CN105695351B - 活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB‑16。本发明还涉及一种产生活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB‑16的方法,采用紫外和亚硝基胍对活跃链霉菌CN10联合诱变,筛选得到活跃链霉菌LB‑16。本发明还涉及一种利用活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB‑16制备那西肽的方法,采取变温培养,通气流量采取分阶段控制,采用有机溶剂法、树脂分离、乙醇和水混合沉淀提取分离得到那西肽粗品,并采用离子交换层析法分离纯化得到那西肽精品。本发明具有生产成本低、产品提取率高和产品生物价效高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种活跃链霉菌。更具体地说,本发明涉及一种活跃链霉菌LB-16及利用其制备那西肽的方法。
背景技术
那西肽(Nosiheptide)又称诺西肽,是一种含有多个噻唑环并富含硫多肽类抗生素,与硫链丝菌肽(Thiostreton)、盐屋霉素(siomyein)、微球菌素(Mierococcins)、硫肽霉素(Tiopeptin)属于同一类化合物。那西肽作为一种新型的饲料添加剂,在国内外已得到了广泛的认可,它不但能促进动物生长,提高饲料效率,而且具有不易产生耐药性,无残留,安全性高,对环境友好等特点,该产品在日本、东南亚和中国台湾等地也在广泛使用。但目前国内企业所需的那西肽主要依赖进口。
生产那西肽的方法主要为发酵法,申请号为201310027757.5的专利中给出了一种利用半光胺酸来提高那西肽产量的方法,但是该方法比较简单,也没有给出提取方法,作为工业化大生产有一定的难度。申请号为201210469137.2的专利公布一种利用活跃链酶菌接到斜面培养基中得到种子液,然后发酵培养得到那西肽的方法,该方法虽然操作简单,但是生产得到那西肽的收率低,同样也不适合工业化。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种生产力强、菌丝产量高的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16;
本发明又一目的是提供一种产生活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16的方法,产品生成率和分离纯化效率均较高;
本发明再一目的是提供一种利用活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法,提取率和生物效价均较高。
为了实现本发明的这些目的和其它优点,提供了一种活跃链霉菌Streptomycesactuosus LB-16:
其分类命名为活跃链霉菌Streptomyces actuosus,所述活跃链霉菌LB-16被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC No.11732,保藏时间为:2015年11月25日,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,本发明中称为活跃链霉菌LB-16。
一种产生所述的活跃链霉菌LB-16的方法,包括如下步骤:
步骤一、将活跃链霉菌单孢子液用紫外灯于距离所述单孢子液35cm处照射20~30s,稀释培养的温度为28℃,相对湿度为40~50%,24h后平皿倒置培养,然后培养6~7天后,选取长势较好的单个菌落,接种于斜面培养基,获得突变的活跃链霉菌CN10;
步骤二、将步骤一得到的突变的活跃链霉菌CN10用pH6.0的Tris-Hcl溶液处理,得到第二孢子悬浮液,将亚硝基胍溶于pH6.0的Tris-Hcl溶液,得到亚硝基胍的原液,然后将第二孢子悬浮液和亚硝基胍的原液以体积比为1:1混合,使亚硝基胍的浓度为300~500μg/mL,以控制化学制剂的诱变强度,然后在26~30℃下诱变120~130min,筛选得到活跃链霉菌LB-16。
采用了紫外和亚硝基胍联合诱变的方法,获得了生长力强、菌丝产量高的高产菌株,可有效满足生产需要,同时高产菌株的获得从根本上提高了产品的生成率,有利于分离纯化效率的提高。
优选的是,所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中,所述步骤一中,将活跃链霉菌单孢子液用紫外灯照射后,稀释培养的温度为28℃,相对湿度为40~50%,24h后平皿倒置培养,然后继续培养6~7天。
优选的是,所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中,所述步骤二中,诱变反应终止后,立即用冷的生理盐水稀释混合液100倍,然后再稀释相应梯度涂平板,培养6~7天后,筛选得到活跃链霉菌LB-16。
优选的是,所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中,所述斜面培养基包括以重量百分比计的下述成分:可溶性淀粉1.0~2.0%、豆饼粉0.5~1.0%、KNO3 0.1~0.2%、NaCl0.05~0.01%、MgSO4·7H2O 0.05~0.01%和琼脂2.0%-3.0%。
一种利用所述的活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法,包括如下步骤:
A、在种子培养基上接入所述活跃链霉菌LB-16,于温度为22~28℃,转速为120~150rpm下,振荡培养72~90h,作为一级种子;
B、在种子培养基上接入上述一级种子,于温度为22~28℃,转速为120~150rpm下,振荡培养60~80h后,作为二级种子;
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中,于温度为22~28℃,转速为150rpm,通气量以体积比为1:0.3~0.6,压力为0.6~1.0KPa下,发酵培养120~150h;
D、将步骤C得到的那西肽发酵液加入发酵液体积6~8倍的有机溶剂中,于温度为60~80℃下提取2~4h,得到那西肽粗提液;
E、将上述那西肽粗提液用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为6~8,搅拌2h,将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
菌株发酵过程中,考察了菌种的发酵代谢特性和菌种生产能力,通过对种子罐和发酵罐培养工艺的优化,确定了能挖潜菌种生产能力的培养工艺,采取变温培养,通气流量采取分阶段控制,发酵单位不低于21231mg/L。
优选的是,所述的利用活跃链霉菌LB-16生产那西肽的方法中,还包括:
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中,先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱,然后用浓度为0.1~0.2mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱,洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中,加热到80℃完全溶解,然后加入乙醇体积7~10倍的清水,室温下搅拌3h,抽滤出固体,固体用1倍体积的水淋洗,50℃下真空干燥后,得到那西肽精品。
采用有机溶剂法、树脂分离、乙醇和水混合沉淀提取分离得到那西肽粗品,并进一步采用离子交换层析法分离纯化得到那西肽精品,整个提取工艺中那西肽的提取率不低于85.1%,生物效价不低于750U/mg。
优选的是,所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中,所述步骤C中,在发酵培养时用质量浓度为10%的氨水进行补料,控制发酵罐中的pH为6.0,并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60~70%,由于培养过程为耗氧过程,控制发酵罐中的溶氧值有助于菌种的生长。
优选的是,所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中,所述步骤D中的有机溶剂为乙醇、异丙醇、氯仿或二氯甲烷中的任一种。
优选的是,所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中,所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分:豆饼粉2.0~3.0%、葡萄糖3.0~4.0%、玉米浆2.0~3.0%、 MgSO4·7H2O 0.05~0.1%、(NH4)2SO4·7H2O 0.3~0.5%和轻质碳酸钙0.5%,所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分:淀粉6.0~7.0%、蛋白胨0.3~0.5%、黄豆粉7.0~8.0%、NaCl 0.3~0.4%、(NH4)2SO4·7H2O 0.2~0.3%和轻质碳酸钙0.1~0.2%。
本发明至少包括以下有益效果:
(1)采用了紫外和亚硝基胍联合诱变的方法,获得了生长力强、菌丝产量高的高产菌株,可有效满足生产需要,同时高产菌株的获得从根本上提高了产品的生成率,有利于分离纯化效率的提高。
(2)菌株发酵过程中,考察了菌种的发酵代谢特性和菌种生产能力,通过对种子罐和发酵罐培养工艺的优化,确定了能挖潜菌种生产能力的培养工艺,采取变温培养,通气流量采取分阶段控制,发酵单位不低于21231mg/L。
(3)采用有机溶剂法、树脂分离、乙醇和水混合沉淀提取分离得到那西肽粗品,并进一步采用离子交换层析法分离纯化得到那西肽精品,整个提取工艺中那西肽的提取率不低于85.1%,生物效价不低于750U/mg。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
一种活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16,其分类命名为活跃链霉菌Streptomyces actuosus,所述活跃链霉菌LB-16被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC No.11732,保藏时间为:2015年11月25日,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
实施例2
一种产生所述的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16的方法,包括如下步骤:
步骤一、将活跃链霉菌单孢子液用紫外灯于距离所述单孢子液35cm处照射20~30s,并稀释培养6~7天后,选取长势较好的单个菌落,接种于斜面培养基,获得突变的活跃链霉菌CN10。
步骤二、将步骤一得到的突变的活跃链霉菌CN10用pH6.0的Tris-Hcl溶液处理,得到第二孢子悬浮液,将亚硝基胍溶于pH6.0的Tris-Hcl溶液,得到亚硝基胍的原液,然后将第二孢子悬浮液和亚硝基胍的原液以体积比为1:1混合,使亚硝基胍的浓度为300~500μg/mL,然后在26~30℃下诱变120~130min,诱变反应终止后,立即用冷的生理盐水稀释混合液100倍,然后再稀释相应梯度涂平板,培养6~7天后,筛选得到活跃链霉菌LB-16。
所述斜面培养基包括以重量百分比计的下述成分:可溶性淀粉1.0~2.0%、豆饼粉0.5~1.0%、KNO3 0.1~0.2%、NaCl 0.05~0.01%、MgSO4·7H2O 0.05~0.01%和琼脂2.0%-3.0%。
实施例3
如图1所示,一种利用所述的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法,包括如下步骤:
A、从母种试管中挑取新鲜的高产活跃链霉菌LB-16,接入80mL种子培养基中,并将种子培养基装于500mL的三角瓶中,于温度为22℃,转速为120rpm下,振荡培养72h,作为一级种子。
B、在200mL种子培养基上接入上述一级种子50mL,并将种子培养基装于1000mL的三角瓶中,于温度为22℃,转速为120rpm下,振荡培养60h后,作为二级种子。
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的100L全自动发酵罐中,于装液量60L,温度为22℃,转速为150rpm,通气量以体积比为1:0.4,压力为0.6KPa下,发酵培养120h。在发酵培养时用质量浓度为10%的氨水进行补料,控制发酵罐中的pH为6.0,并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60%,在还原糖含量低于1.0%以下放罐。
D、将步骤C得到的那西肽发酵液200mL浓缩至1/3,加入发酵液体积6倍的异丙醇中,于温度为60℃下提取3h,得到那西肽粗提液。
E、将上述那西肽粗提液真空减压浓缩到原来体积的1/5,然后加入5倍体积的水,用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为6,搅拌2h,期间析出大量固体,将析出的固 体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中,树脂型号为XAD-7,先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱,然后用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱,得到那西肽洗脱液,洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中,加热到80℃完全溶解,然后加入乙醇体积7倍的清水,室温下搅拌3h,抽滤出固体,固体用1倍体积的水淋洗,50℃下真空干燥后,得到那西肽精品,收率为85.62%,平均生物效价为778U/mg。
所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分:豆饼粉2.0%、葡萄糖3.0%、玉米浆2.0%、MgSO4·7H2O 0.05%、(NH4)2SO4·7H2O 0.3%和轻质碳酸钙0.5%,所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分:淀粉6.0%、蛋白胨0.5%、黄豆粉8.0%、NaCl0.3%、(NH4)2SO4·7H2O 0.2%和轻质碳酸钙0.1%。
实施例4
如图1所示,一种利用所述的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法,包括如下步骤:
A、从母种试管中挑取新鲜的高产活跃链霉菌LB-16,接入80mL种子培养基中,并将种子培养基装于500mL的三角瓶中,于温度为26℃,转速为120rpm下,振荡培养80h,作为一级种子。
B、在200mL种子培养基上接入上述一级种子50mL,并将种子培养基装于1000mL的三角瓶中,于温度为26℃,转速为120rpm下,振荡培养60h后,作为二级种子。
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的100L全自动发酵罐中,于装液量60L,温度为26℃,转速为150rpm,通气量以体积比为1:0.6,压力为0.6KPa下,发酵培养150h。在发酵培养时用质量浓度为10%的氨水进行补料,控制发酵罐中的pH为6.0,并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60%,在还原糖含量低于1.0%以下放罐。
D、将步骤C得到的那西肽发酵液200mL浓缩至1/3,加入发酵液体积8倍的二氯甲烷中,于温度为80℃下提取3h,得到那西肽粗提液。
E、将上述那西肽粗提液真空减压浓缩到原来体积的1/5,然后加入5倍体积的水,用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为8,搅拌2h,期间析出大量固体,将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中,树脂型号为XAD-7,先用浓度为0.2mol/L 的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱,然后用浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱,得到那西肽洗脱液,洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中,加热到80℃完全溶解,然后加入乙醇体积10倍的清水,室温下搅拌3h,抽滤出固体,固体用1倍体积的水淋洗,50℃下真空干燥后,得到那西肽精品,收率为86.21%,平均生物效价为785U/mg。
所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分:豆饼粉3.0%、葡萄糖4.0%、玉米浆3.0%、MgSO4·7H2O 0.1%、(NH4)2SO4·7H2O 0.5%和轻质碳酸钙0.5%,所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分:淀粉7.0%、蛋白胨0.3%、黄豆粉7.0%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO4·7H2O 0.2%和轻质碳酸钙0.2%。
实施例5
如图1所示,一种利用所述的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法,包括如下步骤:
A、从母种试管中挑取新鲜的高产活跃链霉菌LB-16,接入80mL种子培养基中,并将种子培养基装于500mL的三角瓶中,于温度为28℃,转速为150rpm下,振荡培养90h,作为一级种子。
B、在200mL种子培养基上接入上述一级种子50mL,并将种子培养基装于1000mL的三角瓶中,于温度为28℃,转速为120rpm下,振荡培养80h后,作为二级种子。
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的100L全自动发酵罐中,于装液量60L,温度为28℃,转速为150rpm,通气量以体积比为1:0.3,压力为1.0KPa下,发酵培养130h。在发酵培养时用质量浓度为10%的氨水进行补料,控制发酵罐中的pH为6.0,并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60%,在还原糖含量低于1.0%以下放罐。
D、将步骤C得到的那西肽发酵液200mL浓缩至1/3,加入发酵液体积7倍的氯仿中,于温度为70℃下提取3h,得到那西肽粗提液。
E、将上述那西肽粗提液真空减压浓缩到原来体积的1/5,然后加入5倍体积的水,用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为7,搅拌2h,期间析出大量固体,将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中,树脂型号为XAD-7,先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱,然后用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱,得到那西肽洗脱液,洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中,加热到80℃完全溶解, 然后加入乙醇体积9倍的清水,室温下搅拌3h,抽滤出固体,固体用1倍体积的水淋洗,50℃下真空干燥后,得到那西肽精品,收率为87.32%,平均生物效价为765U/mg。
所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分:豆饼粉2.5%、葡萄糖3.5%、玉米浆2.5%、MgSO4·7H2O 0.08%、(NH4)2SO4·7H2O 0.4%和轻质碳酸钙0.5%,所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分:淀粉6.5%、蛋白胨0.4%、黄豆粉7.5%、NaCl0.4%、(NH4)2SO4·7H2O 0.3%和轻质碳酸钙0.1%。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (5)
1. 一种活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)LB-16,其特征在于,所述活跃链霉菌LB-16被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCCNo.11732,保藏时间为:2015年11月25日。
2.一种利用如权利要求1所述的活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
A、在种子培养基上接入所述活跃链霉菌LB-16,于温度为22~28℃,转速为120~150rpm下,振荡培养72~90h,作为一级种子;
B、在种子培养基上接入上述一级种子,于温度为22~28℃,转速为120~150rpm下,振荡培养60~80h后,作为二级种子;
C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中,于温度为22~28℃,转速为150rpm,通气量以体积比为1:0.3~0.6,压力为0.6~1.0KPa下,发酵培养120~150h;
D、将步骤C得到的那西肽发酵液加入发酵液体积6~8倍的有机溶剂中,于温度为60~80℃下提取2~4h,得到那西肽粗提液;
E、将上述那西肽粗提液用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为6~8,搅拌2h,将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
3.如权利要求2所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法,其特征在于,还包括:
F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中,先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱,然后用浓度为0.1~0.2mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱,洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中,加热到80℃完全溶解,然后加入乙醇体积7~10倍的清水,室温下搅拌3h,抽滤出固体,固体用1倍体积的水淋洗,50℃下真空干燥后,得到那西肽精品。
4.如权利要求2所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法,其特征在于,所述步骤D中的有机溶剂为乙醇、异丙醇、氯仿或二氯甲烷中的任一种。
5.如权利要求2所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法,其特征在于,所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分:豆饼粉2.0~3.0%、葡萄糖3.0~4.0%、玉米浆2.0~3.0%、MgSO4·7H2O 0.05~0.1%、(NH4)2SO4·7H2O 0.3~0.5%和轻质碳酸钙0.5%,所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分:淀粉6.0~7.0%、蛋白胨0.3~0.5%、黄豆粉7.0~8.0%、NaCl 0.3~0.4%、(NH4)2SO4·7H2O 0.2~0.3%和轻质碳酸钙0.1~0.2%。
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