CN109706089A - 一种耐受抑制物的木糖发酵菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐受抑制物的木糖发酵菌株，其命名为SEB11，其保藏编号为CGMCC No.16570；本发明还涉及一种上述木糖发酵菌株的构建方法，其包括如下步骤：选取出发菌株SEB5；将所述出发菌株进行等离子诱变处理，挑选比出发菌株生长情况好或相似的菌落；将所挑选的菌株进行平板初筛和实际糖化液复筛，获得耐受抑制物的木糖发酵菌株SEB11；本发明还涉及上述木糖发酵菌株在利用木质纤维素中的木糖生产乙醇中的应用。本发明以可利用木糖的工业菌株为出发菌株，利用常压室温等离子体诱变技术进行诱变，根据在含抑制物的平板培养基中的生长情况及实际糖化液发酵复筛，获得具有优良抑制物耐受能力的木糖发酵突变菌株SEB11，其木糖消耗速率明显提升，表现出更好的发酵结果。

Description

一种耐受抑制物的木糖发酵菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种酵母菌，尤其涉及一种耐受抑制物的木糖发酵菌株及其构建方法和应用。

背景技术

随着石油等化石资源的枯竭，以及温室效应的加剧，寻找石油资源的替代品已成为人们关注的焦点。以木质纤维素生产燃料乙醇替代化石燃料，可有效解决化石燃料带来的能源危机和环境污染。然而，在木质纤维素乙醇的转化过程中存在一些障碍，包括抑制物耐受性和木糖利用率低等。通过酸催化水解木质纤维素形成的抑制物(主要包括呋喃衍生物，弱酸和酚类化合物)会降低酿酒酵母的生长速率和发酵，从而降低了乙醇的生产量。尽管目前已有较多关于酿酒酵母对抑制物耐受能力的报道，但大多数研究以实验室酵母为出发菌株，且多针对单一抑制物，对于混合抑制物的研究较少。而这些研究主要集中于葡萄糖发酵过程，对于木糖发酵过程相关研究很有限。由于木糖是木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的一种五碳糖，且菌株利用木糖发酵时的抑制物耐受机制不同于葡萄糖发酵过程，木糖发酵过程受抑制物影响显著。

中国专利CN105985915A公开了一种基因工程菌株，其在酿酒酵母1308-P中缺失一个具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的GRE3基因，该工程菌株的构建方法为：GRE3基因敲除组件、将GRE3基因敲除组件转入酵母、敲除GRE3基因\去除抗性标记，最终得到缺失一个GRE3基因的重组菌株，该重组菌株能够提高对抑制物的耐受力，高效共发酵葡萄糖和木糖，但该酿酒酵母菌株的构建步骤复杂，其仅对抑制物糠醛的耐受能力提高，并未涉及其对于混合抑制物的耐受能力。

因此，如何提高菌株在抑制条件下高效转化葡萄糖和木糖为乙醇，成为实现木质纤维素资源化转化的关键瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，本发明以可利用木糖的工业菌株为出发菌株，利用常压室温等离子体诱变技术进行诱变，根据在含抑制物的平板培养基中的生长情况，及实际糖化液发酵复筛，获得一株具有优良抑制物耐受能力的木糖发酵突变菌株SEB11。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种耐受抑制物的木糖发酵菌株，其命名为SEB11，其分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为CGMCC No.16570，保藏日期为2018年10月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供一种上述耐受抑制物的木糖发酵菌株的构建方法，其包括如下步骤：

a)选取出发菌株，所述出发菌株为Saccharomyces cerevisiae SEB5，该菌株具有优良的发酵木糖产乙醇性能，其保藏编号为CGMCC No.11325，该出发菌株已在于2016月6月1日公开的中国专利CN105624051A“基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法”中进行了保藏；

b)将所述出发菌株进行等离子诱变处理，挑选比出发菌株生长情况好或相似的菌落；

c)将所挑选的菌株进行平板初筛和实际糖化液复筛，获得耐受抑制物的木糖发酵菌株SEB11。

为了进一步优化上述木糖发酵菌株的构建方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述步骤b)中等离子诱变处理的具体步骤包括：

将出发菌株SEB5在液体培养基进行预培养12～20h后离心收集菌体，并转接至液体培养基进行培养4～12h；

培养后的菌液经离心去清液，加入预定体积的溶液打散菌体，取预定量的菌悬液涂匀至照射玻片上，照射时间为30～90s，将照射后的玻片放入生理盐水中混匀、保存；

取预定量保存的菌悬液于固体培养基上培养24～72h，挑选出比出发菌株生长情况好或相似的菌落，以用于平板初筛和实际糖化液复筛。

进一步地，所述打散菌体的溶液为EDTA和5％甘油混合溶液。

进一步地，所述步骤c)中平板初筛和实际糖化液复筛的具体步骤包括：

将挑选的菌株的菌悬液经梯度稀释置于含有不同抑制物的固体培养基培养24～72h，挑选出生长情况较好的突变酵母菌株，将突变菌株用稻草糖化液复筛，获得耐受性能优良的突变菌株SEB11。

进一步地，所述抑制物包括乙酸、5-羟甲基糠醛、香草醛中的至少一种，所述抑制物的浓度如下：60～100mmol/L乙酸、10～20mmol/L 5-羟甲基糠醛、1～5mmol/L香草醛。

进一步地，所述液体培养基为2％YPD液体培养基，所述固体培养基为2％YPX固体培养基。

本发明的第三个目的是提供一种上述耐受抑制物的木糖发酵菌株在利用木质纤维素中的木糖生产乙醇中的应用。

进一步地，所述应用为木糖发酵菌株SEB11在利用木质纤维素中的木糖生产乙醇的方法，其包括以下步骤：

将SEB11菌种接种于固体培养基中，于培养箱中活化12～36h；挑选活化后的菌种接种于液体培养基，进行恒温培养8～24h；

将预培养后的菌液离心收集菌体，并将湿菌体接种于含有木质纤维素水解液的容器中，恒温发酵以生产乙醇。

进一步地，在上述应用中，所述恒温培养的条件为：28～32℃，120～180rpm；所述恒温发酵的条件为：30～40℃，150～250rpm；所述固体培养基为2％YPD固体培养基；所述液体培养基为5％YPD液体培养基。

进一步地，木糖发酵菌株SEB11在利用木质纤维素中的木糖生产乙醇的方法，其包括以下具体步骤：

将SEB11菌种接种于2％的YPD固体培养基上，于30℃恒温箱中活化24h；挑取一环活化后的酵母菌接种于含100mL 5％YPD液体培养基中，恒温预培养16h(30℃，160rpm)；根据木质纤维素水解液的体积，将其转移至适宜的容器中(锥形瓶、发酵罐)，根据木质纤维素水解液的体积取适宜量的SEB11菌种预培养液，离心(4℃8000rpm，2min)收集菌体，将湿菌体按预定量接种至接种至容器中进行发酵(35℃，200rpm)，以生产乙醇。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

和同类菌株相比，本发明所构建的SEB11菌种耐受抑制物的能力有明显提高，具有优越的抑制物耐受能力，木糖消耗速率明显提升，表现出更好的发酵结果。本发明选育具有优良抑制物耐受的可利用木糖的工业菌株SEB11，对实现纤维素乙醇化工业化生产具有重要意义。

附图说明

本发明公开的一种耐受抑制物的木糖发酵菌株为SEB11，其已进行保藏，其分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为CGMCC No.16570，保藏日期为2018年10月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

图1是本发明一实施例中以木糖为唯一碳源的乙酸(80mmol/L)存在条件下的木糖发酵结果图；

图2是本发明一实施例中以木糖为唯一碳源的5-HMF(15mmol/L)存在条件下的木糖发酵结果图；

图3是本发明一实施例中以木糖为唯一碳源的香草醛(3mmol/L)存在条件下的木糖发酵结果图；

图4是本发明一实施例中以木糖为唯一碳源的混合抑制物条件下的木糖发酵结果图；

图5是本发明一实施例中秸秆水解物料1的发酵结果图；

图6是本发明一实施例中秸秆水解物料2的发酵结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为耐受抑制物的木糖发酵菌株SEB11的构建方法，本实施例采用的出发菌株为Saccharomyces cerevisiae SEB5(CGMCC No.11325，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，该菌株具有优良的发酵木糖产乙醇性能。该构建方法包括如下步骤：

(1)等离子诱变处理；

挑选一环SEB5菌株至2％YPD液体培养基中，放入160rpm的30℃恒温摇床中进行预培养。预培养16h后取1mL菌液，10000rpm离心3min，收集菌体，转接至2％YPD中，放入160rpm的30℃恒温摇床中。培养8h时，出发酵母菌株SEB5处于对数生长期与稳定期之间的过渡期。此阶段的酵母菌，生长繁殖旺盛，是基因复制和重组的重要阶段，对外界环境的影响相对比较敏感，此时进行等离子体照射时，可增加基因突变与稳定遗传的几率；

取菌液1mL，经4000rpm离心3min，去清液，加入1mL EDTA和5％甘油混合溶液打散菌体。取0.01mL菌悬液涂匀至照射玻片上，照射时间为60s(酵母菌株的存活率约为10％)。照射三组平行样，将照射后的玻片放入1mL的生理盐水中混匀、保存。取0.1mL混合后的菌悬液于2％YPX固体培养基上，均匀涂布，于30℃培养箱中培养48h。挑选出200个比出发菌株生长情况好或相似的菌落；

(2)平板初筛和实际糖化液复筛；

将步骤(1)中挑选的每株酵母菌的菌悬液经梯度稀释10^-2、10^-3、10^-4，点板于含有不同抑制物(80mmol/L乙酸、15mmol/L 5-羟甲基糠醛、3mmol/L香草醛)2％YPX固体培养基中培养48h；未经诱变的菌株作为对照，对比各菌株生长情况，挑选出生长情况较好的突变酵母菌株，将突变菌株用稻草糖化液复筛，获得耐受性能优良的突变菌株SEB11。

实施例2

本实施例为乙酸(80mmol/L)存在条件下木糖为唯一碳源的发酵实验，其采用如下步骤：

将SEB11接种于2％YPD固体平板中，于30℃培养箱中活化24h。挑选一环活化后的酵母菌接种于100mL 5％YPD液体培养基中，恒温培养16h(30℃，160rpm)。将预培养后的菌液离心收集菌体，将2.5g湿菌体接种于100mL含80mmol/L乙酸的5％YPX培养基中，于恒温水浴锅中发酵(200rpm,35℃)，结果如图1所示。

图1的A部分为SEB11的发酵结果，图1的B部分为出发菌株SEB5的发酵结果。和出发菌株相比，SEB11的木糖消耗速率明显提升，发酵前24h木糖的消耗速率为1.39g/(h·L)，发酵72h时，木糖被完全消耗。发酵前24小时的基于消耗木糖的乙醇收率为0.33g/(g木糖)，发酵过程最高乙醇浓度为16.1g/L。

实施例3

本实施例为5-HMF(15mmol/L)存在条件下木糖为唯一碳源的发酵实验，其采用如下步骤：

将SEB11接种于2％YPD固体平板中，于30℃培养箱中活化24h。挑选一环活化后的酵母菌接种于100mL 5％YPD液体培养基中，恒温培养16h(30℃，160rpm)。将预培养后的菌液离心收集菌体，将2.5g湿菌体接种于100mL含15mmol/L 5-HMF的5％YPX培养基中，于恒温水浴锅中发酵(200rpm,35℃)，结果如图2所示。

图2的A部分为SEB11在此条件下的发酵结果，图2的B部分为出发菌株SEB5在此条件下的发酵结果。15mmol/L 5-HMF对SEB11没有明显的抑制作用，表现出比出发菌株更好的耐受性。SEB11发酵前12h木糖的消耗速率为3.3g/(h·L)，发酵24h时木糖几乎完全消耗，乙醇浓度为13g/L，基于消耗木糖的乙醇收率为0.28g/(g木糖)。抑制物5-HMF在发酵24h后已完全被代谢。

实施例4

本实施为香草醛(3mmol/L)存在条件下木糖为唯一碳源的发酵实验，其采用如下步骤：

将SEB11接种于2％YPD固体平板中，于30℃培养箱中活化24h。挑选一环活化后的酵母菌接种于100mL 5％YPD液体培养基中，恒温培养16h(30℃，160rpm)。将预培养后的菌液离心收集菌体，将2.5g湿菌体接种于100mL含3mmol/L香草醛的5％YPX培养基中，于恒温水浴锅中发酵(200rpm,35℃)，结果如图3所示。

图3的A部分为SEB11的发酵结果，图3的B部分为出发菌株SEB5的发酵结果。和出发菌株相比，SEB11表现出优良的香草醛耐受能力，3mmol/L香草醛未产生显著的抑制作用。发酵前24h木糖的消耗速率为2.05g/(h·L)，发酵24h时木糖完全消耗，乙醇浓度为14.01g/L，基于消耗木糖的乙醇收率为0.28g/(g木糖)。发酵过程中香草醛的浓度变化不大。

实施例5

本实施例为混合抑制物条件下木糖为唯一碳源的发酵实验，其采用如下步骤：

将SEB11接种于2％YPD固体平板中，于30℃培养箱中活化24h。挑选一环活化后的酵母菌接种于100mL 5％YPD液体培养基中，恒温培养16h(30℃，160rpm)。将预培养后的菌液离心收集菌体，将2.5g湿菌体接种于100mL含混合抑制物(40mmol/L乙酸+10mmol/L 5-HMF+1.5mmol/L香草醛)的5％YPX培养基中，于恒温水浴锅中发酵(200rpm,35℃)，结果如图4所示。

图4的A部分和B部分为SEB11的发酵结果，图4的C部分和D部分为出发菌株SEB5的发酵结果。和出发菌株相比，菌株SEB5耐受混合抑制物的能力有明显提高。发酵前24h木糖的消耗速率为1.66g/(h·L)，发酵48h后木糖被完全消耗，乙醇浓度为15.22g/L，基于消耗木糖的乙醇收率为0.34g/g木糖。发酵过程中乙酸的浓度略微升高，5-HMF在发酵24h后几乎完全消耗完，香草醛的浓度变化不大。

实施例6

本实施例为秸秆水解物料1的发酵实验，其采用如下步骤：

用于发酵的水解物料中葡萄糖、木糖及抑制物(总酚、5-HMF、乙酸)的浓度如表1所示。水解液中的抑制物主要为酚类化合物和其他未知抑制物(物料深褐色)。

表1秸秆水解液1的成分

将出发菌株及诱变菌株接种于2％的YPD固体平板上，于30℃恒温箱中活化24h。挑取一环活化后的酵母菌接种于含100mL 5％YPD液体培养基中，恒温培养16h(30℃，160rpm)。于超净台中吸取一定量的菌液，离心(8000rpm，2min)，接种1g的湿菌体于50mL水解液的300ml锥形瓶中，35℃，200rpm条件下进行发酵，结果如图5所示。

图5的A部分为SEB11的发酵结果，图5的B部分为出发菌株SEB5的发酵结果。相比出发菌株，SEB11表现出更好的发酵结果。24h时葡萄糖完全消耗，发酵前24h木糖的消耗速率为0.75g/(h·L)，48小时内消耗的木糖浓度为24.16g/L，发酵结束时乙醇浓度为53.94g/L，基于消耗总糖的乙醇收率为0.45g/(g葡萄糖+木糖)。

实施例7

本实施例为秸秆水解物料2的发酵实验，其采用如下步骤：

水解液2中葡萄糖、木糖、及抑制物(总酚、甲酸、乙酸)的浓度如表2所示。水解液中含有高浓度的有机酸(总有机酸达到约10g/L)和总酚。

表2秸秆水解液2的成分

将菌株接种于2％的YPD固体培养基上，于30℃恒温箱中活化24h。挑取一环活化后的酵母菌接种于含100mL 5％YPD液体培养基中，恒温预培养16h(30℃，160rpm)。取水解液2共600mL至1L CSTR罐中，取SEB11预培养液120mL，离心(4℃8000rmp，2min)收集菌体，接种湿重为4.0g的湿菌体至发酵罐中进行发酵，结果如图6所示。

发酵24h葡萄糖完全消耗，发酵72h木糖剩余10g/L，发酵72h乙醇浓度为42g/L，基于消耗总糖的乙醇收率为0.44g/(g葡萄糖+木糖)。SEB11菌株在抑制物含量如此之高的水解中能够将葡萄糖在24小时内消耗完，而且能发酵部分的木糖，和同类菌株相比，具有优越的抑制物耐受能力。

由上述实施例可知，本发明以可利用木糖的工业菌株为出发菌株，利用常压室温等离子体诱变技术进行诱变，根据在含抑制物的平板培养基中的生长情况，及实际糖化液发酵复筛，获得一株具有优良抑制物耐受能力的木糖发酵突变菌株SEB11，其木糖消耗速率明显提升，表现出更好的发酵结果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种耐受抑制物的木糖发酵菌株，其特征在于，所述木糖发酵菌株命名为SEB11，其保藏编号为CGMCC No.16570。

2.一种如权利要求1所述的木糖发酵菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)选取出发菌株，所述出发菌株为SEB5，其保藏编号为CGMCC No.11325；

b)将所述出发菌株进行等离子诱变处理，挑选比出发菌株生长情况好或相似的菌落；

c)将所挑选的菌株进行平板初筛和实际糖化液复筛，获得耐受抑制物的木糖发酵菌株SEB11。

3.根据权利要求2所述的木糖发酵菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤b)中等离子诱变处理的具体步骤包括：

将出发菌株SEB5在液体培养基进行预培养12～20h后离心收集菌体，并转接至液体培养基进行培养4～12h；

培养后的菌液经离心去清液，加入预定体积的溶液打散菌体，取预定量的菌悬液涂匀至照射玻片上，照射时间为30～90s，将照射后的玻片放入生理盐水中混匀、保存。

4.根据权利要求3所述的木糖发酵菌株的构建方法，其特征在于，所述打散菌体的溶液为EDTA和5％甘油混合溶液。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的木糖发酵菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤c)中平板初筛和实际糖化液复筛的具体步骤包括：

将挑选的菌株的菌悬液经梯度稀释置于含有不同抑制物的固体培养基培养24～72h，挑选出生长情况较好的突变酵母菌株，将突变菌株用稻草糖化液复筛，获得耐受性能优良的突变菌株SEB11。

6.根据权利要求5所述的木糖发酵菌株的构建方法，其特征在于，所述抑制物包括乙酸、5-羟甲基糠醛、香草醛中的至少一种，所述抑制物的浓度如下：60～100mmol/L乙酸、10～20mmol/L 5-羟甲基糠醛、1～5mmol/L香草醛。

7.根据权利要求5所述的木糖发酵菌株的构建方法，其特征在于，所述液体培养基为2％YPD液体培养基，所述固体培养基为2％YPX固体培养基。

8.一种如权利要求1所述的木糖发酵菌株在利用木质纤维素中的木糖生产乙醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为木糖发酵菌株SEB11在利用木质纤维素中的木糖生产乙醇的方法，其包括以下步骤：

将SEB11菌种接种于固体培养基中，于培养箱中活化12～36h；挑选活化后的菌种接种于液体培养基，进行恒温培养8～24h；

将预培养后的菌液离心收集菌体，并将湿菌体接种于含有木质纤维素水解液的容器中，恒温发酵以生产乙醇。

10.根据权利要求9所述的的应用，其特征在于，所述恒温培养的条件为：28～32℃，120～180rpm；所述恒温发酵的条件为：30～40℃，150～250rpm；所述固体培养基为2％YPD固体培养基；所述液体培养基为5％YPD液体培养基。