CN102839130B - 一株胶霉菌素生产菌株及应用该菌株生产胶霉菌素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株胶霉菌素（Gliotoxin）高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备胶霉菌素的方法。本发明所涉及的胶霉菌素生产菌株为丝状真菌，经16SrDNA鉴定为一株绿色木霉（Trichodermaviride），菌株代码为JBSH-002，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5611。该菌株可应用于生产胶霉菌素，该方法发酵所得胶霉菌素收率可达500mg/L以上。

Description

一株胶霉菌素生产菌株及应用该菌株生产胶霉菌素的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株高产胶霉菌素的微生物菌株，特别涉及一株绿色木霉及利用该菌株生产胶霉菌素的方法。

背景技术

胶霉菌素是环缩二氨酸（Diketopiperazines）类物质中第一个被鉴定出来的物质。Weidling and Emerson(1936)首次将这种物质从Trichoderma lignorum中分出来，后来Weidling将这种物质定义为胶霉菌素，又称胶霉毒素（gliotoxin）。1958年由Bell等人鉴定出胶霉菌素的结构。

Jacobus D M等在1979年研究了胶霉菌素的代谢途径，且发现先由肽合成酶(gliP)催化丝氨酸与苯丙氨酸生成环状产物，接下来经过硫氧还蛋白还原酶(gliT)的硫化和氧化作用，最终经邻-甲基转移酶(gliM)和甲基转移酶(gliN)的甲基化形成胶霉菌素，但是国内外一直没有找到诱导胶霉菌素高产的方法，严重阻碍了胶霉菌素的研究。

胶霉菌素可以抑制机体的免疫应答，包括巨噬细胞吞噬和杀菌活性，T细胞增殖等，在发现之初，主要用于癌症的治疗。近年来浙江大学发现胶霉菌素对水稻纹枯病具有明显的杀灭作用，经该课题组深入研究，发现胶霉菌素对土传病害具有明显的灭杀、抑制作用，首次将胶霉菌素应用于土传病害的防治。

专利CN97193552.1公开了一株利用Dichotomomyces cejpii FERM BP-5738。菌株生产乙酰胶霉毒素的方法以及乙酰胶霉毒素的取代方法，但报道的乙酰胶霉毒素的收率仅为10ppm。专利CN97193552.1报道的菌株Dichotomomycescejpii FERM BP-5738很具有代表性，一直没有找到胶霉菌素的高产菌株，胶霉菌素培养的诱导方法也很少报道。从文献报道来看，胶霉菌素收率依然较低、生产成本偏高严重限制了其大规模应用。

在对胶霉菌素理化性质研究方面，文献报道胶霉菌素具有热不稳定性，不利于制剂加工。因此，长期以来，对胶霉菌素的开发仅限于实验室中。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一种利用绿色木霉（Trichodermaviride）通过液体发酵生产胶霉菌素的方法，利用该方法生产的胶霉菌素为胞内代谢产物，且收率较现有文献报道提高了数倍，所采用的菌株代码为JBSH-OO2，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.5611；该菌株可应用于生产胶霉菌素，该方法发酵所得胶霉菌素收率可达0.5mg/mL以上。

本发明提供的具体技术方案是：

首先获得了一株新的绿色木霉（Trichoderma viride）菌株，该菌株的保藏号为CGMCC No.5611，其具体获得方法如下：

（1）全国各菌种保藏中心的木霉以及浙江、山东、云南、陕西部分地区采集的天然绿色木霉（Trichoderma viride）菌株作为起始菌种建立菌种库；

（2）以PD培养基为基础培养基，各菌株分别培养10天，检测胶霉菌素含量，根据能否检测到胶霉菌素进行一级筛分，筛选了29个菌株，然后根据胶霉菌素产生量筛选其中的2株产量最高的菌株作为驯化菌株；

（3）对2株待选菌进行比较深入的生理生化特性、遗传稳定性、抑菌性能等研究，最终筛选出一株抑菌能力强、易于培养并具有稳定的传代特性的菌株，将其初步命名为JBSH-02；

（4）以该菌株为出发菌株，采用常规诱变方法，如UV，DMS，MMS，NTG等，结合低能离子注入法，反复多次诱变，复筛，最终获得了高产菌株JBSH-002；

发明人对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC No.5611，经检测其为存活状态。

上述高产胶霉菌素的菌株，其在PDA平板培养基上的形态特征如下：

菌丝纤细无色，具分隔，多分枝。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2-3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形。分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，绿色。在PDA培养基上菌落初为白絮状，后为暗绿色。

发明人同时对其进行了16S rDNA测序，其基因序列如Seq ID No:1所示，该序列为菌株JBSH-OO2的16S rDNA的全序列。

所测得的16S rDNA序列进行BLSTN比对，比对结果显示，菌株JBSH-OO2的16S rDNA的核苷酸序列与木霉属（Trichoderma sp.）不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，与其中明确标记为绿色木霉（Trichoderma viride）的5株菌株有100%的同源性，因而进一步确定本发明所提供的菌株为一株绿色木霉（Trichoderma viride）菌株。

本发明的另一个目的是，提供利用绿色木霉（Trichoderma viride）菌株JBSH-002生产胶霉菌素的方法。

本发明所获得的菌株，可以应用于日常的生产当中，特别是可以应用于胶霉菌素的生产，具体步骤主要包括绿色木霉菌菌丝体的发酵制备以及胶霉菌素的提取分离和纯化步骤，其中在绿色木霉菌菌丝体的发酵制备中应用胶霉菌素产生和积累诱导工序，

所述的胶霉菌素产生和积累诱导工序具体步骤如下：

A.诱导因子筛选：

从胶霉菌素的前体、生长因子、酶系的调控方面筛选诱导因子，诱导因子选自含特定金属离子的盐或绿色木霉生长因子或胶霉菌素前体；

B．诱导因子使用方法：

金属离子和绿色木霉生长因子添加入培养基中用于调控菌丝体细胞内酶系；在培养过程中通过补加、流加的方式补充胶霉菌素的前体；

C．发酵控制：

首先要用普通碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加惰性碳源，通过不断补料把菌体维持在半饥饿状态，从而加速胶霉菌素的合成。

其中所述的特定金属离子选自含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或钼离子中的一种或几种盐的混合物；绿色木霉生长因子选自生物素或叶酸；胶霉菌素前体选自丝氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸或苏氨酸或谷胱甘肽中的一种或几种混合物；所述的惰性碳源，即缓效碳源，选自甘油、乙酸乙酯、豆油、乳糖中的一种或几种的混合物；所述的普通碳源，包括速效碳源，为本领域常用碳源，如葡萄糖、蔗糖、淀粉等。

之所以选择上述的物质作为诱导因子，主要是由于胶霉菌素是一种环缩二氨酸类物质，它的前体物质主要是：丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸以及含二硫键物质，发明人经过研究后发现针对本发明所述的菌株而言，要使其产生胶霉菌素，诱导调控的方法主要通过三种方式：1、补充前体，如丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷胱甘肽等，从而在氨基酸来源上直接给予菌体补充；2、补充生物生长必须的营养因子，如生物素、叶酸等；3、补充菌体中各种酶系的辅酶离子，主要选择自特定金属离子，一般可以采用其可溶性金属盐的形式，发明人发现通过上述三种方式的诱导，结合对于发酵过程的参数条件控制，可以实现胶霉菌素产量的提高。

具体的生产步骤如下：

（1）绿色木霉菌菌丝体的发酵制备：

A.菌种活化；

B.液体种子制备；

C.发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用液体深层发酵方法生产得到绿色木霉菌丝体；

其中发酵过程具体为：将液体种子以2-10v/v%的接种量接到发酵培养基中，26℃培养48-96h，补加0.5-1w/v%的惰性碳源以及0.05-0.2w/v%的前体，然后每隔48h，补充0.5-1w/v%的惰性碳源，总共培养120-240h；

（2）胶霉菌素的提取分离和纯化：

A.干燥粉碎：将上述发酵的菌丝体经固液分离后，菌丝体进行低温干燥、粉碎，得到绿色木霉菌丝粉；

B.有机溶剂提取：

绿色木霉菌丝粉加入5-20（w/w）倍质量的有机溶剂提取，提取温度0-80℃,提取时间0.5-2h，提取次数1-4次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品。

C．胶霉菌素的纯化：

将胶霉菌素粗品用5-20倍的结晶溶剂复溶，冷却到10℃以下结晶，重复2-6次，得到胶霉菌素纯品。

其中所述提取过程所用的有机溶剂为乙酸乙酯、乙醇、丙酮、苯、甲苯中的一种或几种的混合物；所述纯化过程所用的结晶溶剂为甲醇、乙醇、丙酮其中的一种或几种的混合物，结晶过程的温度控制为-50℃-10℃。

更为具体的过程如下：

（1）菌种活化：将4℃条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下（20℃-25℃）活化4h-8h；

（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中，1支试管菌种接种1个三角瓶，振荡培养24-48h制备得到种子液；

（3）发酵、诱导过程：在发酵培养基中添加占培养基总重量0.01-0.05%的含特定金属离子的盐，如钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或钼离子中的一种或几种的混合物，及占培养基总重量0.005-0.02%的生长因子,如生物素或叶酸或其混合物，将液体种子以2-10%（v/v）的接种量在无菌条件下接到已灭菌的发酵培养基中，26℃培养48-96h，补加0.5-1%（w/v）的惰性碳源，如甘油或乙酸乙酯或豆油或乳糖中的一种或几种的混合物，以及0.05-0.2%（w/v）的前体，如丝氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸或苏氨酸或谷胱甘肽中的一种或几种的混合物，然后每隔48h，补充0.5-1%（w/v）的惰性碳源，总共培养120-240h即可获得绿色木霉菌丝。

更具体的，可以取制备好的液体种子以5%-10%（v/v）的接种量接种于灭菌的发酵培养基中，液体发酵制备即可获得绿色木霉菌丝；

（4）干燥粉碎：将发酵完成的菌丝经固液分离后，菌丝体在低于60℃的温度下烘干，粉碎后过80目筛，得到胶霉菌素菌丝粉；

（5）胶霉菌素的提取：绿色木霉菌丝粉加入5-20（w/w）倍质量的有机溶剂提取，提取温度10-80℃,提取时间0.5-2h，提取次数1-3次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品；

（6）胶霉菌素的纯化

将胶霉菌素粗品用5-20倍的结晶溶剂复溶，冷却到-50-10℃结晶，重复2-4次，得到胶霉菌素样品。

其中菌株产胶霉菌素条件的确定，其方法如下：

（1）采用单因子试验和正交试验，通过改变温度、初始pH值、接种量、装料量和培养时间，确定液体种子最佳培养条件和液体发酵最佳培养条件；

（2）采用单因子试验和正交试验，通过改变培养的碳氮源和无机盐组成确定该菌株液体种子最佳培养基组成和液体发酵的最佳培养基组成。

经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株、液体种子培养基组成及发酵条件如下：

液体种子培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖2%～4%，酵母浸粉0.2%～1%，硫酸镁0.02-0.1%，磷酸二氢钾0.01-0.05%,加水至1000mL；

液体种子培养条件：接种量为每个三角瓶接种1只菌株斜面培养物，pH值自然，培养温度24℃～28℃，摇床转速75r/min-200r/min，培养时间为24～48h；

经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株液体发酵培养基组成和发酵条件如下：

液体培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖2%～4%，酵母浸粉0.2%～1%，玉米粉：1-4%；土豆汁1-4%；硫酸镁0.02-0.1%，磷酸二氢钾0.01-0.05%，硫酸锌0.001-0.005%,加水至1000mL；

液体发酵条件：接种量为5%-10%（v/w），pH值自然，培养温度24℃～28℃，摇床转速75r/min-200r/min，培养时间为120～240h；

干燥粉碎：将发酵完成的发酵液经固液分离后，将菌丝体在低于60℃的温度下烘干，粉碎后过80目筛，得到用于胶霉菌素提取的菌丝粉；

胶霉菌素的提取：绿色木霉菌丝粉中加入5-20（w/w）倍质量的有机溶剂提取，提取温度10-80℃,提取时间0.5-2h，提取次数1-4次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品；

胶霉菌素的纯化

将胶霉菌素粗品用5-20倍的结晶溶剂复溶，冷却到-50℃-10℃结晶，重复2-4次，得到胶霉菌素纯品；

经过上述提取和纯化过程所得胶霉菌素产品外观为白色或浅黄色结晶或粉末，可溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二甲亚砜，不溶于水以及石油醚。经硅胶薄层层析，证明为胶霉菌素（如附图1所示），用HPLC方法检测，色谱峰为单一对称峰，含量为91.32%（如附图2和3所示）。经LC-MS液质联用分析（如附图4所示），分子量为327。该胶霉菌素在pH7-12范围内稳定,100℃处理20min，杀菌活性不变。

利用上述绿色木霉菌株液体发酵产生的胶霉菌素属于胞内代谢产物，提取过程用到的有机溶剂相对较少，且胶霉菌素收率达到发酵液总量的0.05%（w/v）以上。

利用本发明所获菌株生产胶霉菌素具有以下优点：

1、利用该菌株发酵制备胶霉菌素发酵水平达到0.05%以上，为现有文献报道的10倍以上；

2、该菌株的代谢产物胶霉菌素主要为胞内产物，可以通过有机溶剂提取干燥菌丝粉，得到胶霉菌素，大大减少有机溶剂的使用量，减轻环境压力，同时也降低生产成本；

3、该菌株为绿色木霉，其孢子可以作为微生物菌剂使用，菌丝体可以作为微生物菌肥的载体，也可以作为提取甾醇、甲壳素的原料；提取后的药

渣可以作为菌肥使用，整个生产过程没有固体废弃物产生，大大提高了木霉发酵液的综合利用及其附加值，增加了生产的收益。

综上所述，本发明提供了一株胶霉菌素高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备胶霉菌素的方法，该菌株可应用于生产胶霉菌素，该方法发酵所得胶霉菌素收率可达0.5mg/mL以上。

保藏信息

保藏时间：2011年12月16日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心

保藏编号：CGMCC No.5611

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:绿色木霉（Trichoderma viride）

附图说明

图1为本发明所获得的胶霉菌素薄层层析结果示意图；

图中1为标准品，2为本发明所获得的胶霉菌素；

图2为胶霉菌素标准品的液相色谱谱图；

图3为本发明所获得的胶霉菌素样品的液相色谱谱图；

图2为标准品谱图，基本无杂峰，说明纯度高；图3为本发明所得样品，有杂峰，说明纯度低，但两个图的主峰出峰位置（保留时间）是一致的，说明二者是同一物质，即所得样品为胶霉菌素；

图4为本发明所获得的胶霉菌素样品的质谱图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，下述实施例中所采用的菌种均为保藏号为CGMCC No.5611的菌种。

实施例1

（1）菌种活化：将4℃条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下（20℃-25℃）活化4h；

（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，无菌条件下冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，1支试管菌种接种1个三角瓶，pH值自然，培养温度24℃℃，摇床转速200r/min，培养时间为48h；

种子培养基组成（w/w）为：按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.025%,加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌20min；

（3）发酵、调控过程：将液体种子以10%（v/v）的接种量接到发酵培养基中，搅拌转速175r/min，26℃培养48h，补加发酵液总体积1w/v%的乳糖及0.05w/v%的苯丙氨酸，然后每隔48h，补充0.5w/v%的乳糖，总共培养240h；

发酵培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖4%，酵母浸粉1%，玉米粉:4%；土豆汁1%；硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸锌0.005%,加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌20min；

（4）干燥粉碎：取1000mL发酵液,经4000r/min离心10分钟后，将菌丝体50℃的条件下真空干燥，粉碎并过80目筛，即得绿木霉菌丝粉22g；

（5）胶霉菌素的提取：取绿色木霉菌丝粉20g加入200mL 95%的酒精提取，提取温度60℃,提取时间0.5h，提取次数2次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品2.36g；

（6）胶霉菌素的纯化：将胶霉菌素粗品用5倍质量的乙酸乙酯溶剂复溶，冷却到-10℃以下结晶，如此重复2次，得到胶霉菌素样品1.04g，经HPLC法检测，含量达到95.11%。

实施例2

（1）菌种活化：将4℃条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下（20℃-25℃）活化6h；

（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，1支试管菌种接种1个三角瓶，pH值自然，培养温度24℃℃，摇床转速200r/min，培养时间为48h；

种子培养基组成（w/w）为：按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.025%,加水至1000mL；

（3）发酵、调控过程：将液体种子以10%（v/v）的接种量接到2L发酵培养基中，26℃培养72h，补加发酵液总体积1w/v%的甘油及0.05w/v%的苯丙氨酸、丝氨酸混合物，然后每隔48h补充0.5w/v%的甘油，总共培养168h；

发酵培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖4%，酵母浸粉1%，玉米粉:4%；土豆汁1%；硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸锌0.01%，硫酸铜0.005%，叶酸0.005%,加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌20min；

（4）干燥粉碎：取2000mL发酵液经4000r/min离心10分钟后，将菌丝体60℃的条件下真空干燥，粉碎并过80目筛，即得绿木霉菌丝粉46.8g；

（5）胶霉菌素的提取：绿色木霉菌丝粉45g加入450mL丙酮提取，提取温度40℃,提取时间1h，提取次数2次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品4.68g；

（6）胶霉菌素的纯化：将胶霉菌素粗品用5倍的乙酸乙酯溶剂复溶，冷却到-10℃以下结晶，如此重复2次，得到胶霉菌素样品3.04g，经HPLC法检测，含量达到85.36%。

实施例3

（1）菌种活化：将4℃条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下（20℃-25℃）活化4h；

（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，1支试管菌种接种1个三角瓶，pH值自然，培养温度24℃℃，摇床转速200r/min，培养时间为48h；

种子培养基组成（w/w）为：按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.025%,加水至1000mL；

（3）发酵、调控过程：将液体种子以10%（v/v）的接种量接到1L发酵培养基中，26℃培养72h，补加发酵液总体积1w/v%的乙酸乙酯及0.1w/v%的苯丙氨酸、丝氨酸混合物，然后每隔48h补充0.5w/v%的乙酸乙酯，总共培养168h；

发酵培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉1%，玉米粉：2%；土豆汁1%；碳酸钙0.1%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸锌0.005%，硫酸铜0.002%,加水至1000mL，生物素0.005%,加水至1000mL；

（4）干燥粉碎：取1000mL发酵液经4000r/min离心10分钟后，将菌丝体60℃的条件下真空干燥，粉碎并过80目筛，即得绿木霉菌丝粉22.8g；

（5）胶霉菌素的提取：取绿色木霉菌丝粉22.8g，加入149ml乙酸乙酯提取，提取温度60℃,提取时间30minh，提取次数2次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品3.32g；

（6）胶霉菌素的纯化：将胶霉菌素粗品用5倍的乙醇溶剂复溶，冷却到-20℃以下结晶，如此重复3次，得到胶霉菌素样品1.97g，经HPLC法检测，含量达到90.13%。

实施例4

（1）菌种活化：将4℃条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下（20℃-25℃）活化4h；

（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，1支试管菌种接种1个三角瓶，pH值自然，培养温度24℃℃，摇床转速200r/min，培养时间为48h；

种子培养基组成（w/w）为：按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.4%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.025%,加水至1000mL；

（3）发酵、调控过程：将液体种子以5%（v/v）的接种量接到发酵培养基中，25℃培养48h，补加发酵液总体积1w/v%的豆油及0.1w/v%的苯丙氨酸、苏氨酸混合物，然后每隔48h补充1w/v%的豆油，总共培养240h；

发酵培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.4%，玉米粉：2%；土豆汁1%；氯化钙0.002%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸锌0.005%，硫酸铜0.001%,生物素0.01%,加水至7000mL；

（4）干燥粉碎：发酵液8000mL经4000r/min离心10分钟后，将菌丝体60℃的条件下真空干燥，粉碎并过80目筛，即得绿木霉菌丝粉218g；

（5）胶霉菌素的提取：取绿色木霉菌丝粉218g，加入2180ml乙酸乙酯提取，提取温度微沸,提取时间60minh，提取次数2次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品23.26g；

（6）胶霉菌素的纯化：将胶霉菌素粗品用5倍的乙醇溶剂复溶，冷却到-20℃以下结晶，如此重复3次，得到胶霉菌素样品12.7g，经HPLC法检测，含量达到87.62%。

实施例5

（1）菌种活化：将4℃条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下（20℃-25℃）活化4h；

（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，1支试管菌种接种1个三角瓶，pH值自然，培养温度24℃℃，摇床转速200r/min，培养时间为48h；

种子培养基组成（w/w）为：按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸镁0.025%，磷酸二氢钾0.05%,加水至1000mL；

（3）发酵、调控过程：将液体种子以10%（v/v）的接种量接到发酵培养基中，25℃培养48h，补加发酵液总体积1%（w/v）的豆油及0.1%(w/v)的酪氨酸、苏氨酸混合物，然后每隔48h补充发酵液总体积1%（w/v）的豆油，总共培养240h。

发酵培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.4%，玉米粉：2%；土豆汁1%；氯化钙0.1%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸锌0.005%，钼酸钠0.001%，氯化钴0.001%，生物素0.01%,加水至7000mL；

（4）干燥粉碎：发酵液7000nL经4000rpm离心10min后，将菌丝体60℃的条件下真空干燥，粉碎并过80目筛，即得绿木霉菌丝粉228g。

（5）胶霉菌素的提取：取绿色木霉菌丝粉228g，加入1140mL乙酸乙酯提取，提取温度60℃,在200r/min搅拌的条件下，提取时间30min，重复2次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品21.26g。

（6）胶霉菌素的纯化：将胶霉菌素粗品用5倍的乙醇溶剂复溶，冷却到-20℃以下结晶，如此重复3次，得到胶霉菌素样品9.2g，经HPLC法检测，含量达到91.62%。

Claims (8)

1.一株胶霉菌素生产菌株，其保藏号为CGMCC No.5611。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：该菌株为绿色木霉（Trichoderma viride），该菌株的16S核糖体RNA即16S rRNA的基因序列如Seq ID No:1所示。

3.一种利用权利要求1所述菌株生产胶霉菌素的方法，其特征在于：主要包括绿色木霉菌菌丝体的发酵制备以及胶霉菌素的提取分离和纯化步骤，在绿色木霉菌菌丝体的发酵制备过程中应用胶霉菌素产生和积累诱导技术，

所述的胶霉菌素产生和积累诱导技术，具体步骤如下：

A.诱导因子筛选：

从胶霉菌素的前体、生长因子、酶系的调控方面筛选诱导因子，诱导因子选自含特定金属离子的盐或绿色木霉生长因子或胶霉菌素前体；

B．诱导因子使用方法：

含特定金属离子的盐和绿色木霉生长因子添加入培养基中用于调控菌丝体细胞内酶系；在培养过程中通过补加、流加的方式补充胶霉菌素的前体；

C．发酵控制：

首先要用普通碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加惰性碳源，通过不断补料把菌体维持在半饥饿状态，从而加速胶霉菌素的合成；

其中所述诱导因子中的含特定金属离子的盐选自含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或钼离子中的一种或几种盐的混合物；绿色木霉生长因子选自生物素或叶酸；胶霉菌素前体选自丝氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸或苏氨酸或谷胱甘肽中的一种或几种的混合物；所述的惰性碳源选自甘油、乙酸乙酯、豆油、乳糖中的一种或几种的混合物。

4.根据权利要求3所述生产胶霉菌素的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）绿色木霉菌菌丝体的发酵制备：

A.菌种活化；

B.液体种子制备；

C.发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用液体深层发酵方法生产得到绿色木霉菌丝体；

其中发酵过程具体为：将液体种子以2-10%（v/v）的接种量接到发酵培养基中，26℃培养48-96h，补加0.5-1%（w/v）的惰性碳源以及0.05-0.2%（w/v）的前体，然后每隔48h，补充0.5-1%（w/v）的惰性碳源，总共培养120-240h；

（2）胶霉菌素的提取分离和纯化：

A.干燥粉碎：将上述发酵的菌丝体经固液分离后，菌丝体进行低温干燥、粉碎，得到绿色木霉菌丝粉；

B.有机溶剂提取：

绿色木霉菌丝粉加入5-20倍质量的有机溶剂提取，提取温度0-80℃,提取时间0.5-2h，提取次数1-4次，合并提取液，经浓缩后，得到胶霉菌素粗品；

C．胶霉菌素的纯化：

将胶霉菌素粗品用5-20倍质量的结晶溶剂复溶，冷却到10℃以下结晶，重复2-6次，得到胶霉菌素纯品。

5.根据权利要求4所述生产胶霉菌素的方法，其特征在于：所述的绿色木霉菌菌丝体的发酵制备具体步骤为：将保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下活化4h-8h；在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，培养温度24-26℃，摇床转速200r/min，培养时间为24-48h，制备液体种子；培养开始前，液体发酵培养基中添加占培养基总重量0.01-0.05%的含特定金属离子的盐，以及占培养基总重量0.005-0.02%的生长因子,并将液体种子以2-10%（v/v）的接种量在无菌操作的条件下接到发酵培养基中，26℃培养48-96h后，补加0.5-1%（w/v）的惰性碳源以及0.05-0.2%（w/v）的前体，然后每隔48h，补充0.5-1%（w/v）的惰性碳源，总共培养120-240h；

其中所述的菌种的保藏号为CGMCC No.5611。

6.根据权利要求4所述生产胶霉菌素的方法，其特征在于：所述提取过程的有机溶剂为乙酸乙酯、乙醇、丙酮、苯、甲苯中的一种或几种的混合物。

7.根据权利要求4所述生产胶霉菌素的方法，其特征在于：所述纯化过程的结晶溶剂为甲醇、乙醇、丙酮其中的一种或几种的混合物。

8.根据权利要求4所述生产胶霉菌素的方法，其特征在于：结晶过程温度控制为-50℃到10℃。

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