CN105695343A - 三孢布拉霉及三孢布拉霉制备番茄红素的方法 - Google Patents

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CN105695343A CN201610173291.3A CN201610173291A CN105695343A CN 105695343 A CN105695343 A CN 105695343A CN 201610173291 A CN201610173291 A CN 201610173291A CN 105695343 A CN105695343 A CN 105695343A
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Abstract

本发明公开了一种三孢布拉霉，该三孢布拉霉被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。一种三孢布拉霉制备番茄红素的方法，活化；将活化菌种接种至种子培养基上，在温度为30～35℃、转速为150～220rpm下，培养42～44，得到种子培养液；将种子培养液接种至发酵培养基上，在避光条件下，在32～35℃下，发酵120～144h，在发酵46～48h时，加入阻断剂；萃取发酵液中的番茄红素，萃取剂为丙酮或石油醚，发酵液与萃取剂的质量比为1:200～250，萃取温度为40～60℃，萃取时间为2h；提取萃取液，提取温度40～50℃，-4℃过夜结晶，用液相色谱测得番茄红素的纯度达到85％以上。本发明不仅提高了番茄红素的产量，而且分离番茄红素纯度高。

Description

三孢布拉霉及三孢布拉霉制备番茄红素的方法
技术领域
本发明涉及一种三孢布拉霉及三孢布拉霉制备番茄红素的方法。
背景技术
番茄红素又名ψ-胡萝卜素，是一种开链式的不饱和胡萝卜素，为胡萝卜素和叶黄素生物合成过程中的中间产物，经两步环化反应后即为胡萝卜素。其全反式结构为：
随着研究的不断深入，人们发现番茄红素具有很强的清除氧自由基的能力，尤其是近年许多研究表明其在防癌、抗癌等方面具有显著效果。番茄红素的应用也已从最早仅作为色素添加到食品、饮料和化妆品中逐渐扩展到保健品、医药行业，国内外市场上呈现出番茄红素供不应求的景象。这些因素使得番茄红素的生产制备工艺以及病理学研究成为当今的热点。以色列、日本、俄罗斯等国家以及罗氏、巴斯夫等跨国公司在此方面具领先地位。
以色列Lycored公司多年前就从事番茄红素的开发研究并已取得了世界领先地位。日本Nippon公司通过离心分离、微滤、提纯从西红柿开发番茄红素，从230kg西红柿浆中分离到20kg含0.5％番茄红素的色素，用于加工运动饮料及果冻。日本Kagome公司开发生产了一种含番茄红素的饲料，将西红柿压碎、离心去汁、冻干后与基本饲料混合而得。罗氏公司采用合成方法生产番茄红素，1997年10月该公司完成了工艺开发并在欧洲提出专利申请。德国巴斯夫公司也看到了番茄红素不可估量的市场潜力，投人力量进行研究开发，1997年8月完成了合成工艺开发,并在欧洲提出专利申请。
目前世界上番茄红素的生产主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等方法。番茄中的番茄红素含量很低，通常每吨西红柿中仅含20g番煎红素，并且天然提取法产率较低、价格高昂，不能满足市场需求。化学合成法成本虽低但容易造成污染，存在一定不安全性。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种三孢布拉霉及三孢布拉霉制备番茄红素的方法，其不仅提高了番茄红素的产量，而且分离番茄红素纯度高。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种三孢布拉霉BlakesleatrisporaH019-D，所述三孢布拉霉被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.11740，保藏时间为：2015年11月25日。
一种利用三孢布拉霉制备番茄红素的方法，包括以下步骤：
步骤一、活化：在无菌条件下，将权利要求1所述的三孢布拉霉的菌种接种至LB培养基上，在温度为35～40℃、转速为240～250r/min下，培养24～28h，得到活化菌种，其中，接种至LB培养基上的三孢布拉霉的菌种的体积为LB培养基体积的1％～5％；
步骤二、种子培养：将活化菌种接种至种子培养基上，在温度为30～35℃、转速为150～220rpm下，培养42～44h，得到种子培养液；
步骤三、种子发酵：将步骤二得到的种子培养液接种至发酵培养基上，在避光条件下，在30～35℃下，发酵120～144h，其中，在发酵24～36h时，加入发酵培养基质量的5～10％的大豆油或菜籽油，在36-48h时，加入发酵培养基质量的0.3～0.6％的大豆卵磷脂，在发酵46～48h时，加入阻断剂，接种至发酵培养基上的种子培养液的体积为种子培养基体积的10％～20％；在发酵过程中，使用5mol/L氨水将发酵培养基的pH值控制在6.0～6.5；
发酵过程中空气流量3～4L/min，采用的补料方式，控制溶氧在25～30％，转速保持在600～800r/min；
步骤四、分离：萃取发酵液中的番茄红素，萃取剂为丙酮或石油醚，发酵液与萃取剂的体积比为1:200～250，萃取温度为40～60℃，萃取时间为2h；提取萃取液，提取温度40～50℃，-4℃过夜结晶，即得到番茄红素，所得到的番茄红素的纯度达到85％以上。
优选的是，所述的利用三孢布拉霉制备番茄红素的方法，所述步骤二中，种子培养基包括以下质量分数的组数：淀粉4％、玉米粉5％，甘油2.5％、KH2PO40.2％、MgSO4+7H2O0.05％、维生素B10.001％和水88.249％；
其中，种子培养基的初始pH值为6.0～6.5，且在121℃灭菌20～25min。
优选的是，所述的利用三孢布拉霉制备番茄红素的方法，所述步骤三中，发酵培养基包括以下质量分数的组数：淀粉4％、棉籽油8.5％、黄豆粉2.2％、甘油2.5％、KH2PO40.1％、MgSO4+7H2O0.04％、维生素B10.001％、水82.659，
其中，发酵培养基的初始pH值为6.0，且在121℃灭菌20～25min。
本发明至少包括以下有益效果：第一、本发明采用高密度液体发酵技术，制备的番茄红素具有产量高、产品单一性强、污染小等特点，技术上处于国内领先水平，提供一种番茄红素产业化生产方法；第二、本发明提取方法操作简单、分离番茄红素纯度不低于85％，整个提取工艺中多糖提取率不低于12％
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解
附图说明
图1为本发明所述的三孢布拉霉制备番茄红素的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1、
一种三孢布拉霉BlakesleatrisporaH019-D，其分类命名为三孢布拉霉，三孢布拉霉被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.11740，保藏时间为：2015年11月25日；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2、
如图1所示，一种利用实施例1所述的酿酒酵母制备番茄红素的方法，包括以下步骤：
菌株筛选过程：在长有三孢布拉霉的培养基中加入5mL生理盐水，用涂布器将孢子提出，溶于生理盐水；取1.5mL三孢布拉霉的孢子悬液在3000rpm下离心，弃去上清液后，加入生理验收，使菌悬液浓度达到107～8个/ml；取100μL菌悬液加入PDA-SDC-洛伐他汀(PDA为马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，在PDA培养基的配置中加入1mg/100mL的脱氧胆酸钠(SDC)和0.1mg/100mL的洛伐他汀配制而成。)培养基上涂布，在紫外灯下照射3min；在22℃下培养48h，挑选生长较好的单菌落，转接到PDA培养基中；重复筛选三次，最后将挑选的较好的单菌落转移到PDA培养基中保存。
PDA固体培养基：土豆提取液1.0L(400g土豆加1.5水煮沸50min)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，10mg/L的VB1，115℃灭菌25min。
步骤一、活化：在无菌条件下，将上述筛选的三孢布拉霉的菌种接种至LB培养基上，在温度为35℃、转速为240r/min下，培养24h，得到活化菌种，其中，接种至LB培养基上的三孢布拉霉的菌种的体积为LB培养体积量的1％；
步骤二、种子培养：将活化菌种接种至种子培养基上，在温度30℃、转速为150rpm下，培养42h，得到种子培养液；
步骤三、种子发酵：将步骤二得到的种子培养液接种至发酵培养基上，在避光条件下，在30℃下，发酵120h，其中，在发酵24h时，加入发酵培养基质量的5％的大豆油或菜籽油，在36h时，加入发酵培养基质量的0.3％的大豆卵磷脂，在发酵46h时，加入阻断剂，接种至发酵培养基上的种子培养液的体积为种子培养基体积的10％；在发酵过程中，使用5mol/L氨水将发酵培养基的pH值控制在6.0；
发酵过程中空气流量3L/min，采用的补料方式，控制溶氧在25％，转速保持在600r/min；
步骤四、分离：萃取发酵液中的番茄红素，萃取剂为丙酮或石油醚，发酵液与萃取剂的质量比为1:200，萃取温度为40℃，萃取时间为2h；提取萃取液，提取温度40℃，-4℃过夜结晶，番茄红素的纯度为86.93％。
洗涤、干燥。
在一种实施方式中，步骤二中，种子培养基包括以下质量分数的组数：淀粉4％、玉米粉5％，甘油2.5％、KH2PO40.2％、MgSO4+7H2O0.05％、维生素B10.001％和水88.249％；
其中，种子培养基的初始pH值为6.0，且在121℃灭菌20min。
在一种实施方式中步骤三中，发酵培养基包括以下质量分数的组数：淀粉4％、棉籽油8.5％、黄豆粉2.2％、甘油2.5％、KH2PO40.1％、MgSO4+7H2O0.04％、维生素B10.001％、水82.659，
其中，发酵培养基的初始pH值为6.0，且在121℃灭菌20min。
实施例3、
如图1所示，一种利用实施例1所述的酿酒酵母制备番茄红素的方法，包括以下步骤：
菌株筛选过程：在长有三孢布拉霉的培养基中加入5mL生理盐水，用涂布器将孢子提出，溶于生理盐水；取1.5mL三孢布拉霉的孢子悬液在5000rpm下离心，弃去上清液后，加入生理验收，使菌悬液浓度达到107～8个/ml；取100μL菌悬液加入PDA-SDC-洛伐他汀(PDA为马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，在PDA培养基的配置中加入1-2mg/100mL的脱氧胆酸钠(SDC)和0.2mg/100mL的洛伐他汀配制而成。)培养基上涂布，在紫外灯下照射7min；在28℃下培养60h，挑选生长较好的单菌落，转接到PDA培养基中；重复筛选三次，最后将挑选的较好的单菌落转移到PDA培养基中保存。
PDA固体培养基：土豆提取液1.0L(400g土豆加1.5水煮沸50min)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，20mg/L的VB1，115℃灭菌30min。
步骤一、活化：在无菌条件下，将上述筛选的三孢布拉霉的菌种接种至LB培养基上，在温度为40℃、转速为250r/min下，培养28h，得到活化菌种，其中，接种至LB培养基上的三孢布拉霉的菌种的体积为LB培养体积量的5％；
步骤二、种子培养：将活化菌种接种至种子培养基上，在温度为35℃、转速为220rpm下，培养44h，得到种子培养液；
步骤三、种子发酵：将步骤二得到的种子培养液接种至发酵培养基上，在避光条件下，在35℃下，发酵144h，其中，在发酵36h时，加入发酵培养基质量的10％的大豆油或菜籽油，在36～48h时，加入发酵培养基质量的0.6％的大豆卵磷脂，在发酵48h时，加入阻断剂，接种至发酵培养基上的种子培养液的体积为种子培养基体积的20％；在发酵过程中，使用5mol/L氨水将发酵培养基的pH值控制在6.5；
发酵过程中空气流量4L/min，采用的补料方式，控制溶氧在30％，转速保持在800r/min；
步骤四、分离：萃取发酵液中的番茄红素，萃取剂为丙酮或石油醚，发酵液与萃取剂的质量比为1:250，萃取温度为60℃，萃取时间为2h；提取萃取液，提取温度50℃，-4℃过夜结晶，番茄红素的纯度为87.93％。
洗涤、干燥。
在一种实施方式中，步骤二中，种子培养基包括以下质量分数的组数：淀粉4％、玉米粉5％，甘油2.5％、KH2PO40.2％、MgSO4+7H2O0.05％、维生素B10.001％和水88.249％；
其中，种子培养基的初始pH值为6.5，且在121℃灭菌25min。
在一种实施方式中步骤三中，发酵培养基包括以下质量分数的组数：淀粉4％、棉籽油8.5％、黄豆粉2.2％、甘油2.5％、KH2PO40.1％、MgSO4+7H2O0.04％、维生素B10.001％、水82.659，
其中，发酵培养基的初始pH值为6.0，且在121℃灭菌25min。
实施例4、
一、三孢布拉霉菌筛选：
菌株筛选过程：在长有三孢布拉霉的培养基中加入5mL生理盐水，用涂布器将孢子提出，溶于生理盐水；取1.5mL三孢布拉霉的孢子悬液在3000～5000rpm下离心，弃去上清液后，加入生理验收，使菌悬液浓度达到107～8个/ml；取100μL菌悬液加入PDA-SDC-洛伐他汀(PDA为马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，在PDA培养基的配置中加入1-2mg/100mL的脱氧胆酸钠(SDC)和0.1～0.2mg/100mL的洛伐他汀配制而成。)培养基上涂布，在紫外灯下照射3～7min；在28-22℃下培养48～60h，挑选生长较好的单菌落，转接到PDA培养基中；重复筛选三次，最后将挑选的较好的单菌落转移到PDA培养基中保存。
PDA固体培养基：土豆提取液1.0L(400g土豆加1.5水煮沸50min)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，10～20mg/L的VB1，115℃灭菌25～30min。
二、利用筛选出的三孢布拉霉菌制备番茄红素
在无菌条件下，活化三孢布拉霉菌，从活化后的三孢布拉霉菌的斜面中接入种子培养基，在500mL三角瓶中装120mL种子培养基，在33℃，180rpm的条件下，培养44h。在5L发酵罐中装入1800mL发酵培养基，最适培养基初始pH值＝6，最佳接种量为15％，35℃条件下避光培养。在发酵的第48小时，菌体开始变黄，此时添加阻断剂，积累番茄红素，至144h时结束发酵，番茄红素产量为5.48g/L，其中，在发酵36h时，加入发酵培养基质量的5～10％的大豆油或菜籽油，在48h时，加入发酵培养基质量的0.3～0.6％的大豆卵磷脂，在发酵过程中，使用5mol/L氨水将发酵培养基的pH值控制在6.0～6.5；发酵过程中空气流量3～4L/min，采用的补料方式，控制溶氧在25～30％，转速保持在600～800r/min。
称取10g三孢布拉霉湿菌体于烧瓶中，加入乙醇50mL，迅速搅拌30s后避光静置，每5min用酒精计检测酒精浓度，然后将处理液过滤用等体积的石油醚在60℃萃取2h，物料比1:250，提取温度40℃，于-4℃过夜结晶，用液相色谱测得分离番茄红素纯度为87.25％。
实施例5、
一、三孢布拉霉菌筛选：
菌株筛选过程：在长有三孢布拉霉的培养基中加入5mL生理盐水，用涂布器将孢子提出，溶于生理盐水；取1.5mL三孢布拉霉的孢子悬液在3000～5000rpm下离心，弃去上清液后，加入生理验收，使菌悬液浓度达到107～8个/ml；取100μL菌悬液加入PDA-SDC-洛伐他汀(PDA为马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，在PDA培养基的配置中加入1-2mg/100mL的脱氧胆酸钠(SDC)和0.1～0.2mg/100mL的洛伐他汀配制而成。)培养基上涂布，在紫外灯下照射3～7min；在28-22℃下培养48～60h，挑选生长较好的单菌落，转接到PDA培养基中；重复筛选三次，最后将挑选的较好的单菌落转移到PDA培养基中保存。
PDA固体培养基：土豆提取液1.0L(400g土豆加1.5水煮沸50min)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，10～20mg/L的VB1，115℃灭菌30min。
二、利用筛选出的三孢布拉霉菌制备番茄红素
在无菌条件下，活化三孢布拉霉菌，从活化后的三孢布拉霉菌的斜面中接入种子培养基，在500mL三角瓶中装150mL种子培养基，在32℃，220rpm的条件下，培养42h。在5L发酵罐中装1500mL发酵培养基，培养基初始pH值为6.5，接种量为20％，35℃条件下避光培养。在发酵的第46h，菌体开始变黄，此时添加阻断剂，积累番茄红素，至120h时结束发酵，番茄红素产量为4.86g/L，其中，在发酵24h时，加入发酵培养基质量的5～10％的大豆油或菜籽油，在36h时，加入发酵培养基质量的0.3～0.6％的大豆卵磷脂，在发酵过程中，使用5mol/L氨水将发酵培养基的pH值控制在6.0～6.5，发酵过程中空气流量3～4L/min，采用的补料方式，控制溶氧在25～30％，转速保持在600～800r/min。
称取10g三孢布拉霉湿菌体于烧瓶中，加入乙醇30mL，迅速搅拌50s后避光静置，每5min用酒精计检测酒精浓度，将处理液过滤用等体积的丙酮在45℃萃取2h，物料比1:200，提取温度50℃，-4℃过夜结晶，用液相色谱测得分离番茄红素纯度为87.47％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (4)

1.一种三孢布拉霉BlakesleatrisporaH019-D，其特征在于，所述三孢布拉霉被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.11740，保藏时间为：2015年11月25日。
2.一种利用权利要求1所述的三孢布拉霉制备番茄红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、活化：在无菌条件下，将权利要求1所述的三孢布拉霉的菌种接种至LB培养基上，在温度为35～40℃、转速为240～250r/min下，培养24～28h，得到活化菌种，其中，接种至LB培养基上的三孢布拉霉的菌种的体积为LB培养基体积的1％～5％；
步骤二、种子培养：将活化菌种接种至种子培养基上，在温度为30～35℃、转速为150～220rpm下，培养42～44h，得到种子培养液；
步骤三、种子发酵：将步骤二得到的种子培养液接种至发酵培养基上，在避光条件下，在30～35℃下，发酵120～144h，其中，在发酵24～36h时，加入发酵培养基质量的5～10％的大豆油或菜籽油，在36-48h时，加入发酵培养基质量的0.3～0.6％的大豆卵磷脂，在发酵46～48h时，加入阻断剂，接种至发酵培养基上的种子培养液的体积为种子培养基体积的10％～20％；在发酵过程中，使用5mol/L氨水将发酵培养基的pH值控制在6.0～6.5；
发酵过程中空气流量3～4L/min，采用的补料方式，控制溶氧在25～30％，转速保持在600～800r/min；
步骤四、分离：萃取发酵液中的番茄红素，萃取剂为丙酮或石油醚，发酵液与萃取剂的体积比为1:200～250，萃取温度为40～60℃，萃取时间为2h；提取萃取液，提取温度40～50℃，-4℃过夜结晶，即得到番茄红素。
3.如权利要求2所述的利用权利要求1所述的三孢布拉霉制备番茄红素的方法，其特征在于，所述步骤二中，种子培养基包括以下质量分数的组数：淀粉4％、玉米粉5％，甘油2.5％、KH2PO40.2％、MgSO4+7H2O0.05％、维生素B10.001％和水88.249％；
其中，种子培养基的初始pH值为6.0～6.5，且在121℃灭菌20～25min。
4.如权利要求2所述的利用权利要求1所述的三孢布拉霉母制备番茄红素的方法，其特征在于，所述步骤三中，发酵培养基包括以下质量分数的组数：淀粉4％、棉籽油8.5％、黄豆粉2.2％、甘油2.5％、KH2PO40.1％、MgSO4+7H2O0.04％、维生素B10.001％、水82.659，
其中，发酵培养基的初始pH值为6.0，且在121℃灭菌20～25min。
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