CN101712939B

CN101712939B - 一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌

Info

Publication number: CN101712939B
Application number: CN2009101145384A
Authority: CN
Inventors: 左文朴; 裴建新; 庞浩; 黄日波; 黄志民; 黎贞崇
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2009-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2029-11-11
Also published as: CN101712939A

Abstract

一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌。该菌株为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)BTPZ 14-14，菌种保藏号为CCTCC No.M209207。本发明通过对自然环境中耐受丁醇微生物的筛选，获得了一株能够耐受丁醇达到30g/L的菌株，该菌株为兼性厌氧菌，能够利用多种碳源，如木糖、葡萄糖以及蔗糖等。

Description

一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌

技术领域

本发明涉及属于生物工程技术领域。特别是一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae BTPZ 14-14。

背景技术

生物丁醇是具有巨大应用价值的新一代生物能源。随着石油资源的减少，开发新一代的燃料，使燃料结构多元化，减少对石油资源的依赖，已成为各国的共识。从各种可再生的生物质中制备液体燃料，如乙醇、丁醇等，是一个可行的替代石油的新能源方案。

丁醇具有高能量密度、低亲水性、高辛烷值以及不易挥发等特点。和乙醇相比，丁醇可以直接加注到汽车引擎中使用，不需对汽车进行改装，不会引起引擎的水锈，不降低汽车的动力性。而且丁醇可以使用目前的各种石油储存和运输系统。这些特点决定了它是适宜的替代石油的新一代能源。

丁醇的生产有两种方法，一种是利用化学方法从石油中生成，另一种方法是利用微生物发酵的方法生产。丙酮丁醇梭菌是目前国内普遍使用的丁醇发酵微生物。但是，丁醇是一种对微生物有毒害作用的发酵产物。当丁醇量积累到一定程度，发酵宿主生理代谢停止，发酵无法进行。丙酮丁醇梭菌发酵过程中，丁醇的发酵终浓度一般只能维持在1.2-1.4％之间。发酵产物中过低的丁醇浓度导致丁醇生产需要大体积的发酵过程以及需要繁杂和耗能的后提取工艺。这两个因素造成丁醇发酵法生产的成本居高不下(Sang Y.L，et al.BiotechnolBioeng，2008，101(2)：209-228)。

解决这个问题的一个方法是对丙酮丁醇梭菌进行突变，如使用连续富集的方法选育突变菌株以提高耐受丁醇的能力。通过这些方法，选育到对丁醇的耐受度提高到15g/L的丙酮丁醇梭菌。但是由于丙酮丁醇梭菌在丁醇发酵中具有一个从产酸过程到产溶剂过程的过渡，许多复合因子对该细胞代谢过程进行着复杂的调节和控制，通过改造的方法提高丙酮丁醇梭菌的丁醇耐受能力的余地很小(Baer S.H.，et al.Appl Environ Microbiol，1987，53(12)：2854-2861；Scotcher M.C.，et al.Appl Environ Microbiol，2005，71(4)：1987-1995；Thormann K.，et al.J Bacteriol，2002，184(7)：1966-1973；Dürre P.ApplEnviron Microbiol，1998，49(6)：639-648)。

另一个可行的途径是在能够耐受高浓度丁醇的宿主菌中建立一整套产丁醇的途径。目前已有利用大肠杆菌作为宿主菌，构建一套全新的代谢途径进行丁醇生产的报告(Atsumi S.，et al.Metab Eng，2008，10(6)：305-311；Atsumi S.，et al.Nature.2008，451(7174)：86-9)。但是由于大肠杆菌本身对丁醇的耐受性并不高，大肠杆菌属中的Escherichia coli K12最高能够耐受丁醇浓度为8g/L，因而并不适合用于工业大规模生产丁醇。其它微生物对丁醇的耐受能力更高，如酵母菌属中的Saccharomyces cerevisiae最高能够耐受丁醇浓度为16g/L，乳酸菌属的Lactobacillus brevis最高能够耐受丁醇浓度为24g/L。因而，寻找一个能够耐受高浓度丁醇的微生物作为丁醇重组生产的宿主是非常重要的(Knoshaug E.，et al.Appl Biochem Biotechnol，2009，153(1-3)：13-20)。

发明内容

本发明的目的是提供一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌，该菌株是从自然环境中分离筛选出来，为丁醇的生产提供一种发酵宿主，以克服目前生产丁醇菌株不能耐受高浓度丁醇的局限。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：

申请人从位于广西壮族自治区南宁市市郊的堆肥中分离得到一株能够耐受高浓度丁醇的BTPZ 14-14菌株；经形态观察、生理生化和16S rDNA鉴定，BTPZ14-14菌株在分类学上属于粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，申请人于2009年9月21日将该菌株保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO：M 209207。

BTPZ 14-14菌株为兼性厌氧菌，能够在温度20℃～50℃、pH值为3.0～10.0的环境中存活，适宜生长温度为30℃～45℃，pH值为5.0～8.0。

BTPZ 14-14菌株16S rDNA序列具有序列表1所示的核酸序列，与粘膜乳杆菌同源性在99％以上。

本发明所述的微生物菌株，其特征是16S rDNA片段1517bp。

本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

从自然界中成功分离筛选出了一种能耐受高浓度丁醇的新菌株，耐受度达到30g/L丁醇，拓宽了利用微生物制备丁醇的宿主的选择种类，有利于推进现有生物法制备丁醇过程中菌株无法耐受高浓度丁醇的技术变革，同时为研究丁醇的耐受机制提供了良好的材料。

附图说明

图1为本发明所述一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌的丁醇耐受生长曲线图。

图1所示为在16个小时的生长进程中，培养基添加不同浓度的丁醇量对粘膜乳杆菌BTPZ 14-14生长情况的影响。在培养基中丁醇添加量达到30g/L时，粘膜乳杆菌BTPZ 14-14仍能维持生长。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明所述技术方案作进一步说明。

实施例1

一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌菌株BTPZ 14-14的分离、筛选与鉴定。

第一步：采样

从广西壮族自治区南宁市市郊的堆肥中采集样品。

第二步：初筛

普通培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母膏4.0，葡萄糖20.0，乙酸钠5.0，吐温801.0，柠檬酸氢二铵2.0，磷酸氢二钾2.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，MnSO₄·H₂O 0.05，pH 6.2。

筛选培养基I：在普通培养基中添加20g/L的正丁醇。

筛选培养基II：在普通培养基中添加25g/L的正丁醇，20g/L的琼脂。

筛选培养基III：在普通培养基中添加25g/L～30g/L的正丁醇。

将采集的样品用无菌水打散后接入盛有30mL筛选培养基I的试管中，于37℃恒温培养48小时，筛选能够耐受20g/L丁醇的菌株。将能够生长的样品管中的菌液在筛选培养基II上划线，37℃培养48小时，获得单菌落。

第三步：复筛

将初筛获得的单菌落挑至普通培养基中，生长达到OD值约为1.0后转接1mL至盛有30mL筛选培养基III的试管中，37℃培养。发现有一菌株BTPZ 14-14能够在30g/L丁醇浓度的培养基中生长。经过反复传代及反复高浓度丁醇验证，该菌株确实能够最高耐受30g/L的丁醇。

第四步：鉴定

菌株的生理生化特征以及16S rDNA的鉴定委托中国典型培养物保藏中心进行。菌株的生理生化特征见表1所示。

表1 BTPZ 14-14菌株的生理生化特征

(注：表1中“+”为阳性，“-”为阴性)

序列分析：菌株BTPZ 14-14的16S rDNA序列在GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对分析鉴定菌株。序列分析结果表明，菌株BTPZ14-14与粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)同源性在99％以上。

综上，该菌株BTPZ 14-14形态学、生理生化特征符合乳杆菌属(Lactobacillus)特征，且最接近粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，且序列分析表明，菌株BTPZ 14-14与粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)同源性在99％以上。由此鉴定，菌株BTPZ 14-14属粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)。

菌株BTPZ 14-14耐受丁醇的检测

为了防止丁醇挥发，在带橡皮胶塞的三角瓶中进行菌株耐受丁醇培养和耐受曲线测定。在普通培养基上添加不同浓度的丁醇，丁醇浓度(g/L)分别为：0，10，15，20，25，28，30，32，35，取过夜培养的菌液以1％的接种量接至各个不同浓度丁醇的三角瓶中，37℃静置培养，通过测定OD₆₀₀来检测菌株的生长情况。

序列表

<110>广西科学院

<120>一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌

<160>1

<210>1

<211>1517

<212>DNA

<213>粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)

<220>

<221>RRNA

<222>(1)…(1517)

<400>

AGGGGGGGGG AGTGCTATAC ATGCAAGTCG AACGCGTTGG CCCAACTGAT TGAACGTGCT 60

TGCACGGACT TGACGTTGGT TTACCAGCGA GTGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTAGGTAA 120

CCTGCCCCAA AGCGGGGGAT AACATTTGGA AACAGATGCT AATACCGCAT AACAATTTGA 180

ATCGCATGAT TCAAATTTAA AAGATGGCTT CGGCTATCAC TTTGGGATGG ACCTGCGGCG 240

CATTAGCTTG TTGGTAGGGT AACGGCCTAC CAAGGCTGTG ATGCGTAGCC GAGTTGAGAG 300

ACTGATCGGC CACAATGGAA CTGAGACACG GTCCATACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG 360

GAATCTTCCA CAATGGGCGC AAGCCTGATG GAGCAACACC GCGTGAGTGA AGAAGGGTTT 420

CGGCTCGTAA AGCTCTGTTG TTAGAGAAGA ACGTGCGTGA GAGCAACTGT TCACGCAGTG 480

ACGGTATCTA ACCAGAAAGT CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG 540

TGGCAAGCGT TATCCGGATT TATTGGGCGT AAAGCGAGCG CAGGCGGTTT GATAAGTCTG 600

ATGTGAAAGC CTTTGGCTTA ACCAAAGAAG TGCATCGGAA ACTGTCAGAC TTGAGTGCAG 660

AAGAGGACAG TGGAACTCCA TGTGTAGCGG TGGAATGCGT AGATATATGG AAGAACACCA 720

GTGGCGAAGG CGGCTGTCTG GTCTGCAACT GACGCTGAGG CTCGAAAGCA TGGGTAGCGA 780

ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCATGCC GTAAACGATG AGTGCTAGGT GTTGGAGGGT 840

TTCCGCCCTT CAGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGCACTCC GCCTGGGGAG TACGACCGCA 900

AGGTTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT 960

TCGAAGCTAC GCGAAGAACC TTACCAGGTC TTGACATCTT GCGCCAACCC TAGAGATAGG 1020

GCGTTTCCTT CGGGAACGCA ATGACAGGTG GTGCATGGTC GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA 1080

GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTGTTA CTAGTTGCCA GCATTCAGTT 1140

GGGCACTCTA GTGAGACTGC CGGTGACAAA CCGGAGGAAG GTGGGGACGA CGTCAGATCA 1200

TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACG TGCTACAATG GACGGTACAA CGAGTCGCGA 1260

ACTCGCGAGG GCAAGCTAAT CTCTTAAAAC CGTTCTCAGT TCGGACTGCA GGCTGCAACT 1320

CGCCTGCACG AAGTCGGAAT CGCTAGTAAT CGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAATACGTT 1380

CCCGGGCCTT GTACACACCG CCCGTCACAC CATGAGAGTT TGCAACACCC AAAGTCGGTG 1420

GGGTAACCCT TCGGGGAGCT AGCCGCCTAA GGTGGGGCAG ATGATTAGGG TGAAGTCGTA 1500

ACAAGGAGCC TTGGTTC 1517

Claims

1.一株能耐受高浓度丁醇的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)BTPZl4-14，CCTCC No：M 209207，该菌株为兼性厌氧菌，能够在温度20℃～50℃、pH值为3.0～10.0的环境中存活，适宜生长温度为30℃～45℃，pH值为5.0～8.0。