CN105695351B - 活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法 - Google Patents

活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105695351B
CN105695351B CN201511017403.8A CN201511017403A CN105695351B CN 105695351 B CN105695351 B CN 105695351B CN 201511017403 A CN201511017403 A CN 201511017403A CN 105695351 B CN105695351 B CN 105695351B
Authority
CN
China
Prior art keywords
actuosus
nosiheptide
seed
temperature
obtains
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201511017403.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105695351A (zh
Inventor
张春颖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tibet Tianhong Technology Co ltd
Original Assignee
Tibet Tianhong Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tibet Tianhong Technology Co ltd filed Critical Tibet Tianhong Technology Co ltd
Priority to CN201511017403.8A priority Critical patent/CN105695351B/zh
Publication of CN105695351A publication Critical patent/CN105695351A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105695351B publication Critical patent/CN105695351B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB‑16。本发明还涉及一种产生活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB‑16的方法，采用紫外和亚硝基胍对活跃链霉菌CN10联合诱变，筛选得到活跃链霉菌LB‑16。本发明还涉及一种利用活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB‑16制备那西肽的方法，采取变温培养，通气流量采取分阶段控制，采用有机溶剂法、树脂分离、乙醇和水混合沉淀提取分离得到那西肽粗品，并采用离子交换层析法分离纯化得到那西肽精品。本发明具有生产成本低、产品提取率高和产品生物价效高的特点。

Description

活跃链霉菌LB-16及利用其制备那西肽的方法
技术领域
本发明涉及一种活跃链霉菌。更具体地说，本发明涉及一种活跃链霉菌LB-16及利用其制备那西肽的方法。
背景技术
那西肽(Nosiheptide)又称诺西肽，是一种含有多个噻唑环并富含硫多肽类抗生素，与硫链丝菌肽(Thiostreton)、盐屋霉素(siomyein)、微球菌素(Mierococcins)、硫肽霉素(Tiopeptin)属于同一类化合物。那西肽作为一种新型的饲料添加剂，在国内外已得到了广泛的认可，它不但能促进动物生长，提高饲料效率，而且具有不易产生耐药性，无残留，安全性高，对环境友好等特点，该产品在日本、东南亚和中国台湾等地也在广泛使用。但目前国内企业所需的那西肽主要依赖进口。
生产那西肽的方法主要为发酵法，申请号为201310027757.5的专利中给出了一种利用半光胺酸来提高那西肽产量的方法，但是该方法比较简单，也没有给出提取方法，作为工业化大生产有一定的难度。申请号为201210469137.2的专利公布一种利用活跃链酶菌接到斜面培养基中得到种子液，然后发酵培养得到那西肽的方法，该方法虽然操作简单，但是生产得到那西肽的收率低，同样也不适合工业化。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种生产力强、菌丝产量高的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16；
本发明又一目的是提供一种产生活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16的方法，产品生成率和分离纯化效率均较高；
本发明再一目的是提供一种利用活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法，提取率和生物效价均较高。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种活跃链霉菌Streptomycesactuosus LB-16：
其分类命名为活跃链霉菌Streptomyces actuosus，所述活跃链霉菌LB-16被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11732，保藏时间为：2015年11月25日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，本发明中称为活跃链霉菌LB-16。
一种产生所述的活跃链霉菌LB-16的方法，包括如下步骤：
步骤一、将活跃链霉菌单孢子液用紫外灯于距离所述单孢子液35cm处照射20～30s，稀释培养的温度为28℃，相对湿度为40～50％，24h后平皿倒置培养，然后培养6～7天后，选取长势较好的单个菌落，接种于斜面培养基，获得突变的活跃链霉菌CN10；
步骤二、将步骤一得到的突变的活跃链霉菌CN10用pH6.0的Tris-Hcl溶液处理，得到第二孢子悬浮液，将亚硝基胍溶于pH6.0的Tris-Hcl溶液，得到亚硝基胍的原液，然后将第二孢子悬浮液和亚硝基胍的原液以体积比为1:1混合，使亚硝基胍的浓度为300～500μg/mL，以控制化学制剂的诱变强度，然后在26～30℃下诱变120～130min，筛选得到活跃链霉菌LB-16。
采用了紫外和亚硝基胍联合诱变的方法，获得了生长力强、菌丝产量高的高产菌株，可有效满足生产需要，同时高产菌株的获得从根本上提高了产品的生成率，有利于分离纯化效率的提高。
优选的是，所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中，所述步骤一中，将活跃链霉菌单孢子液用紫外灯照射后，稀释培养的温度为28℃，相对湿度为40～50％，24h后平皿倒置培养，然后继续培养6～7天。
优选的是，所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中，所述步骤二中，诱变反应终止后，立即用冷的生理盐水稀释混合液100倍，然后再稀释相应梯度涂平板，培养6～7天后，筛选得到活跃链霉菌LB-16。
优选的是，所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中，所述斜面培养基包括以重量百分比计的下述成分：可溶性淀粉1.0～2.0％、豆饼粉0.5～1.0％、KNO3 0.1～0.2％、NaCl0.05～0.01％、MgSO4·7H2O 0.05～0.01％和琼脂2.0％-3.0％。
一种利用所述的活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法，包括如下步骤：
A、在种子培养基上接入所述活跃链霉菌LB-16，于温度为22～28℃，转速为120～150rpm下，振荡培养72～90h，作为一级种子；
B、在种子培养基上接入上述一级种子，于温度为22～28℃，转速为120～150rpm下，振荡培养60～80h后，作为二级种子；
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中，于温度为22～28℃，转速为150rpm，通气量以体积比为1:0.3～0.6，压力为0.6～1.0KPa下，发酵培养120～150h；
D、将步骤C得到的那西肽发酵液加入发酵液体积6～8倍的有机溶剂中，于温度为60～80℃下提取2～4h，得到那西肽粗提液；
E、将上述那西肽粗提液用质量浓度为10％的氢氧化钠溶液调节pH为6～8，搅拌2h，将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
菌株发酵过程中，考察了菌种的发酵代谢特性和菌种生产能力，通过对种子罐和发酵罐培养工艺的优化，确定了能挖潜菌种生产能力的培养工艺，采取变温培养，通气流量采取分阶段控制，发酵单位不低于21231mg/L。
优选的是，所述的利用活跃链霉菌LB-16生产那西肽的方法中，还包括：
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中，先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱，然后用浓度为0.1～0.2mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱，洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中，加热到80℃完全溶解，然后加入乙醇体积7～10倍的清水，室温下搅拌3h，抽滤出固体，固体用1倍体积的水淋洗，50℃下真空干燥后，得到那西肽精品。
采用有机溶剂法、树脂分离、乙醇和水混合沉淀提取分离得到那西肽粗品，并进一步采用离子交换层析法分离纯化得到那西肽精品，整个提取工艺中那西肽的提取率不低于85.1％，生物效价不低于750U/mg。
优选的是，所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中，所述步骤C中，在发酵培养时用质量浓度为10％的氨水进行补料，控制发酵罐中的pH为6.0，并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60～70％，由于培养过程为耗氧过程，控制发酵罐中的溶氧值有助于菌种的生长。
优选的是，所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中，所述步骤D中的有机溶剂为乙醇、异丙醇、氯仿或二氯甲烷中的任一种。
优选的是，所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中，所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分：豆饼粉2.0～3.0％、葡萄糖3.0～4.0％、玉米浆2.0～3.0％、 MgSO4·7H2O 0.05～0.1％、(NH4)2SO4·7H2O 0.3～0.5％和轻质碳酸钙0.5％，所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分：淀粉6.0～7.0％、蛋白胨0.3～0.5％、黄豆粉7.0～8.0％、NaCl 0.3～0.4％、(NH4)2SO4·7H2O 0.2～0.3％和轻质碳酸钙0.1～0.2％。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)采用了紫外和亚硝基胍联合诱变的方法，获得了生长力强、菌丝产量高的高产菌株，可有效满足生产需要，同时高产菌株的获得从根本上提高了产品的生成率，有利于分离纯化效率的提高。
(2)菌株发酵过程中，考察了菌种的发酵代谢特性和菌种生产能力，通过对种子罐和发酵罐培养工艺的优化，确定了能挖潜菌种生产能力的培养工艺，采取变温培养，通气流量采取分阶段控制，发酵单位不低于21231mg/L。
(3)采用有机溶剂法、树脂分离、乙醇和水混合沉淀提取分离得到那西肽粗品，并进一步采用离子交换层析法分离纯化得到那西肽精品，整个提取工艺中那西肽的提取率不低于85.1％，生物效价不低于750U/mg。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
一种活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16，其分类命名为活跃链霉菌Streptomyces actuosus，所述活跃链霉菌LB-16被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11732，保藏时间为：2015年11月25日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2
一种产生所述的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16的方法，包括如下步骤：
步骤一、将活跃链霉菌单孢子液用紫外灯于距离所述单孢子液35cm处照射20～30s，并稀释培养6～7天后，选取长势较好的单个菌落，接种于斜面培养基，获得突变的活跃链霉菌CN10。
步骤二、将步骤一得到的突变的活跃链霉菌CN10用pH6.0的Tris-Hcl溶液处理，得到第二孢子悬浮液，将亚硝基胍溶于pH6.0的Tris-Hcl溶液，得到亚硝基胍的原液，然后将第二孢子悬浮液和亚硝基胍的原液以体积比为1:1混合，使亚硝基胍的浓度为300～500μg/mL，然后在26～30℃下诱变120～130min，诱变反应终止后，立即用冷的生理盐水稀释混合液100倍，然后再稀释相应梯度涂平板，培养6～7天后，筛选得到活跃链霉菌LB-16。
所述斜面培养基包括以重量百分比计的下述成分：可溶性淀粉1.0～2.0％、豆饼粉0.5～1.0％、KNO3 0.1～0.2％、NaCl 0.05～0.01％、MgSO4·7H2O 0.05～0.01％和琼脂2.0％-3.0％。
实施例3
如图1所示，一种利用所述的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法，包括如下步骤：
A、从母种试管中挑取新鲜的高产活跃链霉菌LB-16，接入80mL种子培养基中，并将种子培养基装于500mL的三角瓶中，于温度为22℃，转速为120rpm下，振荡培养72h，作为一级种子。
B、在200mL种子培养基上接入上述一级种子50mL，并将种子培养基装于1000mL的三角瓶中，于温度为22℃，转速为120rpm下，振荡培养60h后，作为二级种子。
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的100L全自动发酵罐中，于装液量60L，温度为22℃，转速为150rpm，通气量以体积比为1:0.4，压力为0.6KPa下，发酵培养120h。在发酵培养时用质量浓度为10％的氨水进行补料，控制发酵罐中的pH为6.0，并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60％，在还原糖含量低于1.0％以下放罐。
D、将步骤C得到的那西肽发酵液200mL浓缩至1/3，加入发酵液体积6倍的异丙醇中，于温度为60℃下提取3h，得到那西肽粗提液。
E、将上述那西肽粗提液真空减压浓缩到原来体积的1/5，然后加入5倍体积的水，用质量浓度为10％的氢氧化钠溶液调节pH为6，搅拌2h，期间析出大量固体，将析出的固 体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中，树脂型号为XAD-7，先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱，然后用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱，得到那西肽洗脱液，洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中，加热到80℃完全溶解，然后加入乙醇体积7倍的清水，室温下搅拌3h，抽滤出固体，固体用1倍体积的水淋洗，50℃下真空干燥后，得到那西肽精品，收率为85.62％，平均生物效价为778U/mg。
所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分：豆饼粉2.0％、葡萄糖3.0％、玉米浆2.0％、MgSO4·7H2O 0.05％、(NH4)2SO4·7H2O 0.3％和轻质碳酸钙0.5％，所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分：淀粉6.0％、蛋白胨0.5％、黄豆粉8.0％、NaCl0.3％、(NH4)2SO4·7H2O 0.2％和轻质碳酸钙0.1％。
实施例4
如图1所示，一种利用所述的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法，包括如下步骤：
A、从母种试管中挑取新鲜的高产活跃链霉菌LB-16，接入80mL种子培养基中，并将种子培养基装于500mL的三角瓶中，于温度为26℃，转速为120rpm下，振荡培养80h，作为一级种子。
B、在200mL种子培养基上接入上述一级种子50mL，并将种子培养基装于1000mL的三角瓶中，于温度为26℃，转速为120rpm下，振荡培养60h后，作为二级种子。
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的100L全自动发酵罐中，于装液量60L，温度为26℃，转速为150rpm，通气量以体积比为1:0.6，压力为0.6KPa下，发酵培养150h。在发酵培养时用质量浓度为10％的氨水进行补料，控制发酵罐中的pH为6.0，并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60％，在还原糖含量低于1.0％以下放罐。
D、将步骤C得到的那西肽发酵液200mL浓缩至1/3，加入发酵液体积8倍的二氯甲烷中，于温度为80℃下提取3h，得到那西肽粗提液。
E、将上述那西肽粗提液真空减压浓缩到原来体积的1/5，然后加入5倍体积的水，用质量浓度为10％的氢氧化钠溶液调节pH为8，搅拌2h，期间析出大量固体，将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中，树脂型号为XAD-7，先用浓度为0.2mol/L 的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱，然后用浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱，得到那西肽洗脱液，洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中，加热到80℃完全溶解，然后加入乙醇体积10倍的清水，室温下搅拌3h，抽滤出固体，固体用1倍体积的水淋洗，50℃下真空干燥后，得到那西肽精品，收率为86.21％，平均生物效价为785U/mg。
所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分：豆饼粉3.0％、葡萄糖4.0％、玉米浆3.0％、MgSO4·7H2O 0.1％、(NH4)2SO4·7H2O 0.5％和轻质碳酸钙0.5％，所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分：淀粉7.0％、蛋白胨0.3％、黄豆粉7.0％、NaCl 0.3％、(NH4)2SO4·7H2O 0.2％和轻质碳酸钙0.2％。
实施例5
如图1所示，一种利用所述的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法，包括如下步骤：
A、从母种试管中挑取新鲜的高产活跃链霉菌LB-16，接入80mL种子培养基中，并将种子培养基装于500mL的三角瓶中，于温度为28℃，转速为150rpm下，振荡培养90h，作为一级种子。
B、在200mL种子培养基上接入上述一级种子50mL，并将种子培养基装于1000mL的三角瓶中，于温度为28℃，转速为120rpm下，振荡培养80h后，作为二级种子。
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的100L全自动发酵罐中，于装液量60L，温度为28℃，转速为150rpm，通气量以体积比为1:0.3，压力为1.0KPa下，发酵培养130h。在发酵培养时用质量浓度为10％的氨水进行补料，控制发酵罐中的pH为6.0，并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60％，在还原糖含量低于1.0％以下放罐。
D、将步骤C得到的那西肽发酵液200mL浓缩至1/3，加入发酵液体积7倍的氯仿中，于温度为70℃下提取3h，得到那西肽粗提液。
E、将上述那西肽粗提液真空减压浓缩到原来体积的1/5，然后加入5倍体积的水，用质量浓度为10％的氢氧化钠溶液调节pH为7，搅拌2h，期间析出大量固体，将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中，树脂型号为XAD-7，先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱，然后用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱，得到那西肽洗脱液，洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中，加热到80℃完全溶解， 然后加入乙醇体积9倍的清水，室温下搅拌3h，抽滤出固体，固体用1倍体积的水淋洗，50℃下真空干燥后，得到那西肽精品，收率为87.32％，平均生物效价为765U/mg。
所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分：豆饼粉2.5％、葡萄糖3.5％、玉米浆2.5％、MgSO4·7H2O 0.08％、(NH4)2SO4·7H2O 0.4％和轻质碳酸钙0.5％，所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分：淀粉6.5％、蛋白胨0.4％、黄豆粉7.5％、NaCl0.4％、(NH4)2SO4·7H2O 0.3％和轻质碳酸钙0.1％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (5)

1. 一种活跃链霉菌（Streptomyces actuosus）LB-16，其特征在于，所述活跃链霉菌LB-16被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.11732，保藏时间为：2015年11月25日。
2.一种利用如权利要求1所述的活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、在种子培养基上接入所述活跃链霉菌LB-16，于温度为22~28℃，转速为120~150rpm下，振荡培养72~90h，作为一级种子；
B、在种子培养基上接入上述一级种子，于温度为22~28℃，转速为120~150rpm下，振荡培养60~80h后，作为二级种子；
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中，于温度为22~28℃，转速为150rpm，通气量以体积比为1:0.3~0.6，压力为0.6~1.0KPa下，发酵培养120~150h；
D、将步骤C得到的那西肽发酵液加入发酵液体积6~8倍的有机溶剂中，于温度为60~80℃下提取2~4h，得到那西肽粗提液；
E、将上述那西肽粗提液用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为6~8，搅拌2h，将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
3.如权利要求2所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法，其特征在于，还包括：
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中，先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱，然后用浓度为0.1~0.2mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱，洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中，加热到80℃完全溶解，然后加入乙醇体积7~10倍的清水，室温下搅拌3h，抽滤出固体，固体用1倍体积的水淋洗，50℃下真空干燥后，得到那西肽精品。
4.如权利要求2所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法，其特征在于，所述步骤D中的有机溶剂为乙醇、异丙醇、氯仿或二氯甲烷中的任一种。
5.如权利要求2所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法，其特征在于，所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分：豆饼粉2.0~3.0%、葡萄糖3.0~4.0%、玉米浆2.0~3.0%、MgSO4·7H2O 0.05~0.1%、（NH4)2SO4·7H2O 0.3~0.5%和轻质碳酸钙0.5%，所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分：淀粉6.0~7.0%、蛋白胨0.3~0.5%、黄豆粉7.0~8.0%、NaCl 0.3~0.4%、（NH4)2SO4·7H2O 0.2～0.3%和轻质碳酸钙0.1～0.2%。
CN201511017403.8A 2015-12-29 2015-12-29 活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法 Active CN105695351B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511017403.8A CN105695351B (zh) 2015-12-29 2015-12-29 活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511017403.8A CN105695351B (zh) 2015-12-29 2015-12-29 活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105695351A CN105695351A (zh) 2016-06-22
CN105695351B true CN105695351B (zh) 2019-04-09

Family

ID=56225922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511017403.8A Active CN105695351B (zh) 2015-12-29 2015-12-29 活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105695351B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106047967A (zh) * 2016-08-23 2016-10-26 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种活跃链霉菌发酵生产那西肽的培养基和培养方法
CN106317173A (zh) * 2016-08-23 2017-01-11 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种利用那西肽发酵液制备那西肽粗品的方法
CN106701868A (zh) * 2016-09-29 2017-05-24 宁夏泰益欣生物科技有限公司 一种利用活跃链霉菌发酵生产那西肽的培养基及补料方法
CN109580864B (zh) * 2019-02-18 2019-09-06 华南农业大学 一种动物性食品中那西肽残留的检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1899599A (zh) * 2005-07-19 2007-01-24 复旦大学 一种制备那西肽预混剂的方法
CN102965420A (zh) * 2012-11-20 2013-03-13 江西兴鼎科技有限公司 一种发酵生产多肽类抗生素那西肽的方法
CN104388505A (zh) * 2014-11-24 2015-03-04 苏州嘉禧萝生物科技有限公司 一种利用活跃链霉菌发酵生产那西肽的方法
CN104388506A (zh) * 2014-11-27 2015-03-04 苏州嘉禧萝生物科技有限公司 一种利用活跃链霉菌发酵生产那西肽的方法
WO2015053285A1 (ja) * 2013-10-08 2015-04-16 日本農薬株式会社 微生物を植菌してなる種菌及びそれを使用する抗生物質の生産方法
CN105063011A (zh) * 2015-08-24 2015-11-18 山东齐发药业有限公司 一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1899599A (zh) * 2005-07-19 2007-01-24 复旦大学 一种制备那西肽预混剂的方法
CN102965420A (zh) * 2012-11-20 2013-03-13 江西兴鼎科技有限公司 一种发酵生产多肽类抗生素那西肽的方法
WO2015053285A1 (ja) * 2013-10-08 2015-04-16 日本農薬株式会社 微生物を植菌してなる種菌及びそれを使用する抗生物質の生産方法
CN104388505A (zh) * 2014-11-24 2015-03-04 苏州嘉禧萝生物科技有限公司 一种利用活跃链霉菌发酵生产那西肽的方法
CN104388506A (zh) * 2014-11-27 2015-03-04 苏州嘉禧萝生物科技有限公司 一种利用活跃链霉菌发酵生产那西肽的方法
CN105063011A (zh) * 2015-08-24 2015-11-18 山东齐发药业有限公司 一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105695351A (zh) 2016-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106190921B (zh) 一种谷氨酸棒状杆菌与应用
CN101611767B (zh) 一种海参用微生物发酵饵料的生产方法
CN105524840B (zh) 一株新的藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素a4的方法
CN104342390B (zh) 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用
CN105695351B (zh) 活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法
CN103614323B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌的培养基及应用
CN101245362B (zh) 发酵法生产多肽类抗生素安来霉素的方法
CN102010847B (zh) 一种抗噬菌体l-苯丙氨酸生产菌及选育方法和其应用
CN101402929B (zh) 一株耐碱纤维堆囊菌及其在制备埃博霉素中的应用
CN103451133A (zh) 一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用
CN102268385A (zh) 一种用于发酵生产环磷酸腺苷的节杆菌及其应用
CN109182147A (zh) 一种青霉及其生产烟曲霉素的方法
CN102174448B (zh) 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用
CN101748093B (zh) 壮观链霉菌SpLE-16及其在生产大观霉素中的应用
CN101338291B (zh) 一种制备冠菌素的方法及其专用菌株
CN108841889B (zh) 利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法
CN108823110B (zh) 一株产灰黄霉素的菌株及其应用
CN103088089A (zh) 一种阿卡波糖的发酵方法
CN102839130B (zh) 一株胶霉菌素生产菌株及应用该菌株生产胶霉菌素的方法
CN107058119A (zh) 一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的方法
CN107446868B (zh) 一株甲基营养型芽孢杆菌及其降解羽毛产寡肽的应用
CN105441334B (zh) 产灰树花多糖的菌株及其应用
CN101974452B (zh) 一种粘杆菌素高产菌株及其筛选方法
CN109161507A (zh) 一种高产l-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用
CN106148214B (zh) 一种圈卷产色链霉菌及制备尼可霉素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant