CN103276019A - 一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素合成的方法 - Google Patents

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本发明涉及一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素生物合成的方法。该方法的具体操作步骤如下：（1）在平板上分别培养三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株，得到孢子悬液；（2）将三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株分别接种到装有种子培养基的锥形瓶中；（3）将培养好的1瓶正菌、4瓶负菌种子液混合均匀，接入发酵培养基中发酵；（4）在发酵开始后的24-48小时加入NAD+前体物质继续培养至84小时结束。本发明的方法操作简单、大幅度提高了番茄红素的产量、降低了生产成本，可应用于番茄红素的工业化生产。

Description

一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素合成的方法
技术领域
本发明属于提高好氧微生物液体深层发酵次级代谢产物生物合成的领域，特别涉及到一种添加NAD+前体物质促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素生物合成的方法。
背景技术
番茄红素是脂溶性色素，是人体血浆中发现的主要的类胡萝卜素之一。具有高效猝灭单线态氧和清除自由基的作用，其抗氧化性在类胡萝卜素中最强，番茄红素在预防人类某些癌症和慢性病的发生方面起着重要作用，是目前国际上功能食品成分研究的一个热点。
对于番茄红素的生产方法，目前除了可以从植物中提取以及通过化学法合成之外，还可以利用微生物发酵的方法进行番茄红素的生产。植物提取法所需要的原料种植具有季节性，产量含量受多种因素控制，番茄红素在植物中含量不稳定，且原料中常含有其他的类胡萝卜素，所以提取工艺繁琐冗长，成本昂贵，化学合成法尽管成本较低，但由于污染环境及产品活性较低，与天然的番茄红素存在一定差距，产品应用范围受到限制，因此利用微生物发酵法生产番茄红素受到了国内外学者的广泛关注。目前发现的能够生产番茄红素的微生物包括能自身合成番茄红素的革兰氏阴性菌、三孢布拉氏霉菌和基因工程菌等。其中，三孢布拉氏霉菌是目前唯一能够实现β-胡萝卜素工业化生产的菌种，如果在其进行发酵培养时往培养基中加入能有效抑制环化酶作用的物质，便能阻止番茄红素经过环化反应形成β-胡萝卜素，达到积累番茄红素的目的。目前利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素已经达到半工业化的水平，但是实现番茄红素在三孢布拉氏霉菌中大量积累仍是制约发酵法生产番茄红素的主要因素，因此，选育高产菌株，优化发酵培养条件，添加发酵促进剂以及基因改造等手段仍是提高番茄红素产量的主要方法。
发明内容
本发明的主要目的在于促进三孢布拉氏霉菌液体深层发酵生产番茄红素的生物合成。具体实施方法是在发酵液中添加NAD+前体物质促进番茄红素的生物合成。其特征在于：在发酵过程中往发酵液中加入NAD+前体物质；加入NAD+前体物质的浓度为0.3-0.5g/l起始发酵液体积；加入NAD+前体物质的时间是发酵开始后24-48小时。
一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素合成的方法，其特征在于步骤如下：
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂；115℃下灭菌30 min，冷却降温后即可制得PDA培养基；取三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存；
2）种子培养：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min；冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，115℃下灭菌30 min；从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于26-28℃，180 -200rpm条件下避光培养36-40小时；
3）发酵培养：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，分装于500ml锥形瓶中， 115℃下灭菌30 min；将培养好的三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%v/v的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，加入烟酸或烟酰胺，于26-28℃，200-220rpm条件下避光培养84小时；在发酵开始后36小时加入250μL体积浓度为10%的阻断剂烟碱；发酵84小时后，用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体；
烟酸或烟酰胺的加入量为0.3-0.5g/l起始发酵液体积；加入的时间是发酵开始后24-48小时。
番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.03-0.05g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
在利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的过程中，我们发现添加NAD+前体物质（烟酸、烟酰胺）能够大幅度提高番茄红素的生物合成。NAD+作为代谢网络中一种关键的辅助因子，对生物体中多种氧化还原反应起着重要作用。有研究表明NAD+对葡萄糖代谢有关键影响，机体缺乏NAD+会迫使糖代谢终止。烟酸和烟酰胺是NAD+的前体物质，在利用三孢布拉氏霉菌进行番茄红素的生产过程中，我们通过添加烟酸和烟酰胺大幅度提高了番茄红素的产量。该方法氨基酸操作简单，成本较低，不影响后期番茄红素的分离纯化，可以应用于番茄红素的工业化生产中。
具体实施方式
实施例1
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养4天，4℃保存。
2）种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
3）发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
4）种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于26℃，转速为190rpm条件下避光培养38小时。
5）发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于28℃，转速为200rpm条件下避光培养。在发酵开始后36小时加入250μL体积浓度为10%的阻断剂烟碱。准确称取0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04g烟酸，加入发酵培养基中，标记。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
6）番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.03g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
所得结果如下：
添加烟酸浓度为0.3g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为771mg/l发酵液，比空白提高了57%。
添加烟酸浓度为0.4g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为819mg/l发酵液，比空白提高了66%。
添加烟酸浓度为0.5g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为752mg/l发酵液，比空白提高了53%。
实施例2
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养3天，4℃保存。
2）种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
3）发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
4）种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于26℃，转速为200rpm条件下避光培养40小时。
5）发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于28℃，转速为220rpm条件下避光培养。在发酵培养了0、12、24、36、48、60小时后分别加入浓度为0.4g/l起始发酵液体积的烟酸，在发酵开始后36小时加入250μL体积浓度为10%的阻断剂烟碱。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
6）番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.04g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
所得结果如下：
发酵开始后24小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的烟酸，番茄红素产量为734mg/l发酵液，比空白提高了53%。
发酵开始后36小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的烟酸，番茄红素产量为826mg/l发酵液，比空白提高了72%。
发酵开始后48小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的烟酸，番茄红素产量为776mg/l发酵液，比空白提高了61%。
实施例3
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养5天， 4℃保存。
2）种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
3）发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
4）种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于27℃，转速为200rpm条件下避光培养36小时。
5）发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于26℃，转速为220rpm条件下避光培养。在发酵开始后36小时加入250μL体积浓度为10%的阻断剂烟碱。准确称取0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04g烟酰胺，加入发酵培养基中，标记。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
6）番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.05g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
所得结果如下：
添加烟酰胺浓度为0.3g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为690mg/l发酵液，比空白提高了50%。
添加烟酰胺浓度为0.4g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为734mg/l发酵液，比空白提高了60%。
添加烟酰胺浓度为0.5g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为678mg/l发酵液，比空白提高了47%。
实施例4
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养5天， 4℃保存。
2）种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
3）发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
4）种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于28℃，转速为190rpm条件下避光培养38小时。
5）发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于26℃，转速为220rpm条件下避光培养。在发酵培养了0、12、24、36、48、60小时后分别加入浓度为0.4g/l起始发酵液体积的烟酰胺，在发酵开始后36小时加入250μL体积浓度为10%的阻断剂烟碱。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
6）番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.05g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
所得结果如下：
发酵开始后24小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的烟酰胺，番茄红素产量为803mg/l发酵液，比空白提高了62%。
发酵开始后36小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的烟酰胺，番茄红素产量为850mg/l发酵液，比空白提高了71%。
发酵开始后48小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的烟酰胺，番茄红素产量为758mg/l发酵液，比空白提高了53%。

Claims (1)

1.一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素合成的方法，其特征在于步骤如下：
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂；115℃下灭菌30 min，冷却降温后即可制得PDA培养基；取三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存；
2）种子培养：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min；冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，115℃下灭菌30 min；从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于26-28℃，180 -200rpm条件下避光培养36-40小时；
3）发酵培养：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，分装于500ml锥形瓶中， 115℃下灭菌30 min；将培养好的三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%v/v的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，加入烟酸或烟酰胺，于26-28℃，200-220rpm条件下避光培养84小时；在发酵开始后36小时加入250μL体积浓度为10%的阻断剂烟碱；发酵84小时后，用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体；
烟酸或烟酰胺的加入量为0.3-0.5g/l起始发酵液体积；加入的时间是发酵开始后24-48小时。
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