CN104789619A - 一种甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法 - Google Patents

一种甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法 Download PDF

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陈启和
范琳琳
董亚晨
牛永武
李宏吉
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Abstract

本发明公开了一种高产量的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，包括：将蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSMZ70725接入发酵培养基，发酵培养获得甘露糖赤藓糖醇脂，所述发酵培养以植物油为底物和碳源，所述发酵培养基的C/N为30～60∶1。本发明通过调整培养体系中C/N比例来提高甘露糖赤藓糖醇脂的产量，解决现有制备甘露糖赤藓糖醇脂产量低的难题。

Description

一种甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物发酵领域，尤其涉及一种甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法。
背景技术
甘露糖赤藓糖醇脂(Mannosylerythritol lipids，MELs)是一种糖脂类生物表面活性剂。目前用于转化生产MELs的菌种主要有黑粉霉菌(Ustligomaydis)和拟酵母属(Pseudazyma)。
与化学表面活性剂相比，MELs不仅具有生物相容性、生物可降解性、无毒或低毒等特性，具有良好的表面活性、乳化性、生物降解性、较低的临界胶束浓度，还具有许多特殊的生理活性，如抑制微生物生长、诱导细胞变异、可分化人类骨髓性白血病细胞系和黑素瘤细胞、提高基因转染效率、与糖蛋白有很强的配位能力等，这些特性使MELs在环保、食品、化妆品、医药等行业有很大的应用前景。但是MELs至今未能商业化应用，产量低、生产成本高是制约其广泛应用的一个重要因素。
目前研究提高其产量的手段主要有两种，一是挖掘新菌种资源，优化发酵条件及培养基组成成分提高产量；二是选用一些廉价的亲水性碳源作为发酵转化MELs的底物，降低后续分离纯化的难度，提高产物回收率。众所周知，培养基中任何微生物代谢产物的合成都受到培养基中C/N比的影响，尤其是次级代谢产物的合成，但不同的微生物代谢产物所需要的比例是完全不一样的，而围绕MELs合成如何被C/N比调控是不得而知的，也未有相关报道。
而通过培养体系中营养因子比例的改变也可以达到调控MELs形成，因此基于培养基中组成的变化来改变其产量也可以实现其MELs合成。目前，已经报道MELs合成响应面技术已经被广泛应用于微生物发酵培养基的成分和发酵过程的优化。经检索采用响应面技术中的部分因子设计优化摇瓶发酵培养基组成成分的方法，提高Pseudazyma aphidis转化生产MELs的文献及专利未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高甘露糖赤藓糖醇脂产量的方法，解决现有制备甘露糖赤藓糖醇脂产量低的难题。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，包括：将蚜虫拟酵母(Pseudozymaaphidis)DSMZ70725接入发酵培养基，发酵培养获得甘露糖赤藓糖醇脂，所述发酵培养以植物油为底物和碳源，所述发酵培养基的C/N为30～60∶1。
本发明所使用菌种为蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSMZ70725，该菌种购于德国菌种保藏中心，Deutsche Sammulung von Microorganismenund Zellkulturen(DSMZ)。
作为优选，所述的发酵培养基的C/N为45～60∶1。
再优选，所述的发酵培养基的C/N为59∶1。
碳源与氮源浓度比例的改变对MELs合成的产量产生突出影响，在实施过程中发现限制性氮源浓度有利于MELs的合成与提高。
本发明中，所述的碳源为植物油，所述的氮源为酵母粉。其他组分固定不变。
本发明中，以重量百分比计，所述的发酵培养基中包括以下成分：植物油6.32～10.0％，酵母粉0.1～0.32％，硫酸镁0.01～0.1％，磷酸二氢钾0～0.05％，硫酸锰0～0.01％，硫酸铜0～0.004％，氯化钙0～0.005％。
作为优选，以重量百分比计，所述的发酵培养基中包括以下成分：植物油9.68％，酵母粉0.15％，硫酸镁0.06％，硫酸锰0.01％，氯化钙0.003％。
所述的植物油为大豆油、橄榄油、菜籽油、葵花籽油、花生油、玉米胚芽油、油茶籽油、和小麦胚芽油中的至少一种。植物油可以为单种油或不同植物油调配而成的调和油，以其作为生物转化的底物，生产所得的表面活性剂甘露糖赤藓糖醇脂安全无毒、品质优良，而且以可再生资源为转化底物，可以有效减少环境污染，降低生产成本。
作为优选，所述的植物油为大豆油，产物产量较高。
本发明中，具体的蚜虫拟酵母培养方法如下：
(1)将经活化的蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSMZ70725接入种子培养基进行种子培养，得到菌体细胞；
(2)将菌体细胞接入发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液；
(3)从发酵液中分离纯化得到甘露糖赤藓糖醇脂。
步骤(1)中，所述的活化方法为：将蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSMZ70725接种到活化培养基中，于25～30℃培养2～4d；活化培养基可以为麦芽糖琼脂培养基。
优选地，将蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSMZ70725接种到麦芽糖琼脂培养基中，于28℃培养3d，待菌体长满平板备用。
以重量百分比计，所述的种子培养液包括以下成分：葡萄糖4.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.1％。
所述种子培养的培养温度为28～30℃，摇床转速为150～220rpm，培养时间为24～72h。
优选地，所述的种子培养温度为28℃，摇床转速为180rpm，培养24h。
种子培养完成后，菌体细胞可以通过如下方法分离得到：将培养后的种子液体在4℃下，3000～4000rpm离心15～30min，去除上清液，分离得到菌体细胞，并用浓度0.9％的氯化钠溶液洗涤2～3次待用。
以每升发酵培养基计，按照菌体细胞悬浮液(将菌体细胞在无菌水中悬浮)的体积计算，所述菌体细胞悬浮液的接入量为1～20mL，所述菌体细胞悬浮液的OD600值为2.0～2.6；或者按照菌体细胞生物量计算，接入量为0.1～0.3g。
优选地，按照菌体细胞悬浮液的体积计算，所述菌体细胞悬浮液的接入量为20mL，所述菌体细胞悬浮液的OD600值为2.0；或者按照菌体细胞生物量计算，接入量为0.2g。
所述发酵培养的培养时间为7～15d，使底物能够被充分转化。
所述的发酵培养为摇床振荡培养，摇床转速为150～220rpm。
从发酵培养后得到的发酵液中分离纯化，得到产品甘露糖赤藓糖醇脂。分离纯化包括：将发酵液用有机溶剂萃取、分离2～3次，合并有机相，减压浓缩除去有机溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂粗品；采用甲醇和环己烷对甘露糖赤藓糖醇脂粗品进一步分离纯化，得到甘露糖赤藓糖醇脂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
通过采用碳源与氮源浓度比例的改变可以显著提高该菌产MELs，优选发现植物油为9.68％，酵母粉0.15％，即C/N比为59∶1时，即在限制性氮源条件下有利于MELs的合成，与低C/N条件相比(37∶1)，其产量提高近300％。
具体实施方式
以下实施例中，所用菌种为蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSMZ70725。该菌种购于德国菌种保藏中心，即Deutsche Sammulung vonMicroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)。实施例中所用的植物油为大豆油，所述的氮源为酵母粉。
实施例1
(1)菌种活化：以灭过菌的麦芽糖琼脂平板为活化培养基，接入冷藏保存的菌株蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSMZ70725，在28℃条件下活化培养3d，待菌体长满平板备用。其中麦芽糖琼脂培养基成分组成包含葡萄糖1％，大豆蛋白胨0.5％，麦芽浸出粉0.3％，酵母粉0.3％，琼脂粉1.5％，蒸馏水。
(2)种子培养：从平板培养基上挑取一环菌体接入装有50mL种子培养液的250mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下培养24h；将培养后的种子液体在4℃下，3000rpm离心15min，去除上清，分离得到菌体细胞，取菌体细胞，并用浓度0.9％的氯化钠溶液洗涤3次。
其中，种子培养液组分包含葡萄糖4.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.1％，蒸馏水。
(3)发酵培养：将OD600＝2.0的菌体细胞按20mL/L接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下培养10d；
其中，发酵培养基的成分包括：植物油8.0％，硫酸镁0.06％，硫酸锰0.01％，酵母粉0.15％，氯化钙0.003％，pH自然，即C/N比值为49∶1。
(4)分离纯化：发酵培养完成后，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品。采用甲醇和环己烷对甘露糖赤藓糖醇脂粗品进一步萃取分离纯化，去除少量剩余油脂得到甘露糖赤藓糖醇脂，约为62.5g/L。
实施例2
步骤(1)和步骤(2)按照实施例1所述的实施。
(3)发酵培养：将OD600＝2.0的菌体细胞按20mL/L接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下培养10d；
其中，发酵培养基的成分包括：植物油9.68％，酵母粉0.15％，硫酸镁0.06％，氯化钙0.003％，硫酸锰0.01％，pH自然；即C/N比值为59∶1。
(4)分离纯化：发酵培养完成后，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品。采用甲醇和环己烷对甘露糖赤藓糖醇脂粗品进一步萃取分离纯化，去除少量剩余油脂得到甘露糖赤藓糖醇脂，约为80.0g/L。
实施例3
步骤(1)和步骤(2)按照实施例1所述的实施。
(3)发酵培养：将OD600＝2.0的菌体细胞按20mL/L接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下培养10d；
其中，发酵培养基的成分包括：植物油6.32％，酵母粉0.15％，硫酸镁0.06％，氯化钙0.003％，硫酸锰0.01％，pH自然；即培养体系中的C/N比值为37∶1。
(4)分离纯化：发酵培养完成后，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品。采用甲醇和环己烷对甘露糖赤藓糖醇脂粗品进一步萃取分离纯化，去除少量剩余油脂得到甘露糖赤藓糖醇脂，约为28.57g/L。
实施例4
步骤(1)和步骤(2)按照实施例1所述的实施。
(3)发酵培养：将OD600＝2.0的菌体细胞按20mL/L接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下培养10d；
其中，发酵培养基的成分包括：植物油8.0％，酵母粉0％，硫酸镁0.06％，氯化钙0.003％，硫酸锰0.01％，pH自然。
(4)分离纯化：发酵培养完成后，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品。采用甲醇和环己烷对甘露糖赤藓糖醇脂粗品进一步萃取分离纯化，去除少量剩余油脂得到甘露糖赤藓糖醇脂，约为36.17g/L。
从上述实施例可以看出，不添加氮源并非能产生提高MELs产量的效果，高浓度的氮源存在导致MELs合成量降低，而低浓度的限制性氮源反而有利于高产MELs，这反应出本发明的产MELs微生物具有特殊的代谢途径及其对营养物质的需求特性。

Claims (9)

1.一种甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，包括：将蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)DSMZ70725接入发酵培养基，发酵培养获得甘露糖赤藓糖醇脂，所述发酵培养以植物油为底物和碳源，其特征在于，所述发酵培养基的C/N为30～60∶1。
2.根据权利要求1所述的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基的C/N为45～60∶1。
3.根据权利要求2所述的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基的C/N为59∶1。
4.根据权利要求1所述的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，其特征在于，所述的氮源为酵母粉。
5.根据权利要求1所述的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，其特征在于，以重量百分比计，所述的发酵培养基中包括以下成分：植物油6.32～10.0％，酵母粉0.1～0.32％，硫酸镁0.01～0.1％，磷酸二氢钾0～0.05％，硫酸锰0～0.01％，硫酸铜0～0.004％，氯化钙0～0.005％。
6.根据权利要求5所述的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，其特征在于，以重量百分比计，所述的发酵培养基中包括以下成分：植物油9.68％，酵母粉0.15％，硫酸镁0.06％，硫酸锰0.01％，氯化钙0.003％。
7.根据权利要求1所述的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，其特征在于，所述的植物油为大豆油、橄榄油、菜籽油、葵花籽油、花生油、玉米胚芽油、油茶籽油、和小麦胚芽油中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，其特征在于，以每升发酵培养基计，按照菌体细胞悬浮液的体积计算，所述菌体细胞悬浮液的接入量为1～20mL，所述菌体细胞悬浮液的OD600值为2.0～2.6；或者按照菌体细胞生物量计算，接入量为0.1～0.3g。
9.根据权利要求1所述的高产量的甘露糖赤藓糖醇脂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养为摇床振荡培养，培养时间为7～15d，摇床转速为150～220rpm。
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