CN101748114A

CN101748114A - 一种获得丁醇产生菌突变株的方法

Info

Publication number: CN101748114A
Application number: CN200810239556A
Authority: CN
Inventors: 张延平; 张天瑞; 李寅
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CN101748114B

Abstract

本发明公开了一种获得丁醇产生菌突变株的方法。该方法包括以下步骤：1)将丁醇产生菌进行化学诱变，得到突变株；2)将上述步骤1)获得的突变株之间进行原生质体融合，得到融合子；3)将上述步骤2)获得的融合子进行化学诱变，得到突变株；4)将上述步骤3)获得的突变株之间进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突变株。本发明以丙酮丁醇梭菌SMB1 CGMCC No.2287为出发菌株，采用化学诱变和原生质体融合交替进行的方法，最终得到对产物有较高耐受性的丁醇产生菌突变菌。采用本发明方法获得的丁醇产生菌突变株DGF4对丁醇的耐受性可达19g/L，丁醇的产量为10.43g/L。

Description

一种获得丁醇产生菌突变株的方法

技术领域

本发明涉及一种获得丁醇产生菌突变株的方法。

背景技术

丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，全球年需求量超过140万吨。丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当；丁醇的含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，且不会腐蚀管道，便于管道输送；丁醇的蒸汽压低，安全性高，能与汽油以任意比混合。

丁醇可用化学合成法和发酵法生产。化学合成法的主要路线包括两条，一是以丙烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛为原料，经醇醛缩合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。发酵法则是以粮食为原料，经发酵获得丙酮、丁醇、乙醇(三者质量比为3∶6∶1)，再经精馏后分别制得丙酮、丁醇和乙醇。发酵法生产丙酮丁醇曾经是仅次于乙醇发酵的全球第二大发酵工业。随着石油价格的不断上涨，使得丙酮丁醇发酵重新获得人们的重视，仅以丁醇为例，国内市场价格在2006年上半年内由1万元/吨上涨到1.8万元/吨，仍然供不应求，丁醇发酵工业已迎来复苏产业的大好时机。在过去20年中，围绕着丁醇产生菌的筛选、丁醇合成的分子遗传机制和调控、高丁醇比菌种改造、发酵原料的替换、发酵和提取工艺等方面，国内外学者开展了广泛、深入的研究，为大规模实现丁醇生物制备奠定了基础。

丁醇发酵中，溶剂毒性是影响溶剂产量的一个关键限制因素。在所产生的溶剂中，丁醇是毒性最大的，当其浓度达到13g/L时，发酵就基本停止。研究发现，丁醇毒性的机制与其疏水性有关，它会破坏细胞膜的磷脂成份，使膜的流动性提高，可能会导致膜的不稳定，破坏与膜相关的功能，如抑制与膜结合的ATP酶活性、降低胞内ATP水平、抑制细胞维持胞内pH的能力、破坏细胞膜的pH梯度等。丁醇毒性对细胞膜的进一步影响是抑制糖和氨基酸的吸收，从而使代谢完全停滞。由于丁醇毒性是丙酮丁醇发酵中影响溶剂产量最主要的限制性因素，目前普遍认为提高对丁醇的抗性，可能会提高溶剂的产量。

目前，多以传统诱变选育或扩增耐受丁醇相关的基因来提高产生菌对丁醇的耐受性。基因工程操作需要准确的基因信息，但与丁醇耐受相关的基因比较多，很可能是多种基因共同作用的结果，单个或少量基因的过量表达或缺失往往不能达到提高宿主菌丁醇耐受性的目的，因此突变筛选仍然是获得高丁醇耐受突变株最为有效的途径。但传统的诱变正突变率很低，筛选工作量大，改良菌种所用周期较长，并且所用的菌种在经过多次诱变后，会产生对诱变剂的“钝化”现象，导致诱变效率下降。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得丁醇产生菌突变株的方法。

本发明所提供的获得丁醇产生菌突变株的方法，包括以下步骤：

1)将丁醇产生菌进行化学诱变；

2)将上述步骤1)诱变后的丁醇产生菌之间进行原生质体融合，得到融合子；

3)将上述步骤2)获得的融合子进行化学诱变；

4)将上述步骤3)诱变后的融合子之间再进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突变株。

上述方法还包括将所述步骤4)获得的丁醇产生菌突变株再进行化学诱变，将经过诱变的丁醇产生菌之间进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突变株的步骤。

上述过程至少重复一次。

当然，上述获得丁醇产生菌突变株的方法也可以只包括步骤1)-4)的过程。

上述方法中，所述化学诱变所使用的诱变剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯和/或亚硝基胍。

所述诱变剂为硫酸二乙酯和亚硝基胍，所述硫酸二乙酯的终浓度为0.2～1％，具体可为0.5％，所述诱变时间为10～40min，具体可为15min；所述亚硝基胍的终浓度为0.1～1g/L，具体可为0.2g/L，所述诱变时间为10～50min，具体可为30min。

上述方法中，所述原生质体融合中，培养突变株的培养基的组成为：淀粉10g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、对氨基苯甲酸1mg/L、生物素2μg/L、维生素B₁1mg/L，其余为水。

上述方法中，所述丁醇产生菌可为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)及糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutyricum)等，具体可为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB 1CGMCC No.2287。可将不同的丁醇产生菌之间进行原生质体融合，如将丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)之间进行原生质体融合；也可以将不同的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)进行原生质体融合。

采用上述方法获得的丁醇产生菌突变株也属于本发明的保护范围。

上述丁醇产生菌突变株DGF4，经16s rDNA基因序列分析及生理生化特征分析，鉴定为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DGF4已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC № 2279。

本发明的另一个目的是提供一种制备丁醇的方法。

本发明所提供的制备丁醇的方法，是培养按照上述方法获得的丁醇产生菌突变株，得到丁醇。

本发明的第三个目的是提供一种原生质体融合用培养基。

本发明所提供的原生质体融合用培养基，其组成为：淀粉10g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、对氨基苯甲酸1mg/L、生物素2μg/L、维生素B₁1mg/L，其余为水。

本发明以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)为出发菌株，用诱变剂进行处理，得到丁醇耐受性提高和产量提高的突变株，将获得的突变株制备成原生质体，进行原生质体融合，从融合子中筛选丁醇耐受性较高的菌株，经产物分析，得到高产融合子；再将所得的融合子进行诱变，将获得的突变株进行原生质体融合，循环进行以上步骤，最终得到对产物有较高耐受性的丁醇产生菌突变菌。采用上述方法获得的丁醇产生菌突变株DGF4对丁醇的耐受性可达19g/L，发酵液中丁醇的产量可达10.43g/L。

本发明方法结合了传统诱变育种和基因组重排技术的优点，无需了解微生物的代谢途径、生物合成酶编码基因或与菌株生理性状相关的分子基础，通过表型的变化就可对突变株进行多轮次递进式突变筛选，保留了对产物产生有利的基因并使之得到提高，可以有效提高正向突变株的筛选效率，缩短突变和菌种筛选的时间和周期。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中的化学诱变及原生质体融合的操作均在严格厌氧的条件下进行。

实施例1、丁醇产生菌突变株的获得

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB1(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.2287。(中国专利，申请号200810102673.2)。

实验中所涉及的培养基和试剂的组成如下：

RCM培养基的组成：葡萄糖5.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、淀粉10.0g/L、氯化钠5.0g/L、醋酸钠3.0g/L，其余为水。pH 6.8。115℃条件下灭菌20分钟。

7.5％质量百分含量玉米醪培养基的组成：7.5g玉米粉加100mL水，加热糊化，分装。115℃条件下灭菌20分钟。

CBM培养基的组成：葡萄糖10g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、对氨基苯甲酸1mg/L、生物素2μg/L、维生素B₁ 1mg/L，其余为水。pH 6.9。115℃条件下灭菌20分钟。

改良的CBM培养基：CBM培养基中，以淀粉代替葡萄糖。115℃条件下灭菌20分钟。

再生培养基：在CBM培养基中添加蔗糖和琼脂，使其在培养基中的终浓度分别为171g/L和2％。115℃条件下灭菌20分钟。

pH7.0的磷酸盐缓冲液：将5.29g KH₂PO₄和13.94g K₂HPO₄.3H₂O溶于1L水中，pH 7.0。115℃条件下灭菌20分钟。

pH 6.0的磷酸盐缓冲液：将8.00g KH₂PO₄和2.00g K₂HPO₄.3H₂O溶于1L水中，pH 6.0。115℃条件下灭菌20分钟。

亚硝基胍溶液：用甲酰胺溶解亚硝基胍，然后加入pH6.0的磷酸缓冲溶液使其完全溶解，得到终浓度为2g/L的亚硝基胍溶液。

高渗缓冲溶液：在CBM培养基中添加蔗糖和还原型谷胱甘肽(购自Sigma公司)，使蔗糖在培养基中的终浓度为171g/L，使还原型谷胱甘肽在培养基中的终浓度为5mmol/L。过滤除菌获得。

PEG溶液：将40g聚乙二醇(PEG-6000)溶于100mL上述高渗缓冲溶液中得到。115℃条件下灭菌20分钟。

生理盐水：在300ml 0.75％质量百分含量的氯化钠溶液中加入0.46g还原型谷胱甘肽，使还原型谷胱甘肽在培养基中的终浓度为5mmol/L。过滤除菌获得。

具体方法如下：

1、化学诱变

丙酮丁醇梭菌为严格厌氧菌，氧气对其有毒害作用，所有的操作均在无氧条件下进行，并用含有还原型谷胱甘肽(终浓度为5mmol/L)的高渗缓冲溶液和生理盐水来洗涤菌体，以提高菌体的存活率。

将丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB1(对丁醇的耐受浓度为12g/L)接种于RCM培养基中，36～38℃厌氧培养36～48h，此时菌体生长至对数中后期；取培养液离心，将菌体沉淀用生理盐水离心洗涤两次，最后一次取沉淀加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，再加入硫酸二乙酯(购于Sigma公司)，使其在混合液中的终浓度为0.5％，诱变15min；加入质量百分含量为25％的硫代硫酸钠溶液终止反应。将反应液离心，用生理盐水洗涤两次，去除剩余的诱变剂，将诱变后的菌体接入RCM培养基中37℃培养24～36h，然后将菌体分别涂布于含有丁醇终浓度为13～20g/L的RCM固体培养基上，36～38℃厌氧培养48～72h；挑选单菌落，接入到7.5％质量百分含量玉米醪培养基中，36～38℃培养72h，待醪盖形成后测定丁醇的产量，选择培养基中丁醇浓度和产物中丁醇产量都较高的突变株进行原生质体融合。

2、原生质体融合

实验中发现，以淀粉为唯一碳源培养菌体时更有利于形成原生质体，因此选用改良的CBM进行菌体的培养，用于制备原生质体。

将上述步骤1筛选到的突变株接种至改良的CBM培养基中，36～38℃厌氧培养12～24h，此时菌体处于对数生长中期；取培养液离心，将菌体沉淀用高渗缓冲液洗涤两次，最后一次取沉淀悬浮于高渗缓冲溶液中，加入溶菌酶作用0.5～1h，使溶菌酶的终浓度为1.0mg/mL；待95％以上的细胞形成原生质体后，低速(3000rmp/min)离心，将菌体沉淀用高渗缓冲液洗涤两次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高渗缓冲液稀释，吸取稀释液涂布于再生培养基上，36～38℃厌氧培养36～72h，挑取单菌落接入到7.5％质量百分含量玉米醪培养基中，同时分别点接到含有丁醇终浓度为13～20g/L的RCM固体培养基中，待醪盖形成后测定丁醇的产量，选择培养基中丁醇浓度和产物中丁醇产量都较高的融合子继续进行化学诱变。

3、化学诱变

将上述步骤2获得的融合子接种于RCM培养基中，36～38℃厌氧培养36～48h，此时菌体生长至对数中后期；取培养液离心，将菌体沉淀用生理盐水离心洗涤两次，最后一次取沉淀加入pH 6.0的磷酸缓冲溶液，再加入亚硝基胍(购于Sigma公司)，使其在混合液中的终浓度为0.2g/L，诱变30min，将反应液离心用生理盐水洗涤数次，去除剩余的诱变剂，将诱变后的菌体接入RCM培养基中37℃培养24～36h，将菌体分别涂布于含有丁醇终浓度为13～20g/L的RCM固体培养基上，36～38℃厌氧培养48～72h；挑选单菌落，接入到7.5％质量百分含量玉米醪培养基中，36～38℃培养72h，待醪盖形成后测定丁醇的产量，选择培养基中丁醇浓度和产物中丁醇产量都较高的突变株进行原生质体融合。

4、原生质体融合

将上述步骤3筛选到的突变株接种至改良的CBM培养基中，36～38℃厌氧培养12～24h，此时菌体处于对数生长中期；取培养液离心，将菌体沉淀用高渗缓冲液洗涤两次，最后一次取沉淀悬浮于高渗缓冲溶液中，加入溶菌酶作用0.5～1h，使溶菌酶的终浓度为1.0mg/mL；待95％以上的细胞形成原生质体后，低速(3000rmp/min)离心，将菌体沉淀用高渗缓冲液洗涤两次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高渗缓冲液稀释，吸取稀释液涂布于再生培养基上，36～38℃厌氧培养36～72h，挑取单菌落接入到7.5％质量百分含量玉米醪培养基中，同时分别点接到含有丁醇终浓度为13～20g/L的RCM固体培养基中，待醪盖形成后测定丁醇的产量，得到丁醇产生菌突变株。

实施例2、丁醇产生菌突变株的获得

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB1(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.2287。中国专利，申请号：200810102673.2)。

实验中所涉及的培养基和试剂的组成同实施例1。

1、化学诱变

与实施例1步骤1不同的是，使用的硫酸二乙酯在混合液中的终浓度为0.2％，诱变时间为40min。

2、原生质体融合

同实施例1步骤2。

3、化学诱变

与实施例1步骤3不同的是，加入亚硝基胍，使其在混合液中的终浓度为0.1g/L，诱变时间为50min。

4、原生质体融合

同实施例1步骤4。

实施例3、丁醇产生菌突变株的获得

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB1(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.2287。中国专利，申请号200810102673.2)。拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心)，保藏号为NCIMB 8052。

实验中所涉及的培养基和试剂的组成同实施例1。

具体方法如下：

1、化学诱变

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB1的诱变方法同实施例1步骤1。

拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052为严格厌氧菌，氧气对其有毒害作用，所有的操作均在无氧条件下进行，并用含有还原型谷胱甘肽(终浓度为5mmol/L)的高渗缓冲溶液和生理盐水来洗涤菌体，以提高菌体的存活率。

将拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052(对丁醇的耐受浓度为13g/L，接种于RCM培养基中，36～38℃厌氧培养36～48h，此时菌体生长至对数中后期；取培养液离心，将菌体沉淀用生理盐水离心洗涤两次，最后一次取沉淀加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，再加入硫酸二乙酯，使其在混合液中的终浓度为1％，诱变20min；加入质量百分含量为25％的硫代硫酸钠溶液终止反应。将反应液离心，用生理盐水洗涤两次，去除剩余的诱变剂，将诱变后的菌体接入RCM培养基中37℃培养24～36h，将菌体分别涂布于含有丁醇终浓度为14～20g/L的RCM固体培养基上，36～38℃厌氧培养48～72h；挑选单菌落，接入到7.5％质量百分含量玉米醪培养基中，36～38℃培养72h，待醪盖形成后测定丁醇的产量，选择培养基中丁醇浓度和产物中丁醇产量都较高的突变株进行原生质体融合。

2、原生质体融合

将上述步骤1筛选到的丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的突变株分别接种至改良的CBM培养基中，36～38℃厌氧培养12～24h，此时菌体处于对数生长中期；分别取培养液离心，将菌体沉淀用高渗缓冲液洗涤两次，最后一次取沉淀悬浮于高渗缓冲溶液中，加入溶菌酶作用0.5～1h，使溶菌酶的终浓度为1.0mg/mL；待95％以上的细胞形成原生质体后，低速(3000rmp/min)离心，将菌体沉淀用高渗缓冲液洗涤两次，取沉淀等量混合加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高渗缓冲液稀释，吸取稀释液涂布于再生培养基上，36～38℃厌氧培养36～72h，分别挑取丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌突变株的单菌落接入到7.5％质量百分含量玉米醪培养基中，同时分别点接到含有丁醇终浓度为14～20g/L的RCM固体培养基中，待醪盖形成后测定丁醇的产量，选择培养基中丁醇浓度和产物中丁醇产量都较高的融合子继续进行化学诱变。

3、化学诱变

将上述步骤2获得的融合子接种于RCM培养基中，36～38℃厌氧培养36～48h，此时菌体生长至对数中后期；取培养液离心，将菌体沉淀用生理盐水离心洗涤两次，最后一次取沉淀加入pH 6.0的磷酸缓冲溶液，再加入亚硝基胍(购于Sigma公司)，使其在混合液中的终浓度为0.2g/L，诱变30min，将反应液离心用生理盐水洗涤数次，去除剩余的诱变剂，将诱变后的菌体接入RCM培养基中37℃培养24～36h，将菌体分别涂布于含有丁醇终浓度为14～20g/L的RCM固体培养基上，36～38℃厌氧培养48～72h；挑选单菌落，接入到7.5％质量百分含量玉米醪培养基中，36～38℃培养72h，待醪盖形成后测定丁醇的产量，选择培养基中丁醇浓度和产物中丁醇产量都较高的突变株进行原生质体融合。

4、原生质体融合

将上述步骤3筛选到的突变株接种至改良的CBM培养基中，36～38℃厌氧培养12～24h，此时菌体处于对数生长中期；取培养液离心，将菌体沉淀用高渗缓冲液洗涤两次，最后一次取沉淀悬浮于高渗缓冲溶液中，加入溶菌酶作用0.5～1h，使溶菌酶的终浓度为1.0mg/mL；待95％以上的细胞形成原生质体后，低速(3000rmp/min)离心，将菌体沉淀用高渗缓冲液洗涤两次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高渗缓冲液稀释，吸取稀释液涂布于再生培养基上，36～38℃厌氧培养36～72h，挑取单菌落接入到7.5％质量百分含量玉米醪培养基中，同时分别点接到含有丁醇终浓度为14～20g/L的RCM固体培养基中，待醪盖形成后测定丁醇的产量，得到丁醇产生菌突变株。

实施例4、丁醇产生菌突变株对丁醇的耐受程度及丁醇的产量

采用上述方法共获得15株丁醇产生菌突变株。将上述获得的丁醇产生菌突变株中的8株接种于含有表1所示丁醇终浓度的RCM培养基中，36～38℃培养48～120h，检测突变株对丁醇的耐受性，结果这8株菌在表1所示丁醇终浓度的RCM培养基中生长良好；然后将上述8株菌以5％的接种量接种于上述7.5％的玉米醪培养基中，36～38℃培养72～96h，测定丁醇的产量。丁醇产量用高效液相法测定，条件为HPX-87H，柱温15℃，检测器为示差检测器，流动相为0.05mmol/L H₂SO₄，流速为0.5ml/L。以上实验设三次重复，采用上述方法获得的丁醇产生菌突变株对丁醇的耐受情况及丁醇产量的平均结果如表1所示。

表1 部分突变株对丁醇的耐受情况及丁醇产量

从表1中可以看出，菌株DGF4对丁醇的耐受程度和丁醇的产量最高，可耐受19g/L的丁醇，培养该丁醇产生菌突变株，丁醇的平均产量为10.43g/L。

丁醇产生菌突变株DGF4，经16s rRNA基因序列分析(丁醇产生菌突变株DGF4的16s rDNA序列如序列表中序列1所示)及生理生化特征分析，鉴定为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)DGF4已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC № 2799。

序列表

<160>1

<210>1

<211>952

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>1

ctgattcgcg attactagca actccggctt catgtaggcg agtttcagcc tacaatccga 60

actgggatgg ggttttgagt tttgctccac cttgcggtat tgcatctttt tgtccccacc 120

attgtagcac gtgtgtagcc ctagacataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc 180

ttcctcccgg ttaacccggg cagtctcact agagtgctca actaaatgtt agcaactaat 240

gataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 300

accatgcacc acctgtcatc ctgtccccga agggacttca tccattacgg actaattcag 360

gagatgtcaa gtctaggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccgct 420

gcttgtgcgg gtccccgtca attcctttga gttttaatct tgcgaccgta cttcccaggc 480

ggaatactta ttgtgttaac tgcggcacag aaggagtcga tacctcctac acctagtatt 540

catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcatg 600

cctcagcgtc agttacagtc cagaaggccg ccttcgccac tggtattctt cctaatctct 660

acgcatttca ccgctacact aggaattctg ccttcctctc ctgcactcca gacatccagt 720

ttgaaatgca gcccccaagt taagcccggg gatttcacat ctcacttaaa tatccgccta 780

cacatccttt acgcccagta aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg 840

ctggcacgta gttagccgtg gcttcctcct atggtaccgt cattatcgtc ccataagaca 900

gagttttacg atccgaagac cttcatcact cacgcggcgt tgctgcatca gg 952

Claims

1.一种获得丁醇产生菌突变株的方法，包括以下步骤：

1)将丁醇产生菌进行化学诱变，得到突变株；

2)将上述步骤1)获得的突变株之间进行原生质体融合，得到融合子；

3)将上述步骤2)获得的融合子进行化学诱变，得到突变株；

4)将上述步骤3)获得的突变株之间进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突变株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述步骤4)获得的丁醇产生菌突变株进行化学诱变，将经过诱变的丁醇产生菌进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突变株的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述权利要求2的过程至少重复一次。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述化学诱变所使用的诱变剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯和/或亚硝基胍。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述诱变剂为硫酸二乙酯和亚硝基胍，所述硫酸二乙酯的终浓度为0.2-1％，优选为0.5％，所述诱变时间为10-40min，优选为15min；所述亚硝基胍的终浓度为0.1-1g/L，优选为0.2g/L，所述诱变时间为10-50min，优选为30min。

6.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述原生质体融合中，培养突变株的培养基的组成为：淀粉10g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、对氨基苯甲酸1mg/L、生物素2μg/L、维生素B₁1mg/L，其余为水。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述丁醇产生菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)及糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutyricum)，优选为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB 1CGMCC No.2287。

8.一种制备丁醇的方法，是培养按照权利要求1-7中任一所述的方法得到的丁醇产生菌突变株，得到丁醇。

9.丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)DGF4，其保藏号为CGMCC№2799。

10.一种原生质体融合用培养基，其组成为：淀粉10g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、对氨基苯甲酸1mg/L、生物素2μg/L、维生素B₁1mg/L，其余为水。