89 | 1.32 | 1.65 | 1.21 | 0.79 |
实施例10
孢子培养和种子培养的操作步骤和条件同实施例1。按20％的接种量取培养好的M7种子接到本发明的发酵培养基中，装瓶量为20ml/250ml，30℃、200rpm摇床培养7天。发酵培养基的组成成分为：0.2wt％玉米淀粉、0.05wt％胰胨、1wt％葡萄糖、1wt％酵母膏、0.05wt％MgSO4·7H2O、0.05wt％CaCl2·2H2O、5ml/L微量元素液、2％(V∶V)的XAD-16树脂、10mg/L赖氨酸。培养7天后，收集发酵液中的树脂，用甲醇浸泡2小时，提取埃坡霉素B，即可。
实施例11
孢子培养和种子培养的操作步骤和条件同实施例1。按20％的接种量取培养好的M7种子接到本发明的发酵培养基中，装瓶量为20ml/250ml，30℃、200rpm摇床培养7天。发酵培养基的组成成分为：2wt％麦芽糊精、0.5wt％大豆蛋白胨、0.1wt％葡萄糖、0.1wt％酵母膏、0.5wt％MgSO4·7H2O、0.5wt％CaCl2·2H2O、0.5ml/L微量元素液、2％(V∶V)的XAD-16树脂、10mg/L赖氨酸。培养7天后，收集发酵液中的树脂，用甲醇浸泡2小时，提取埃坡霉素B，即可。
由上述实施例的分析结果表明：当发酵培养基中含有氨基酸时，发酵所得的菌体量和埃坡霉素B显著增多，其产量至少比不含有氨基酸时提高50％，效果显著。
Claims (7)
1.一种纤维堆囊菌发酵培养基，其包括碳源、氮源、无机盐、大孔吸附树脂和水，其特征在于：其还包括氨基酸，所述的氨基酸选自赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸，所述的氨基酸的含量为0.1-500mg/L，所述的碳源为0.2-2wt％的选自土豆淀粉、玉米淀粉、麦芽糊精和土豆糊精中的一种或多种，以及0.1-1wt％的葡萄糖；所述的氮源为0.05-0.5wt％的大豆蛋白胨或胰胨，以及0.1-1wt％的酵母膏；所述的无机盐为0.05-0.5wt％的MgSO4·7H2O，0.05-0.5wt％的CaCl2·2H2O，以及0.5-5ml/L的微量元素液；所述的大孔吸附树脂为体积百分比为2％的XAD-16大孔吸附树脂；所述的水的含量为补足质量百分比100％。
2.如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于：所述的氨基酸的含量1-10mg/L。
3.如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于：所述的纤维堆囊菌为Sorangium cellulosum 90。
4.如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于：所述的纤维堆囊菌发酵培养基的pH值为3-9。
5.如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于：所述的标准微量元素液，其1L体系含有：MnCl2·4H2O 100mg，CoCl220mg，CuSO410mg，Na2MoO4·2H2O 10mg，ZnCl220mg，LiCl 5mg，SnCl2·2H2O 5mg，H3BO310mg，KBr 20mg，KI 20mg，以及EDTA Na-Fe3+8g。
6.一种纤维堆囊菌发酵生产埃坡霉素B的发酵方法，其步骤包括：在如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基中接种纤维堆囊菌，培养，生产埃坡霉素B。
7.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：所述的纤维堆囊菌的接种量为5-50％，百分比为质量百分比；所述的培养的温度为20-40℃；所述的培养的pH值为3-9。
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Granted publication date: 20111221 Termination date: 20180403 |
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