WO2018046821A1 - Utilisation de qtl pour conférer a des souches de levure une résistance a l'acide acétique - Google Patents

Utilisation de qtl pour conférer a des souches de levure une résistance a l'acide acétique Download PDF

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WO2018046821A1
WO2018046821A1 PCT/FR2017/052317 FR2017052317W WO2018046821A1 WO 2018046821 A1 WO2018046821 A1 WO 2018046821A1 FR 2017052317 W FR2017052317 W FR 2017052317W WO 2018046821 A1 WO2018046821 A1 WO 2018046821A1
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WO
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strain
advantageously
chromosome
listed
mutation
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Application number
PCT/FR2017/052317
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English (en)
Inventor
Georges Pignede
Thomas Desfougeres
Original Assignee
Lesaffre Et Compagnie
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the identification and use of QTL (Quantitative Trait Loci) in order to confer resistance to an organic acid, advantageously acetic acid, to a yeast strain, especially during its fermentation of glucose.
  • QTL Quality of Life
  • the present invention provides a method for the genotypic selection of a yeast strain resistant to an organic acid, preferably acetic acid, during the fermentation of glucose.
  • the invention makes it possible to greatly optimize the production of yeast strains resistant to an organic acid, advantageously acetic acid, based on the genotypic selection of segregants.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae also known as "baker's yeast”
  • bake's yeast remains the most used microorganism for alcoholic fermentation.
  • acetic acid is a very potent inhibitor of alcoholic fermentation by yeasts and is found in high concentration in certain fermentation media.
  • Various means have been described in an attempt to counteract the effect of fermentation inhibitors, such as for example the detoxification of the fermentation medium, or the adaptation of yeasts to fermentation inhibitors by acclimation or genetic modification.
  • the detoxification of the fermentation medium is a difficult option to implement, particularly at the industrial level. It is therefore necessary to try to modify the yeasts themselves.
  • yeast acclimation can be achieved by introducing the inhibitor into the culture medium, preferably at increasing doses.
  • adaptation of yeasts according to this method is only transient, and disappears rapidly when they are again cultured in a medium free of inhibitor.
  • the method thus proves to be interesting from an industrial point of view, where it is necessary to have phenotypically stable strains.
  • sensitivity to acetic acid only the genetic modification of yeasts is therefore possible. This can be achieved either by modification by genetic engineering, targeting specific genes, or conventionally by crossing strains of interest.
  • the molecular mechanisms related to sensitivity or to the contrary to resistance to acetic acid are poorly known, and insufficient for targeted methods of genetic engineering.
  • the method of choice for improving the resistance to acetic acid remains the yeast obtained by crossing.
  • yeast strains resistant to acetic acid these are by definition random and without guarantee of success.
  • the document WO 2013/178915 describes methods for crossing yeast strains allowing the production of yeasts capable of metabolizing xylose and resistant to acetic acid. This process consists of crossing the yeast strain deposited at the CNCM under the number 1-4538 with the yeast strain deposited at the CNCM under the number 1-4627, then to select a hybrid capable of metabolizing xylose and, independently , resistant to acetic acid during the fermentation of glucose.
  • This so-called hybridization method is based on the ability of yeasts to reproduce either asexually or sexually, depending in particular on the culture conditions.
  • S. cerevisiae yeast is an organism haplodiplobiontic reproductive cycle, that is to say an organism capable of actively multiplying both in the haploid state than in the polyploid state, for example diploid.
  • the polyploid yeasts are capable of vegetative propagation by budding giving rise to polyploid yeasts.
  • the heterozygous cells for the Mat locus enter into meiosis and form yeasts with reduced ploidy (spores or segregants) by a so-called sporulation mechanism.
  • Segregants can multiply by budding, giving yeasts with the same genome.
  • Haploid yeasts are distinguished by two opposite sex signs called MATa and MATa. Two haploid spores of the opposite sex type are capable of fertilization to give a diploid yeast.
  • the haplodiplobiontic cycle of S. cerevisiae has been widely used to cross sexually compatible segregants (MATa and MATa), particularly in the so-called random recombination method resulting from sporulation and mass hybridization.
  • MATa and MATa sexually compatible segregants
  • two diploid parent strains are used.
  • Sporulation of diploid parental strains is typically induced by cultivating them under conditions where nitrogen input is limited and only in the presence of a non-fermentable carbon source.
  • the meiosis performed during this stage leads to a genetic mixing, creating spores with a varied genotype.
  • the spores (haploids) obtained for each of the parental strains are then brought into contact, to produce diploid (hybrid) strains by fusion. This last step is called the hybridization step.
  • This method is interesting in that it allows to create a genetic mixing from which phenotypic traits of interest can emerge. However, it requires a step of selecting the hybrids on the basis of the phenotypic traits sought. By way of example, in the case of strictly diploid parental strains each having a phenotypic trait carried by 10 genes, the probability of obtaining the hybrid of interest is estimated at
  • the inventors have demonstrated various QTLs, distributed on chromosomes I, IV, V, VII, X, and XV of S. cerevisiae, associated with the phenotype of resistance to acetic acid during the fermentation of glucose.
  • the inventors have identified, within these QTL, the nucleotide polymorphisms potentially associated with this phenotype of resistance to acetic acid.
  • the inventors have determined that the presence of at least one nucleotide polymorphism of interest in S. cerevisiae yeast strains was associated with an increase in its resistance to acetic acid during the fermentation of glucose.
  • yeast strain denote within the meaning of the invention a yeast population strictly identical from the genetic point of view. This includes both so-called laboratory strains and so-called industrial strains. This term is to be distinguished from the term "yeast", a yeast being obtained by culturing a strain as defined above.
  • yeast means a commercial product obtained through the implementation of a process for producing a yeast strain. Thus, yeasts having different characteristics can be obtained from the same strain, these differences being related to the production method used.
  • a “segregant” is the product of the meiosis of a yeast strain, whatever the level of ploidy of said yeast.
  • the terms “segregating” and “spore” may be used interchangeably.
  • yeast strain capable of metabolizing glucose means within the meaning of the invention a yeast strain capable of converting glucose to ethanol, that is to say capable of fermenting glucose.
  • a yeast strain capable of metabolizing glucose within the meaning of the invention is a yeast strain which converts at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% of glucose into ethanol in 60 hours in a fermentation medium comprising 150 g of glucose per kg of fermentation medium, under usual alcoholic fermentation conditions.
  • the method used to measure the percentage of glucose converted to ethanol is as follows:
  • the yeast strain used is seeded in synthetic fermentation medium at a level of 0.25 g of dry matter yeast / kg of fermentation medium. The duration of 60 hours is calculated from the seeding of the yeast strain in the synthetic fermentation medium.
  • a synthetic fermentation medium is a medium whose exact chemical composition is known.
  • a synthetic fermentation medium comprises a carbon source, a nitrogen source, a source of phosphorus, and vitamins and minerals essential for the growth of a yeast strain.
  • the fermentation medium used to measure the percentage of glucose converted to ethanol is the medium YF as defined in the embodiments (noted YF Ac due to the presence of acetic acid).
  • the fermentation is typically conducted at a temperature between 28 and 37 ° C, or between 30 and 35 ° C, preferably 32 ° C, with moderate agitation, for example at 90 or 100 rpm.
  • the agitation is moderate so as not to be oxygenating.
  • the pH of the medium is preferably controlled, for example by the buffering capacity of an acid / base pair (such as the acetic acid / acetate pair), and acid, advantageously between 3.5 and 6, or even 4 and 5, 5, still more preferably 4.4 or 5.
  • the amount of ethanol present in the fermentation medium is measured by any appropriate means known to those skilled in the art. It can be a direct measurement of the ethanol produced or an indirect measurement via a parameter correlated to the production of ethanol, such as the production of C0 2 determined by measuring the loss of mass.
  • the production of alcohol can be measured by chromatography, in particular by HPLC (High Performance Liquid Chromatography), an enzymatic kit (for example the Boehringer ethanol assay kit), or a potassium dichromate assay.
  • the amount of glucose present in the fermentation medium is measured by any appropriate means known to those skilled in the art, preferably by chromatography, in particular by HPLC.
  • organic acid or "weak organic acid” means a carboxylic acid capable of inhibiting the fermentation of a sugar, advantageously glucose. It is advantageously acetic acid, levulinic acid or formic acid, more advantageously acetic acid. It should be noted that, in a known manner, only the non-dissociated or non-ionized form of such acids has an inhibition capacity.
  • non-ionized or non-dissociated form of a carboxylic acid its protonated form. In practice, the form of such organic acids depends on the pH of the medium in which they are incorporated.
  • the acetic acid introduced into the medium, including dissociated and undissociated forms as a function of the pH of said medium.
  • resistant to an organic acid or “resistant to acetic acid” denote a yeast strain capable of fermenting at least one sugar, in particular glucose, with a limited impact of organic / acetic acid on the curve.
  • the alcoholic fermentation curve representing the quantity of alcohol produced as a function of time generally comprises three phases: a latency phase during which there is no ethanol production, an alcohol production phase, and a plateau phase, which corresponds to the end of the fermentation.
  • acetic acid is an inhibitor of glucose fermentation, this inhibition resulting in a delay during the initiation of fermentation, the kinetics remaining thereafter unchanged.
  • yeast strains primarily ferment glucose due to catabolic repression.
  • a "strain resistant to acetic acid" advantageously has an alcoholic fermentation initiation delay of less than 30 hours, preferably less than 20 hours, more preferably less than 15 hours or even 10 hours.
  • the fermentation medium used to evaluate the resistance to acetic acid is preferably a synthetic medium, more preferably the YFAc medium as illustrated in the exemplary embodiments.
  • the composition of the YFAc medium is as follows: 150 g / kg of glucose, 5 g / kg of yeast extract, 4.7 g / kg of DAP (diammonium phosphate), 11.4 g / kg of citric acid, 4 g / kg of acetic acid, 13.5 g / kg of sodium citrate, 1 ml / kg of Tween 80, 2 ml / kg of ZnSO 4 (at 10.6 g / L), 2.5 ml / kg of MgS0 4 7H 2 0 (400 g / L) 1 ml / kg of thiamine (18.24 g / L) 1 ml / kg of pyridoxine (5.28 g / L) 1 ml / kg of biotin (1.76 g / L), 1
  • I ml / kg of para-aminobenzoate at 1.2 g / L
  • pH adjusted to 4.4 with KOH The seeding of the yeast strain used to evaluate the resistance to acetic acid is preferably 0.25 g dry matter / kg of fermentation medium.
  • the alcoholic fermentation is conducted anaerobically, preferably at 32 ° C and with moderate agitation, for example 90 rpm.
  • acetic acid has no inhibitory effect on fermentation.
  • acetic acid is added at a level of 1 to 10 g / kg of fermentation medium, for example 4 g / kg of fermentation medium.
  • nucleic acid bases or nucleotides.
  • A refers to adenosine
  • C refers to cytosine
  • G refers to guanosine
  • T refers to thymidine.
  • QTL for "Quantitative Trait Loci”
  • QTL means sequences of the genome, ranging in size from several hundred to several thousand bases (or nucleotides), whose presence is correlated with a phenotype variation. These sequences include genetic modifications, called mutations, that are responsible for the measurable variation in phenotype observed.
  • nucleotide polymorphism or "SNP” (for “Single-Nucleotide Polymorphism”), the variation (or polymorphism) of a single base pair of the genome between an individual of a species and that of the reference organism of this species, in this case yeast strains.
  • mutation (or nucleotide polymorphism) is understood to mean any alteration observed at a given position of the genome.
  • mutation includes both:
  • substitution mutation or SNP replacement of one (or more) nucleotides by another (or several others);
  • - deletion or deletion mutation loss of one or more nucleotides.
  • these positions are indicated with reference to the genome of the yeast strain S. cerevisiae S288c, the complete sequence of which is available in the databases under the reference GenBank GCA 000146045.2. (version of April 18, 2011) and whose reference NCBI is Gene ID: 852501.
  • the invention relates to the use of newly identified chromosomal regions of interest to confer resistance to an organic acid to a yeast strain.
  • Chromosomes of particular interest in the context of the present invention are the following:
  • S288c is available in the NCBI database under the reference NC 001137.2 (SEQ ID NO: 3);
  • NC 001147.5 SEQ ID NO: 6
  • positions of interest could be located.
  • a position of interest corresponds to a nucleotide polymorphism, that is to say the absence at this position (or at the corresponding position in the analyzed strain) of the nucleotide observed in the strain of reference S288c.
  • a mutation which can be a substitution, an insertion or a deletion, is observed at this position.
  • a target chromosomal region carries a mutation to all the listed positions.
  • all these regions carry a mutation at all the listed positions.
  • particular mutations of interest have been identified.
  • a targeted chromosomal region carries all the listed mutations. According to another embodiment, all these regions carry all the mutations listed.
  • the resistance conferred is a resistance to acetic acid, the presence of which in high concentrations in the lignocellulosic hydrolysates is intrinsically linked to that of acetyl groups covalently associated with the hemicellulose molecules.
  • the resistance to the organic acid of the yeast strain is reflected during the fermentation of glucose, for which the fermentation initiation delay is reduced or reduced.
  • the yeast strain targeted by the present invention belongs to the group of hemi-ascomycetes.
  • Preferred strains belong to the genus Saccharomyces, Pichia or Yarrowia, advantageously Saccharomyces.
  • Saccharomyces it is advantageously S. cerevisiae.
  • the invention relates to a method for selecting or identifying an yeast strain resistant to an organic acid comprising the demonstration of: a mutation at least at one of the positions listed in Table 2 in relation to chromosome I, in table 3 in relation to chromosome IV, in table 4 in relation to chromosome V, in table 5 in relation to chromosome VII, in table 6 in relation to chromosome X , in the Table 7 in relation to chromosome XV, advantageously at all these positions; and or
  • the organic acid is advantageously acetic acid.
  • the resistance to the organic acid of the strain thus selected is observed during its fermentation on glucose.
  • the present invention provides a method of genotypically screening for strains of interest, in this case resistant to an organic acid. This approach is much more economical, both in terms of time and money, than the phenotypic screens traditionally used.
  • this screening is based on the demonstration of a mutation at at least one of the listed positions, advantageously at all the listed positions, and / or the detection of at least one of the mutations listed, advantageously of all the mutations listed.
  • the demonstration of these mutations can be carried out by any technique available to the skilled person such as sequencing, PCR, hybridization.
  • the interest of a strain identified by this method can of course be confirmed by a phenotypic approach, consisting in evaluating the capacity of the selected strain to ferment glucose in the presence of acetic acid, for example as described herein. -above.
  • These different genotypic screening criteria can also be used for the production or production of yeast strains resistant to an organic acid, advantageously acetic acid, particularly in the context of the fermentation of glucose.
  • mutagenise directed or random
  • yeast strains it is possible to mutagenise (directed or random) on yeast strains to obtain the desired phenotype.
  • the presence of the genotypic characteristics mentioned above is a priori only necessary at the level of an allele.
  • this mutagenesis can be performed on spores (or segregants) which are subsequently hybridized with other spores, possibly from another strain with another phenotypic trait of interest.
  • the present invention relates to a process for producing or obtaining a yeast strain resistant to an organic acid, advantageously acetic acid, during the fermentation of glucose comprising:
  • the invention provides a method for producing or obtaining a strain of yeast resistant to an organic acid, based on a genotypic screening performed at the level of spores or segregants, haploids.
  • the invention provides a process for obtaining a yeast strain resistant to an organic acid, comprising:
  • said method comprising at least one segregant selection step due to the presence
  • the method of the invention comprises a stage of sporulation of parental strains.
  • This technique is well known to those skilled in the art and therefore does not need to be detailed further.
  • the sporulation step can be carried out by cultivating the parental strains under appropriate culture conditions, such as, for example, in a deficient medium.
  • the parental strains at least one of them has the phenotype of interest, in this case a resistance to an organic acid, advantageously acetic acid, within the meaning of the invention.
  • this has an alcoholic fermentation initiation delay of less than 30 h, preferably less than 20 hours, more preferably less than 15 hours or even 10 hours in the YFAc fermentation medium with a 0.25 g inoculum. yeast dry matter / kg of medium.
  • Such strains are well known to those skilled in the art. If appropriate, the skilled person can produce the parental yeast strain resistant to organic acid / acetic acid within the meaning of the invention, for example by the usual techniques using the selection pressure.
  • a parental strain of interest can also be identified using the selection method, object of the present invention.
  • S. cerevisiae it may especially be the EGAcl strain deposited at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25 rue du Dondel Roux, F-75724 Paris Cedex 15) under number 1-4839 dated March 13, 2014.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25 rue du Dondel Roux, F-75724 Paris Cedex 15
  • this phenotypic trait being possibly carried only by an allele, sporulation gives rise to spores not carrying this typical geno trait, in this case half of the spores in the case of a diploid parental strain bearing only one allele of resistance to organic acid / acetic acid.
  • the two parental strains used in the context of the process according to the invention have a phenotype of resistance to an organic acid within the meaning of the invention.
  • the two parental strains are able to ferment glucose within the meaning of the invention.
  • the second parental yeast strain advantageously that not exhibiting resistance to organic / acetic acid, has a second phenotypic trait of interest. This is for example the ability to metabolize pentoses, especially xylose present in large quantities in lignocellulosic hydrolysates.
  • yeast strains capable of fermenting glucose and which can also metabolize pentoses are available:
  • the document WO 2010/000464 reports the production of yeast strains capable of fermenting pentoses by means of a bacterial gene encoding a xylose isomerase (XI) which converts xylose into xylulose metabolizable by yeast.
  • XI xylose isomerase
  • a eukaryotic pathway comprising a xylose reductase (XR or XYL1) generating xylitol and a xylitol dehydrogenase (XDH or XYL2) also leads to xylulose.
  • WO 2012/072793 describes improved yeast strains, combining exogenous genes encoding a xylose isomerase and a xylitol dehydrogenase to remove xylitol which is found to be a xylose isomerase inhibitor.
  • Such strains in particular the strain deposited at the CNCM 5.10.2011 under the number I-4538, have improved yields and therefore a proven industrial utility for the production of ethanol.
  • the second parental strain used in the context of the process according to the invention is the strain deposited at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25 rue du Dondel Roux, F-75724 Paris Cedex 15) under number 1-4538 dated October 5th, 2011.
  • the method of the invention further comprises a step of mass hybridization of the spores or segregants obtained.
  • the hybridization is carried out by introducing the spores in question into a culture medium adapted to the hybridization step.
  • a culture medium adapted to the hybridization step.
  • YPG-type complete culture medium containing yeast extract 10 g / L, Bactopeptone 20 g / L, glucose 20 g / L and demineralized water qs 1 L.
  • the step of selecting the spores or segregants of interest is carried out as described above and relies on the demonstration of a mutation in at least one of the listed positions, advantageously at all the listed positions, and / or the setting in evidence of at least one of the mutations listed, advantageously all listed mutations.
  • sequences can be carried out by any technique known to those skilled in the art such as sequencing, PCR, hybridization.
  • Such a selection may for example be carried out on the basis of total or partial sequencing according to molecular biology techniques well known to those skilled in the art, or else by PCR techniques. Sequencing can thus be carried out by hybridization sequencing or by high throughput sequencing techniques such as pyrosequencing, synthetic sequencing or ligation sequencing. Alternatively, the selection can be carried out on the basis of PCR techniques by searching the targeted polymorphisms. It is possible in this context to cite, for example, multiplex PCR techniques, which will make it possible to search for several polymorphisms in a single test, nested PCR, which allows a high sensitivity of the result, or colony PCR which does not require extraction. of DNA.
  • a step of multiplication of the DNA may be necessary, in order to have enough biological material. It will then be possible to carry out amplification by cultivating each strain or spore in a culture medium suitable for its reproduction.
  • a yeast DNA extraction step may be necessary, which may be done according to molecular biology methods well known in the field of the invention.
  • the yeast selection step can be carried out from the parental strains, and / or from the spores derived therefrom, and / or from the strains obtained after hybridization. As already stated, however, it is particularly advantageous to proceed to the selection step from the spores arising from parental strains.
  • a method according to the invention comprises the following steps:
  • step b) selecting from the segregants from step a) those having:
  • step b) hybridizing the segregants from the first parental strain and selected in step b) with the segregants from the second parental strain, optionally selected in step b);
  • Step a) of the process corresponds to a step of preparation of segregants from two parental strains of yeast, advantageously S. cerevisiae, different, that is to say a sporulation step.
  • yeast advantageously S. cerevisiae
  • Those skilled in the art can easily obtain segregants from parental strains defined above, according to methods well known in the field of the invention.
  • this step comprises the cultivation of the first strain of parental yeast on the one hand and the second strain of parental yeast on the other hand, in a medium deficient in nitrogen or sugar.
  • the parental strains used are yeast strains belonging to the Saccharomyces group, advantageously Saccharomyces cerevisiae.
  • the first strain is chosen for its resistance to the organic acid, advantageously acetic acid, especially during fermentation on glucose. It may in particular be the EGAcl strain filed with the CNCM under the number 1-4839 dated March 13, 2014. The segregants of this strain will be primarily the object of the selection step b) of the process.
  • the second parental yeast strain is selected for another phenotypic trait of interest, for example its ability to metabolize xylose. It may, for example, act on the strain deposited with the CNCM under the number I-4538 dated October 5, 2011.
  • the second strain of parental yeast may also have an organic acid resistance capacity. , advantageously acetic acid, especially during fermentation on glucose.
  • Step b) of the process of the invention is carried out as described above and makes it possible to eliminate spores that do not have the desired phenotypic trait, in this case a resistance to an organic acid within the meaning of invention.
  • Step c) of the process of the invention is a step of hybridization of segregants from a first strain of parental yeast with segregants from a second parental strain, at least one of the segregant populations having been previously selected in step b), advantageously that resulting from the first strain of parental yeast.
  • step c) mass hybridization is carried out.
  • step c) preferably corresponds to a step of hybridization of all the spores from step b).
  • Step d) of the optional method consists in selecting from the hybrids resulting from step c) those capable of alcoholic fermentation and having a phenotype of resistance to the organic acid, advantageously acetic acid.
  • this step is easily achieved by traditional methods of selection, implementing usual culture techniques.
  • This step is advantageously carried out on a medium comprising glucose.
  • FIG. 1 represents the flow chart used to determine the proportion of E.coli (1-4839) alleles in yeast populations fermented in the presence of acetic acid (popB) or in yeast populations having fermented without acetic acid ( POPC).
  • S288c strain of S. cerevisiae whose genome serves as reference (GenBank GCA 000146045.2., Version of April 18, 2011; NCBI Gene ID: 852501)
  • EGAcl strain deposited with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15) dated March 13, 2014 under the number 1-4839
  • FIG. 2 represents the averages of the frequencies of the alleles of the E. coli strain (I-
  • the objective is to produce a genetically diverse yeast population (a), not only to select strains resistant to weak organic acids but also to be able to analyze the genetic traits involved in this phenotype. (b). at. Production of a yeast population comprising strains resistant to weak organic acids:
  • the yeast population was obtained by random recombination from sporulation and bulk hybridization. This strategy is inspired by the work of Léo Parts et al. (2011, Genome Res, 21 (7): 1131-8). Briefly, a segregant (also called a spore) of a strain resistant to acetic acid (EGA1 / I-4839 strain) is crossed with another segregant, from strain 1-4538, thus creating a first hybrid (EGAc2 strain). / I-
  • the genome of the strain EGAc2 (1-4840) was randomly recombined to obtain a yeast population very diverse from a genetic point of view.
  • the hybrid EGAc2 (1-4840) was sporulated and the spores obtained were left free to rehybridize with each other, as described in WO2013 / 178915.
  • the cycle was repeated 4 times, generating a reduction of 24 in the genetic distance in centiMorgan (cM).
  • strains resistant to weak organic acids were selected following the principles of population genetics, in particular the principle of Hardy and Weinberg which states that in an isolated population of unlimited strength, no subject to selection, and in which there are no mutations, the allele frequencies and the genotype frequencies remain stable from generation to generation.
  • the strain EGA1c (1-4839) being resistant to acetic acid, it is expected that the genetic traits associated with this resistance are present in this strain. Therefore, in order to limit the number of alleles to be analyzed, we first identify the alleles specific to the strain EGAc1 (1-4839) that are present in the strain EGAc2 (1-4840), as well as in the populations C and B. In a second step, it is possible to determine the frequency of appearance of each of these alleles in stressed (B) and non-stressed (C) populations.
  • FIG. 2 shows the evolution of the frequency of alleles derived from the EGAcl strain (I-4839) and present in populations B and C, along the chromosome I (Fig. 2A), IV (Fig. 2B) , V (Fig. 2C), VII (Fig. 2D), X (Fig. 2E) and XV (Fig. 2F).
  • results presented in FIG. 2 show, on each of these chromosomes, regions (dotted blocks) in which a dissociation of the curves corresponding to the frequencies of the alleles derived from the EGAc (1-4839) in the two types of populations is observed. These results show that there is one allele that is more represented in populations under selection pressure than in those that fermented without this pressure. This overrepresentation suggests that the allele derived from EGAc1 (1-4839) would promote the multiplication of cells in the presence of acetic acid.
  • these regions of chromosomes I, IV, V, VII, X, and XV are identified as quantifiable genetic traits (also known as QTLs), that is, genetic regions involved in resistance to acetic acid. More precisely, these regions could be located on the chromosomes of the reference strain S288c, as indicated in Table 1 below:
  • Table 1 Position of regions of interest on the chromosomes of strain S288c d. Analysis of the genetic traits involved in the low organic acid resistance phenotype
  • SNPs single-nucleotide polymorphisms
  • Table 3 List of nucleotide polymorphisms observed at chromosome IV 468189 TC
  • Table 5 List of nucleotide polymorphisms observed at chromosome VII

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Abstract

La présente invention concerne l'identification et l'utilisation de QTL pour conférer une résistance à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, à une souche de levure lors de la fermentation du glucose.

Description

UTILISATION DE QTL POUR CONFERER A DES SOUCHES DE LEVURE
UNE RESISTANCE A L'ACIDE ACETIQUE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'identification et l'utilisation de QTL (« Quantitative Trait Loci » ou en français « loci de caractères quantitatifs ») pour conférer une résistance à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, à une souche de levure, notamment lors de sa fermentation du glucose.
Ainsi, la présente invention offre un procédé permettant la sélection génotypique d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose. De même, l'invention permet d'optimiser grandement l'obtention de souches de levure résistantes à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, basée sur la sélection génotypique des ségrégeants.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La capacité des levures génétiquement modifiées à fermenter divers substrats en fait un outil de choix dans divers procédés industriels, en particulier dans la production d'éthanol à partir de la biomasse lignocellulosique. La fermentation alcoolique est le processus opéré par les levures en milieu anaérobie au cours duquel des sucres sont transformés en alcool. La levure Saccharomyces cerevisiae, aussi connue sous le nom « levure du boulanger », reste le microorganisme le plus utilisé pour la fermentation alcoolique.
Cependant, certains inhibiteurs de la fermentation se retrouvent naturellement dans ces substrats et impactent négativement la production d'éthanol. C'est notamment le cas des acides organiques faibles, en particulier de l'acide acétique, un produit de la dégradation de l'hémicellulose. Lorsque les levures sont confrontées à la présence d'acide organique dans leur environnement, elles bloquent leur cycle cellulaire afin de pouvoir se préparer à réagir à ce nouveau stress abiotique. Ce n'est qu'une fois la machinerie cellulaire de résistance mise en place que la fermentation est initiée. La présence d'acide organique faible a ainsi pour conséquence de retarder l'initiation de la fermentation sur glucose, augmentant de ce fait les coûts de production.
La problématique liée à l'acide acétique est d'autant plus cruciale que celui-ci est un inhibiteur très puissant de la fermentation alcoolique par les levures et qu'il se retrouve en concentration importante dans certains milieux de fermentation. Différents moyens ont été décrits pour tenter de contrer l'effet des inhibiteurs de la fermentation, comme par exemple la détoxifïcation du milieu de fermentation, ou l'adaptation des levures aux inhibiteurs de la fermentation par acclimatation ou par modification génétique. Dans le cas de l'acide acétique, la détoxifïcation du milieu de fermentation est une option difficile à mettre en œuvre, en particulier au niveau industriel. Il est donc nécessaire de tenter de modifier les levures elles-mêmes.
Dans ce contexte, l'acclimatation des levures peut être réalisée en introduisant l'inhibiteur dans le milieu de culture, de préférence à des doses croissantes. Toutefois, il a été observé que l'adaptation des levures selon cette méthode n'est que transitoire, et disparaît rapidement lorsque celles-ci sont à nouveau cultivées dans un milieu dépourvu d'inhibiteur. La méthode s'avère donc peut intéressante d'un point de vue industriel, où il est nécessaire de disposer de souches phénotypiquement stables. Dans le cas de la sensibilité à l'acide acétique, seule la modification génétique des levures est donc envisageable. Ceci peut être réalisé soit par modification par génie génétique, en ciblant des gènes spécifiques, soit de manière classique en croisant des souches d'intérêt. A l'heure actuelle, les mécanismes moléculaires liés à la sensibilité ou au contraire à la résistance à l'acide acétique sont mal connus, et insuffisants pour des méthodes ciblées de génie génétique.
Ainsi, la méthode de choix pour améliorer la résistance à l'acide acétique reste l'obtention de levures par croisement. Toutefois, même si certains procédés ont permis l'obtention de souches de levure résistantes à l'acide acétique, ceux-ci sont par définition aléatoires et sans garantie de succès.
Le document WO 2013/178915 décrit des procédés de croisement de souches de levures permettant la production de levures aptes à métaboliser le xylose et résistantes à l'acide acétique. Ce procédé consiste à croiser la souche de levure déposée à la CNCM sous le numéro 1-4538 avec la souche de levure déposée à la CNCM sous le numéro 1-4627, puis à sélectionner un hybride apte à métaboliser le xylose et, de manière indépendante, résistant à l'acide acétique lors de la fermentation du glucose.
Cette méthode dite d'hybridation repose sur la capacité des levures à se reproduire soit de manière asexuée, soit de manière sexuée, en fonction notamment des conditions de culture. La levure S. cerevisiae est un organisme à cycle reproductif haplodiplobiontique, c'est à dire un organisme capable de se multiplier activement aussi bien à l'état haploïde qu'à l'état polyploïde, par exemple diploïde. Tant que le milieu est favorable, les levures polyploïdes sont capables d'une multiplication végétative par bourgeonnement donnant naissance à des levures polyploïdes. Dans le cas de milieu pauvre en nutriments azotés et contenant uniquement une source de carbone non fermentescible (par exemple glycérol, acétate...), les cellules hétérozygotes pour le locus Mat entrent en méiose et forment des levures ayant une ploïdie réduite (spores ou ségrégeants) par un mécanisme dit de sporulation.
Les ségrégeants peuvent se multiplier par bourgeonnement, donnant des levures possédant le même génome. On distingue parmi les levures haploïdes deux signes sexuels opposés, appelés MATa et MATa. Deux spores haploïdes de type sexuel opposé sont capables de fécondation pour donner une levure diploïde.
Le cycle haplodiplobiontique de S. cerevisiae a largement été utilisé pour croiser des ségrégeants sexuellement compatibles (MATa et MATa), en particulier dans la méthode dite de recombinaison aléatoire issue de sporulation et hybridation en masse. De manière classique, deux souches parentales (différentes d'un point de vue génomique) diploïdes sont utilisées. La sporulation des souches parentales diploïdes est typiquement induite en les cultivant dans des conditions où l'apport en azote est limité et uniquement en présence d'une source de carbone non fermentescible. La méiose opérée lors de cette étape conduit à un brassage génétique, créant des spores au génotype varié. Les spores (haploïdes) obtenues pour chacune des souches parentales sont alors mises en contact, pour produire des souches diploïdes (hybrides) par fusion. Cette dernière étape est appelée l'étape d'hybridation.
Cette méthode est intéressante en ce qu'elle permet de créer un brassage génétique d'où peuvent ressortir des traits phénotypiques d'intérêt. Elle nécessite toutefois une étape de sélection des hybrides sur la base des traits phénotypiques recherchés. A titre d'exemple, dans le cas de souches parentales strictement diploïdes présentant chacune un trait phénotypique porté par 10 gènes, la probabilité d'obtenir l'hybride d'intérêt est estimée à
I / 2,097.106. Or, l'étape de sélection finale est fastidieuse, longue et surtout coûteuse.
II existe donc un besoin évident de procédés améliorés pour la production de souches de levure résistantes à l'acide acétique. DESCRIPTION DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis en évidence différents QTL, répartis sur les chromosomes I, IV, V, VII, X, et XV de S. cerevisiae, associés au phénotype de résistance à l'acide acétique lors de la fermentation du glucose.
En outre, les inventeurs ont identifié, au sein de ces QTL, les polymorphismes nucléotidiques potentiellement associés à ce phénotype de résistance à l'acide acétique. De façon particulièrement intéressante, les inventeurs ont déterminé que la présence d'au moins un polymorphisme nucléotidique d'intérêt dans les souches de levure S. cerevisiae était associée à une augmentation de sa résistance à l'acide acétique lors de la fermentation du glucose. Sur la base de ces éléments, il est proposé des procédés de sélection et d'obtention de souches de levure résistantes à l'acide acétique.
DEFINITIONS Les termes « souche de levure » désignent au sens de l'invention une population de levures rigoureusement identiques du point de vue génétique. Cela englobe aussi bien les souches dites de laboratoire que les souches dites industrielles. Ce terme est à différencier du terme « levure », une levure étant obtenue par culture d'une souche telle que définie ci-dessus. On entend par « levure » un produit commercial obtenu grâce à la mise en œuvre d'un procédé de production d'une souche de levure. Ainsi, des levures présentant des caractéristiques différentes peuvent être obtenues à partir d'une même souche, ces différences étant liées au procédé de production mis en œuvre.
Au sens de l'invention, un « ségrégeant » est le produit de la méiose d'une souche de levure, quel que soit le niveau de ploïdie de ladite levure. Dans la suite de la demande, les termes « ségrégeant » et « spore » pourront être utilisés indifféremment.
Les termes « souche de levure apte à métaboliser le glucose » désignent au sens de l'invention une souche de levure capable de convertir le glucose en éthanol, c'est-à-dire capable de fermenter le glucose. Une souche de levure apte à métaboliser le glucose au sens de l'invention est une souche de levure qui convertit au moins 70%, de préférence au moins 80%, plus préférentiellement au moins 90 %> du glucose en éthanol en 60 heures dans un milieu de fermentation comprenant 150 g de glucose par kg de milieu de fermentation, dans des conditions de fermentation alcoolique usuelles. De préférence, la méthode utilisée pour mesurer le pourcentage de glucose converti en éthanol est la suivante :
La souche de levure utilisée est ensemencée dans du milieu synthétique de fermentation à hauteur de 0,25 g de levure en matière sèche / kg de milieu de fermentation. La durée de 60 heures est calculée à partir de l'ensemencement de la souche de levure dans le milieu synthétique de fermentation. Un milieu synthétique de fermentation est un milieu dont la composition chimique exacte est connue. Dans le cadre de l'invention, un milieu synthétique de fermentation comprend une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore, ainsi que les vitamines et minéraux essentiels à la croissance d'une souche de levure. De préférence, le milieu de fermentation utilisé pour mesurer le pourcentage de glucose converti en éthanol est le milieu YF tel que défini dans les exemples de réalisation (noté YF Ac en raison de la présence d'acide acétique). La fermentation est typiquement conduite à une température comprise entre 28 et 37°C, voire entre 30 et 35°C, avantageusement égale à 32°C, sous agitation modérée, par exemple à 90 ou 100 rpm. L'agitation est modérée pour ne pas être oxygénante. Le pH du milieu est de préférence contrôlé, par exemple par le pouvoir tampon d'un couple acide/base (tel que le couple acide acétique/acétate), et acide, avantageusement compris entre 3,5 et 6, voire 4 et 5,5, encore plus avantageusement égal à 4,4 ou 5.
La quantité d'éthanol présente dans le milieu de fermentation est mesurée par tout moyen approprié connu de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une mesure directe de l'éthanol produit ou d'une mesure indirecte via un paramètre corrélé à la production d'éthanol, tel que la production de C02 déterminée en mesurant la perte de masse. Par exemple, la production d'alcool peut être mesurée par chromatographie, notamment par HPLC (High Performance Liquid Chromatography), un kit enzymatique (par exemple le kit de dosage de l'éthanol de Boehringer), ou un dosage par le dichromate de potassium. La quantité de glucose présente dans le milieu de fermentation est mesurée par tout moyen approprié connu de l'homme du métier, de préférence par chromatographie, notamment par HPLC.
Dans le cadre de l'invention, on entend par « acide organique » ou « acide organique faible », un acide carboxylique susceptible d'inhiber la fermentation d'un sucre, avantageusement du glucose. Il s'agit avantageusement d'acide acétique, d'acide lévulinique ou d'acide formique, encore plus avantageusement d'acide acétique. A noter que de manière connue, seule la forme non dissociée ou non ionisée de tels acides présente une capacité d'inhibition. Dans le cadre de l'invention, on entend par « forme non ionisée ou non dissociée » d'un acide carboxylique sa forme protonée. En pratique, la forme de tels acides organiques dépend du pH du milieu dans lequel ils sont incorporés. A un pH supérieur au pKa de l'acide, celui-ci se trouve majoritairement sous forme dissociée ou d'ions COO". Au contraire et à un pH inférieur, la forme majoritaire est la forme non dissociée ou non ionisée (COOH). Dans la suite de l'invention, les quantités ou concentrations mentionnées font référence à l'acide acétique introduit dans le milieu, englobant formes dissociée et non dissociée en fonction du pH dudit milieu.
Les termes « résistante à un acide organique » ou « résistante à l'acide acétique » désignent une souche de levure apte à fermenter au moins un sucre, en particulier le glucose, avec un impact limité de l'acide organique/acétique sur la courbe de fermentation alcoolique. La courbe de fermentation alcoolique représentant la quantité d'alcool produit en fonction du temps comporte généralement trois phases : une phase de latence au cours de laquelle il n'y a pas de production d'éthanol, une phase de production d'alcool, et une phase de plateau, qui correspond à la fin de la fermentation.
De manière connue, l'acide acétique est un inhibiteur de la fermentation du glucose, cette inhibition se traduisant par un retard lors de l'initiation de la fermentation, la cinétique restant par la suite inchangée. A noter qu'en présence à la fois de glucose et de xylose dans le milieu, les souches de levure fermentent en priorité le glucose en raison de la répression catabolique. Ainsi, une « souche résistante à l'acide acétique » présente avantageusement un retard d'initiation de la fermentation alcoolique inférieur à 30 heures, de préférence inférieur à 20 heures, plus préférentiellement inférieur à 15 heures voire 10 heures. De préférence, référence est faite à l'aptitude à fermenter du glucose avec un retard d'initiation de la fermentation alcoolique tel qu'indiqué plus haut.
Le milieu de fermentation utilisé pour évaluer la résistance à l'acide acétique est de préférence un milieu synthétique, plus préférentiellement le milieu YFAc tel qu'illustré dans les exemples de réalisation. La composition du milieu YFAc est la suivante : 150 g/kg de glucose, 5 g/kg d'extrait de levure, 4,7 g/kg de DAP (diammonium phosphate), 11,4 g/kg d'acide citrique, 4 g/kg d'acide acétique, 13,5 g/kg de citrate de sodium, 1 ml/kg de Tween 80, 2 ml/kg de ZnS04 (à 10,6 g/L), 2,5 ml/kg de MgS04 7H20 (à 400 g/L), 1 ml/kg de thiamine (à 18,24 g/L), 1 ml/kg de pyridoxine (à 5,28 g/L), 1 ml/kg de biotine (à 1,76 g/L), 1 ml/kg de panthoténate (à 3,8 g/L), 2,5 ml/kg d'acide nicotinique (à 8 g/L), 1 ml/kg de mésoinositol (à 50 g/L), 1 ml/kg de riboflavine (à 1 g/L),
I ml/kg de para-aminobenzoate (à 1,2 g/L), pH ajusté à 4,4 avec KOH. L'ensemencement de la souche de levure utilisée pour évaluer la résistance à l'acide acétique est de préférence, 0,25 g en matière sèche / kg de milieu de fermentation. Le temps t=0 de la courbe de fermentation alcoolique correspond au moment de l'ensemencement de la souche de levure dans le milieu de fermentation. La fermentation alcoolique est conduite en condition anaérobie, de préférence à 32°C et sous agitation modérée, par exemple 90 rpm.
II convient de noter qu'à la concentration de 2000 ppm, l'acide acétique n'a pas d'effet inhibiteur sur la fermentation. De manière adaptée, l'acide acétique est ajouté à hauteur de 1 à 10 g / kg de milieu de fermentation, par exemple 4 g / kg de milieu de fermentation
Dans le contexte de l'invention, les abréviations suivantes sont utilisées pour les bases d'acide nucléique (ou nucléotides) les plus courantes. « A» » se réfère à l'adénosine, « C » se réfère à la cytosine, « G » désigne la guanosine et « T » désigne la thymidine.
Dans le cadre de l'invention, on entend par « QTL » (pour « Quantitative Trait Loci ») des séquences du génome, d'une taille pouvant aller de plusieurs centaines à plusieurs milliers de bases (ou de nucléotides), dont la présence est corrélée avec une variation de phénotype. Ces séquences comprennent des modifications génétiques, appelées mutations, qui sont responsables de la variation mesurable de phénotype observée.
Dans le cadre de l'invention, on entend par « polymorphisme nucléotidique » ou « SNP » (pour « Single-Nucleotide Polymorphism »), la variation (ou polymorphisme) d'une seule paire de bases du génome entre un individu d'une espèce et celui de l'organisme de référence de cette espèce, en l'occurrence des souches de levure.
De manière plus générale, on entend par « mutation » (ou polymorphisme nucléotidique) toute altération observée à une position donnée du génome. Ainsi, le terme « mutation » comprend aussi bien :
- mutation par substitution ou SNP : remplacement d'un (ou plusieurs) nucléotides par un autre (ou plusieurs autres) ;
- mutation par insertion ou insertion : ajout d'un ou plusieurs nucléotides ;
- mutation par délétion ou délétion : perte d'un ou plusieurs nucléotides. Dans le cadre de l'invention, ces positions sont indiquées en référence au génome de la souche de levure S. cerevisiae S288c, dont la séquence complète est disponible dans les bases de données sous la référence GenBank GCA 000146045.2. (version du 18 avril 2011) et dont la référence NCBI est Gene ID: 852501.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Selon un premier aspect, l'invention concerne l'utilisation de régions chromosomiques d'intérêt, nouvellement identifiées, pour conférer une résistance à un acide organique à une souche de levure.
Des chromosomes particulièrement d'intérêt dans le cadre de la présente invention sont les suivants :
le chromosome I, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence
NC 001133.8 (SEQ ID NO : 1) ;
le chromosome IV, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001136.9 (SEQ ID NO : 2) ;
- le chromosome V, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae
S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001137.2 (SEQ ID NO : 3) ;
le chromosome VII, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001139.8 (SEQ ID NO : 4) ;
le chromosome X, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001142.8 (SEQ ID NO : 5) ;
le chromosome XV, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence
NC 001147.5 (SEQ ID NO : 6).
Sur ces chromosomes, des régions particulièrement d'intérêt ont pu être localisées. Leur position est donnée par référence à la numérotation du chromosome correspondant dans la souche de référence S288c. Il s'agit avantageusement de :
la région localisée entre les bases 70000 et 120000 du chromosome I ; et/ou la région localisée entre les bases 370000 et 560000 du chromosome IV, avantageusement la région localisée entre les bases 525000 et 526500 ; et/ou la région localisée entre les bases 1100000 et 1250000 du chromosome IV ; et/ou la région localisée entre les bases 420000 et 500000 du chromosome V, avantageusement la région localisée entre les bases 458000 et 470000 ; et/ou la région localisée entre les bases 410000 et 570000 du chromosome VII, avantageusement la région localisée entre les bases 522000 à 549000 ; et/ou la région localisée entre les bases 350000 et 490000 du chromosome X ; et/ou la région localisée entre les bases 590000 et 660000 du chromosome X, avantageusement la région localisée entre les bases 606900 et 607900 ; et/ou la région localisée entre les bases 550000 et 680000 du chromosome XV, avantageusement la région localisée entre les bases 610500 et 612000.
Selon un mode de réalisation particulier, l'ensemble de ces régions est utilisé.
Selon un autre aspect, à l'intérieur de ces différentes régions, des positions particulières d'intérêt ont pu être localisées. Avantageusement, il s'agit des positions suivantes :
au moins l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I ;
au moins l'une des positions listées dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV ;
- au moins l'une des positions listées dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V ;
au moins l'une des positions listées dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII ;
au moins l'une des positions listées dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X ;
au moins l'une des positions listées dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV.
Dans le cadre de l'invention, une position d'intérêt correspond à un polymorphisme nucléotidique, c'est-à-dire l'absence à cette position (ou à la position correspondante dans la souche analysée) du nucléotide observé dans la souche de référence S288c. En d'autres termes, une mutation, qui peut aussi bien être une substitution, une insertion ou une délétion, est observée à cette position. Selon un mode de réalisation particulier, une région chromosomique visée porte une mutation à l'ensemble des positions listées. Selon un autre mode de réalisation, toutes ces régions portent une mutation à toutes les positions listées. Selon un autre aspect, à ces différentes positions, des mutations particulières d'intérêt ont pu être identifiées. Avantageusement, il s'agit des mutations suivantes :
au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I ;
- au moins l'une des mutations listées dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV ;
au moins l'une des mutations listées dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V ;
au moins l'une des mutations listées dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII ;
au moins l'une des mutations listées dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X ;
au moins l'une des mutations listées dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV.
Selon un mode de réalisation particulier, une région chromosomique visée porte l'ensemble des mutations listées. Selon un autre mode de réalisation, toutes ces régions portent toutes les mutations listées. Selon un mode de réalisation avantageux, la résistance conférée est une résistance à l'acide acétique, dont la présence en fortes concentrations dans les hydrolysats lignocellulosiques est intrinsèquement liée à celle de groupements acétyles associés de manière covalente avec les molécules d'hémicellulose. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la résistance à l'acide organique de la souche de levure se traduit lors de la fermentation du glucose, pour laquelle le retard d'initiation de la fermentation est diminué ou réduit.
Selon un mode de réalisation privilégié, la souche de levure visée par la présente invention appartient au groupe des hemi-ascomycètes. Des souches privilégiées appartiennent au genre Saccharomyces, Pichia ou Yarrowia, avantageusement Saccharomyces . Parmi les Saccharomyces, il s'agit avantageusement de S. cerevisiae.
Selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de sélection ou d'identification d'une souche de levure résistante à un acide organique comprenant la mise en évidence de : une mutation au moins à l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement à toutes ces positions; et/ou
au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement toutes ces mutations. Comme déjà dit, l'acide organique est avantageusement de l'acide acétique.
Selon un autre mode de réalisation privilégié, la résistance à l'acide organique de la souche ainsi sélectionnée est observée lors de sa fermentation sur glucose. Ainsi, la présente invention offre un procédé de criblage génotypique de souches d'intérêt, en l'occurrence résistantes à un acide organique. Cette approche est beaucoup plus économique, aussi bien en termes de temps que d'argent, que les criblages phénotypiques traditionnellement mis en œuvre. Comme énoncé, ce criblage repose sur la mise en évidence d'une mutation à au moins l'une des positions listées, avantageusement à toutes les positions listées, et/ou la mise en évidence d'au moins l'une des mutations listées, avantageusement de toutes les mutations listées. De manière connue, la mise en évidence de ces mutations peut être réalisée par toute technique disponible pour l'homme du métier telle que séquençage, PCR, hybridation.
Ceci peut concerner un seul allèle de cette souche, voire plusieurs, voire même tous les allèles (deux en cas d'une levure diploïde, trois en cas de souche triploïde, ...).
L'intérêt d'une souche identifiée à l'aide de ce procédé peut bien sûr être confirmé par une approche phénotypique, consistant à évaluer la capacité de la souche sélectionnée à fermenter du glucose en présence d'acide acétique, par exemple comme décrit ci-dessus. Ces différents critères de criblage génotypique peuvent également être mis en œuvre pour la production ou l'obtention de souches de levure résistantes à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, en particulier dans le cadre de la fermentation du glucose. Ainsi et à l'aide des outils de biologie moléculaire disponibles, il est possible de faire de la mutagénèse (dirigée ou aléatoire) sur des souches de levure pour obtenir le phénotype désiré. Comme déjà dit, la présence des caractéristiques génotypiques mentionnées ci- dessus n'est a priori nécessaire qu'au niveau d'un allèle. Alternativement, cette mutagénèse peut donc être réalisée sur des spores (ou ségrégeants) qui sont par la suite hybridés avec d'autres spores, issues éventuellement d'une autre souche présentant un autre trait phénotypique d'intérêt.
Ainsi et selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de production ou d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose comprenant :
l'introduction dans la souche d'une mutation au moins à l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement à toutes ces positions; et/ou
l'introduction dans la souche d'au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement toutes ces mutations. Selon un autre mode de réalisation, l'invention propose un procédé de production ou d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, basé sur un criblage génotypique réalisé au niveau des spores ou ségrégeants, haploïdes.
Ainsi et selon un autre aspect, l'invention propose un procédé d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, comprenant :
- une étape de sporulation de deux souches parentales possédant des génomes différents ou des traits phénotypiques divergents ;
- une étape d'hybridation en masse des spores ou ségrégeants obtenus,
ledit procédé comprenant au moins une étape de sélection des ségrégeants en raison de la présence
• d'une mutation au moins à l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement à toutes ces positions; et/ou
d'au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement toutes ces mutations.
De manière caractéristique, le procédé de l'invention comprend une étape de sporulation des souches parentales. Cette technique est bien connue de l'homme du métier et ne nécessite donc pas d'être détaillée plus avant. A titre d'exemple, l'étape de sporulation peut être réalisée en cultivant les souches parentales dans des conditions de cultures appropriées, tel que par exemple en milieu carencé.
Parmi les souches parentales, au moins l'une d'elle présente le phénotype d'intérêt, en l'occurrence une résistance à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, au sens de l'invention. Avantageusement, celle-ci présente un retard d'initiation de la fermentation alcoolique inférieur à 30 h, de préférence inférieur à 20 heures, plus préférentiellement inférieur à 15 heures voire 10 heures dans le milieu de fermentation YFAc avec un inoculum de 0,25 g de matière sèche de levure / kg de milieu. De telles souches sont bien connues de l'homme du métier. Le cas échéant, l'homme du métier pourra produire la souche de levure parentale résistante à l'acide organique/acétique au sens de l'invention, par exemple par les techniques usuelles utilisant la pression de sélection.
A noter qu'une souche parentale d'intérêt peut également être identifiée à l'aide du procédé de sélection, objet de la présente invention.
Dans le cas particulier de la mise en œuvre de S. cerevisiae, il peut notamment s'agir de la souche EGAcl déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-4839 en date du 13 Mars 2014. Comme mis en évidence dans le cadre de la présente demande, ce trait phénotypique n'étant éventuellement porté que par un allèle, la sporulation donne lieu à des spores ne portant pas ce trait géno typique, en l'occurrence la moitié des spores dans le cas d'une souche parentale diploïde ne portant qu'un allèle de résistance à l'acide organique/acétique.
Dans un cas particulier, les deux souches parentales mises en œuvre dans le cadre du procédé selon l'invention présentent un phénotype de résistance à un acide organique au sens de l'invention.
De manière adaptée, au moins l'une des souches de levure parentales, en particulier celle résistante à l'acide organique/acétique, avantageusement les deux souches parentales sont aptes à fermenter le glucose au sens de l'invention. Selon un mode de réalisation privilégié, la seconde souche de levure parentale, avantageusement celle ne présentant pas de résistance à l'acide organique/acétique, présente un second trait phénotypique d'intérêt. Il s'agit par exemple de la capacité à métaboliser les pentoses, en particulier le xylose présent en grande quantité dans les hydrolysats lignocellulosiques.
Ainsi, des souches de levures aptes à fermenter le glucose et pouvant également métaboliser les pentoses sont disponibles :
A titre d'exemple, le document WO 2010/000464 rapporte l'obtention de souches de levure aptes à fermenter les pentoses grâce à un gène bactérien codant une xylose isomérase (XI) qui convertit le xylose en xylulose métabolisable par la levure. A noter que de manière alternative, une voie eucaryote comprenant une xylose réductase (XR ou XYL1) générant du xylitol et une xylitol déshydrogénase (XDH ou XYL2) permet également d'aboutir au xylulose.
Ainsi, le document WO 2012/072793 décrit des souches de levure améliorées, associant des gènes exogènes codant une xylose isomérase et une xylitol déshydrogénase permettant d'éliminer le xylitol qui s'avère être un inhibiteur de la xylose isomérase. De telles souches, en particulier la souche déposée à la CNCM le 5.10.2011 sous le numéro I- 4538, présentent des rendements améliorés et donc une utilité industrielle avérée pour la production d'éthanol. Selon un mode de réalisation particulier, la seconde souche parentale mise en œuvre dans le cadre du procédé selon l'invention est la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F- 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-4538 en date du 5 Octobre 2011.
Le procédé de l'invention comprend en outre une étape d'hybridation en masse des spores ou ségrégeants obtenus.
Cette étape est facilement réalisée selon les méthodes classiques utilisées dans le domaine et décrites en détail dans le chapitre 7 « Sporulation and Hydridization of Yeast » par R.R. Fowell, de l'ouvrage de référence « The Yeasts », Volume 1, édité par A.H. Rose et J. S. Harrison, 1969-Academic Press. Brièvement, l'hybridation est réalisée en introduisant les spores en question dans un milieu de culture adapté à l'étape d'hybridation. Typiquement, l'homme du métier pourra utiliser pour cette étape du milieu de culture complet de type YPG (contenant extrait de levure 10 g/L, Bactopeptone 20 g/L, glucose 20 g/L et eau déminéralisée qsp 1 L).
L'étape de sélection des spores ou ségrégeants d'intérêt est réalisée comme décrit précédemment et repose sur la mise en évidence d'une mutation à au moins l'une des positions listées, avantageusement à toutes les positions listées, et/ou la mise en évidence d'au moins l'une des mutations listées, avantageusement de toutes les mutations listées.
Comme déjà dit, la mise en évidence de ces séquences peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier telle que séquençage, PCR, hybridation.
Une telle sélection peut par exemple être réalisée sur la base du séquençage total ou partiel selon les techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme de l'art, ou encore par des techniques de PCR. Le séquençage peut ainsi être réalisé par séquençage par hybridation ou par des techniques de séquençage haut débit telles que le pyroséquençage, le séquençage par synthèse ou le séquençage par ligation. Alternativement, la sélection peut être réalisée sur la base de techniques PCR en recherchant les polymorphismes visés. On peut dans ce cadre citer par exemple les techniques de PCR multiplexe, qui permettra de rechercher plusieurs polymorphismes en un seul test, la PCR emboîtée, qui permet une grande sensibilité de résultat, ou encore la PCR sur colonie qui ne nécessite pas d'extraction de l'ADN. Afin de réaliser le séquençage ou la PCR, une étape de multiplication de l'ADN peut s'avérer nécessaire, afin de disposer de suffisamment de matière biologique. Il sera alors possible de procéder à une amplification en cultivant chaque souche ou spore dans un milieu de culture adapté à sa reproduction. En outre, une étape d'extraction de l'ADN des levures peut s'avérer nécessaire, qui pourra être faite selon les méthodes de biologie moléculaire bien connues dans le domaine de l'invention.
Comme déjà dit, le procédé de l'invention peut être mis en œuvre de diverses façons, l'étape de sélection des levures pouvant être réalisée à partir des souches parentales, et/ou à partir des spores qui en découlent, et/ou à partir des souches obtenues après hybridation. Comme déjà dit, il est toutefois particulièrement avantageux de procéder à l'étape de sélection à partir des spores découlant des souches parentales.
Ainsi et selon un mode de réalisation privilégié, un procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) préparer des ségrégeants issus d'une première souche parentale et des ségrégeants issus d'une deuxième souche parentale ;
b) sélectionner parmi les ségrégeants issus de l'étape a) ceux présentant :
• une mutation au moins à l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement à toutes ces positions; et/ou
• au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement toutes ces mutations ;
c) hybrider les ségrégeants issus de la première souche parentale et sélectionnés à l'étape b) avec les ségrégeants issus de la deuxième souche parentale, éventuellement sélectionnés à l'étape b) ;
d) sélectionner parmi les hybrides issus de l'étape c) ceux résistants à l'acide organique. L'étape a) du procédé correspond à une étape de préparation de ségrégeants à partir de deux souches parentales de levure, avantageusement S. cerevisiae, différentes, c'est-à-dire une étape de sporulation. L'homme du métier pourra aisément obtenir des ségrégeants à partir des souches parentales définies plus haut, selon les méthodes bien connues dans le domaine de l'invention.
Dans un mode de réalisation avantageux, cette étape comprend la culture de la première souche de levure parentale d'une part et de la deuxième souche de levure parentale d'autre part, dans un milieu carencé en azote ou en sucre.
De manière préférée, les souches parentales mises en œuvre sont des souches de levure appartenant au groupe des Saccharomyces, avantageusement Saccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation privilégié, la première souche est choisie pour sa capacité de résistance à l'acide organique, avantageusement l'acide acétique, en particulier lors de la fermentation sur glucose. Il peut notamment s'agir de la souche EGAcl déposée à la CNCM sous le numéro 1-4839 en date du 13 Mars 2014. Les ségrégeants de cette souche feront en priorité l'objet de l'étape de sélection b) du procédé. Selon un autre mode de réalisation privilégié, la seconde souche de levure parentale est choisie pour un autre trait phénotypique d'intérêt, par exemple sa capacité à métaboliser le xylose. Il peut par exemple d'agir de la souche déposée à la CNCM sous le numéro I- 4538 en date du 5 Octobre 2011. Dans un cas particulier, la seconde souche de levure parentale peut également présenter une capacité de résistance à l'acide organique, avantageusement l'acide acétique, en particulier lors de la fermentation sur glucose. Dans ce cas de figure, les spores de cette souche feront également l'objet de l'étape de sélection b) du procédé. L'étape b) du procédé de l'invention est mis en œuvre comme décrit ci-dessus et permet d'éliminer les spores ne présentant pas le trait phénotypique recherché, en l'occurrence une résistance à un acide organique au sens de l'invention. Ainsi et grâce à cette étape, la probabilité d'obtenir à l'issue de l'hybridation une souche présentant ce trait phénotypique est fortement augmentée. L'étape c) du procédé de l'invention est une étape d'hybridation des ségrégeants issus d'une première souche de levure parentale avec des ségrégeants issus d'une deuxième souche parentale, au moins l'une des populations de ségrégeants ayant été préalablement sélectionnée à l'étape b), avantageusement celle issue de la première souche de levure parentale.
De préférence, on réalise à l'étape c) une hybridation en masse. En d'autres termes, l'étape c) correspond de préférence à une étape d'hybridation de la totalité des spores issues de l'étape b).
L'étape d) du procédé, optionnelle, consiste à sélectionner parmi les hybrides issus de l'étape c) ceux capables de fermentation alcoolique et possédant un phénotype de résistance à l'acide organique, avantageusement l'acide acétique. Comme déjà dit, cette étape est aisément réalisée par des méthodes traditionnelles de sélection, mettant en œuvre des techniques de culture usuelles. Cette étape est avantageusement mise en œuvre sur un milieu comprenant du glucose.
La présente invention va être illustrée plus avant à l'aide des exemples de réalisation qui suivent, à l'appui des figures annexées. Toutefois, ceux-ci n'ont aucune portée limitative.
LÉGENDES DES FIGURES :
La figure 1 représente le logigramme utilisé pour déterminer la proportion d'allèles issus de EGAcl (1-4839) dans les populations de levures ayant fermenté en présence d'acide acétique (popB) ou dans les populations de levures ayant fermenté sans acide acétique (popC).
S288c : souche de S. cerevisiae dont le génome sert de référence (GenBank GCA 000146045.2., version du 18 avril 2011 ; NCBI Gene ID: 852501)
EGAcl : souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 13 Mars 2014 sous le numéro 1-4839
1-4538 : souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 5 Octobre 2011
EGAc2 : souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 13 Mars 2014 sous le numéro 1-4840 La figure 2 représente les moyennes des fréquences des allèles de la souche EGAcl (I-
4839) dans les deux populations : PopC = non stressées, en pointillés ; PopB = stressées, en trait plein, et cela le long des chromosomes I (A), IV (B), V (C), VII (D), X (E) et XV (F). Les blocs en pointillés représentent les QTL potentiels.
EXEMPLES DE REALISATION
Identification de traits génétiques et mutations liés au phénotype de résistance aux acides organiques faibles tels que l'acide acétique
Dans ces expériences, l'objectif est de produire une population de levures diverses d'un point de vue génétique (a), afin non seulement de sélectionner les souches résistantes aux acides organiques faibles mais aussi de pouvoir analyser les traits génétiques impliqués dans ce phénotype (b). a. Production d'une population de levures comprenant des souches résistantes aux acides organiques faibles :
La population de levures a été obtenue par recombinaison aléatoire issue de sporulation et hybridation en masse. Cette stratégie est inspirée des travaux de Léo Parts et al. (2011, Génome Res, 21(7) : 1131—8). Brièvement, un ségrégeant (aussi appelé spore) d'une souche résistante à l'acide acétique (souche EGAcl/I-4839) est croisé avec un autre ségrégeant, issu de la souche 1-4538, créant ainsi un premier hybride (souche EGAc2/I-
4840) , comme décrit dans WO2013/178915.
Dans un second temps, le génome de la souche EGAc2 (1-4840) a été recombiné de manière aléatoire pour obtenir une population de levures très diverses d'un point de vue génétique. En pratique, l'hybride EGAc2 (1-4840) a été mis à sporuler puis les spores obtenues ont été laissées libres de se réhybrider entre elles, comme décrit dans WO2013/178915. Le cycle a été reproduit 4 fois, générant ainsi une réduction de 24 de la distance génétique en centiMorgan (cM). b. Sélection des souches résistantes aux acides organiques faibles : Les souches résistantes aux acides organiques faibles ont été sélectionnées en suivant les principes de la génétique des populations, en particulier le principe de Hardy et Weinberg qui énonce que dans une population isolée d'effectif illimité, non soumise à la sélection, et dans laquelle il n'y a pas de mutations, les fréquences alléliques et les fréquences génotypiques restent stables de génération en génération.
Ainsi, en l'absence de sélection, dans le cas de 2 allèles « A » et « B », dont seule « A » est susceptible de jouer un rôle dans l'adaptation de la population à une pression de sélection donnée (par exemple la résistance aux acides organiques faibles), les fréquences de l'allèle « A » et de l'allèle « B » dans la population restent stables. En revanche, si l'environnement change, et que le milieu est enrichi en acide organique faible, alors les souches les moins adaptées vont disparaître (B) au profit des souches les plus adaptées (A). Selon ce principe, dans le cas où il existe une pression de sélection, on observe alors un écart à cet équilibre sur quelques générations. Ainsi, en comparant les variations de fréquence allélique entre une population non soumise à la sélection et une population soumise à une pression de sélection, on peut déterminer les allèles susceptibles d'être impliqués dans la résistance ou l'adaptation à la sélection appliquée.
En pratique, afin de disposer d'une population contrôle, un échantillon de la population obtenue au point a) a été cultivé en milieu dépourvu d'acide acétique (sans pression de sélection). La population ainsi obtenue est appelée « population C ». Parallèlement, un échantillon de la population obtenue au point a) a été soumis à une forte pression de sélection par ajout d'acide acétique au début de la fermentation alcoolique en présence de glucose. La population ainsi obtenue est appelée « population B ». En pratique, l'acide acétique a été ajouté au milieu de culture de façon à obtenir une concentration de 4g/L. c. Détermination des traits génétiques impliqués dans le phénotvpe de résistance aux acides organiques faibles :
La souche EGAcl (1-4839) étant résistante à l'acide acétique, il est attendu que les traits génétiques associés à cette résistance soient présents dans cette souche. Par conséquent, afin de limiter le nombre d' allèles à analyser, on identifie dans un premier temps les allèles spécifiques à la souche EGAcl (1-4839) qui sont présents dans la souche EGAc2 (1-4840), ainsi que dans les populations C et B. Dans un second temps, il est possible de déterminer la fréquence d'apparition de chacun de ces allèles dans les populations stressées (B) ou non (C).
L'étude des variations de la fréquence allélique le long du génome a été réalisée de la manière suivante : A l'issue des fermentations, les ADN génomiques provenant de la souche EGAcl (I- 4839), de la souche EGAc2 (1-4840) et provenant des populations B et C ont été extraits puis séquencés par la méthode « Paired End » via un HiSeq 2000 d'Illumina. Les résultats sont ensuite traités selon l'approche illustrée à la figure 1. A noter que le génome de référence est celui de la souche S288c (GenBank GCA 000146045.2., version du 18 avril 2011 ; NCBI Gene ID: 852501).
Dans le cas d'une étude menée sur des populations complexes, la fréquence allélique est le reflet du nombre d'individus portant l'allèle en question. Ainsi, à titre d'exemple et en application directe de la loi de Hard et Weinberg, si un allèle est présent avec une fréquence de 70 %, il est possible d'en déduire que 91 % des individus de la population portent au moins une copie de cet allèle. La figure 2 représente l'évolution de la fréquence des allèles issus de la souche EGAcl (I- 4839) et présents dans les populations B et C, et ce le long du chromosome I (Fig. 2A), IV (Fig. 2B), V (Fig. 2C), VII (Fig. 2D), X (Fig. 2E) et XV (Fig. 2F).
Les résultats présentés sur la figure 2 montrent, sur chacun de ces chromosomes, des régions (blocs en pointillés) dans lesquelles une dissociation des courbes correspondant aux fréquences des allèles issus de l'EGAcl (1-4839) dans les deux types de populations est observée. Ces résultats montrent qu'il y a un allèle qui est plus représenté dans les populations soumises à pression de sélection que dans celles qui ont fermenté sans cette pression. Cette surreprésentation suggère que l'allèle issu de l'EGAcl (1-4839) favoriserait la multiplication des cellules en présence d'acide acétique. En d'autres termes, ces régions des chromosomes I, IV, V, VII, X et XV sont identifiées comme étant des traits génétiques quantifïables (aussi appelés QTL), c'est-à-dire des régions génétiques impliquées dans la résistance à l'acide acétique. Plus précisément, ces régions ont pu être localisées sur les chromosomes de la souche de référence S288c, comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous :
Chromosome Séquence de référence Position de la région en kb
Référence dans la base de données (taille de la région en kb)
NCBI
I NC 001133.8 (SEQ ID NO : 1) 70 à 120 (50)
IV NC 001136.9 (SEQ ID NO : 2) 1/ 370 à 560 (190), en particulier 525 à 526,5 (1,5) 2/ 1100 à 1250 (150)
Figure imgf000023_0001
Tableau 1 : Position des régions d'intérêt sur les chromosomes de la souche S288c d. Analyse des traits génétiques impliqués dans le phénotvpe de résistance aux acides organiques faibles
Au sein des QTL, ce sont plus spécifiquement les variations de fréquence des polymorphismes ponctuels (SNP pour « Single-Nucleotide Polymorphism »), en comparaison avec les souches ne présentant pas le trait phénotypique étudié, qui peuvent s'avérer les plus pertinentes.
Les régions repérées ci-dessus ont donc été analysées plus en détail et des mutations ont été identifiées dans ces régions. Les résultats sont présentés dans les 6 tableaux ci-dessous (numérotés 2 à 7) :
Figure imgf000023_0002
79070 T C
79223 G A
79568 A G
79573 T C
79587 CT C
79669 G A
79698 G GT
79998 A G
80055 G A
80078 G A
80176 G A
80183 G A
80194 G A
80235 G A
80243 A G
80500 C T
80752 C T
85481 C T
88174 C A
88783 G A
88813 A G
89011 T C
89061 C T
89267 A C
89269 T C
89335 T C
89431 C T
89434 A G
89473 A G
89485 C G
89495 A G
89562 T C
89617 G C
89680 T A
89706 T C
89806 C T
89980 A G
90065 G T
91315 G C
93603 A G
93790 T A
94570 A G
94683 G A 94994 G A
98114 G A
98420 A T
99563 A T
99564 T C
99565 C CG
99855 G A
99871 A T
101599 T C
105774 G T
108493 C A
109946 G A
109985 G A
110187 A G
110729 A G
113133 A G
114320 T C
114358 C A
114881 A G
115183 T C
115591 G C
115628 C G
115801 T C
116188 C T
116207 G A
116299 A G
117847 T C
117941 C T
118998 G A
119208 G A
119345 G A
119351 A G
119395 C T
119405 G C
119461 G A
119600 C T
119660 T G
119952 T C
Tableau 2 : Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome I
Figure imgf000026_0001
Tableau 3 : Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome IV
Figure imgf000027_0001
468189 T C
468264 C T
468302 G T
468640 T C
469073 A G
469145 T G
469419 T C
Tableau 4 : Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome V
Figure imgf000028_0001
524180 C T
524219 C T
524262 G A
524588 G A
524717 T C
525191 G A
526679 C CT
527394 T G
527400 T C
527443 C G
527472 A T
527677 C T
528011 G C
528678 C CG
529252 T C
529816 G A
530038 A C
530044 A C
530547 G A
530587 G A
530651 A G
531038 T C
531084 T C
531196 T A
531265 G T
531326 G A
531469 C G
531485 T G
531688 A T
531745 A C
531980 T C
532404 T C
532487 C T
532775 G A
532819 T C
533332 A G
533630 C T
533763 T C
533945 A T
534522 C T
534711 G A
534743 T C
534965 T C 534970 G A
534992 G A
535022 T A
535124 A G
535139 C T
535213 G A
535543 T C
535872 A T
536317 C A
541514 A T
541716 A G
541812 G A
542103 A C
542104 G A
542287 C T
542761 A G
543480 A T
543674 C A
544223 A G
544226 C T
544264 A T
544290 T G
544400 A G
544469 C T
544655 A C
544690 T A
544715 T TCCC
544849 C T
544855 C T
544868 C A
544913 G A
544942 G C
544956 T C
545037 G A
545103 C T
545179 G C
545195 T C
545230 G C
545240 A G
545323 T A
545586 C T
545860 C T
545958 C A 546205 TC T
546371 G A
546402 TAAA T
546450 G T
546510 C T
546638 T A
547212 C T
547493 A AGG
547849 A G
547966 T A
548029 C T
548110 A G
548213 A G
548265 G A
548927 T C
548957 A G
Tableau 5 : Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome VII
Figure imgf000031_0001
607742 C T
607756 τ C
607798 C T
607800 τ C
607835 A G
607866 G GT
Tableau 6 : Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome X
Figure imgf000032_0001
Tableau 7 : Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau chromosome XV

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de sélection d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose comprenant la mise en évidence, au moins au niveau d'un allèle de la souche, de :
- une mutation dans le chromosome I au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau :
Figure imgf000033_0001
80235 G A
80243 A G
80500 C T
80752 C T
85481 C T
88174 C A
88783 G A
88813 A G
89011 T C
89061 C T
89267 A C
89269 T C
89335 T C
89431 C T
89434 A G
89473 A G
89485 C G
89495 A G
89562 T C
89617 G C
89680 T A
89706 T C
89806 C T
89980 A G
90065 G T
91315 G C
93603 A G
93790 T A
94570 A G
94683 G A
94994 G A
98114 G A
98420 A T
99563 A T
99564 T C
99565 C CG
99855 G A
99871 A T
101599 T C
105774 G T
108493 C A
109946 G A
109985 G A 110187 A G
110729 A G
113133 A G
114320 T C
114358 C A
114881 A G
115183 T C
115591 G C
115628 C G
115801 T C
116188 C T
116207 G A
116299 A G
117847 T C
117941 C T
118998 G A
119208 G A
119345 G A
119351 A G
119395 C T
119405 G C
119461 G A
119600 C T
119660 T G
119952 T C et/ou
- une mutation dans le chromosome IV au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau :
Figure imgf000035_0001
525818 T C
525848 C T
525860 A G
525866 T C
525875 C T
525881 T C
525905 C A
525974 C T
525986 G A
526040 C T
526115 G A
526133 G A
526181 T C
526184 C T
526213 G A
526220 G A
526301 C A
526352 G A
526355 C T
526370 T C
526418 T C
526454 C T
526478 C T
526481 T G
526493 T C et/ou
- une mutation dans le chromosome V au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau :
Figure imgf000036_0001
460023 C G
460126 A G
460177 A G
460220 A G
460336 G GA
461859 C T
461866 T C
461872 C T
462221 G A
462244 A G
462256 A G
462363 T C
462432 A G
462441 G A
462442 C T
462609 A G
462666 G A
464187 A G
464286 T C
464731 C T
464951 T C
465013 G A
465038 A G
465639 A G
465738 G A
465927 A G
466818 G C
467307 G A
467940 C G
468173 A G
468189 T C
468264 C T
468302 G T
468640 T C
469073 A G
469145 T G
469419 T C et/ou
- une mutation dans le chromosome VII au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau :
Figure imgf000038_0001
527472 A T
527677 C T
528011 G C
528678 C CG
529252 T C
529816 G A
530038 A C
530044 A C
530547 G A
530587 G A
530651 A G
531038 T C
531084 T C
531196 T A
531265 G T
531326 G A
531469 C G
531485 T G
531688 A T
531745 A C
531980 T C
532404 T C
532487 C T
532775 G A
532819 T C
533332 A G
533630 C T
533763 T C
533945 A T
534522 C T
534711 G A
534743 T C
534965 T C
534970 G A
534992 G A
535022 T A
535124 A G
535139 C T
535213 G A
535543 T C
535872 A T
536317 C A
541514 A T 541716 A G
541812 G A
542103 A C
542104 G A
542287 C T
542761 A G
543480 A T
543674 C A
544223 A G
544226 C T
544264 A T
544290 T G
544400 A G
544469 C T
544655 A C
544690 T A
544715 T TCCC
544849 C T
544855 C T
544868 C A
544913 G A
544942 G C
544956 T C
545037 G A
545103 C T
545179 G C
545195 T C
545230 G C
545240 A G
545323 T A
545586 C T
545860 C T
545958 C A
546205 TC T
546371 G A
546402 TAAA T
546450 G T
546510 C T
546638 T A
547212 C T
547493 A AGG
547849 A G
547966 T A 548029 C T
548110 A G
548213 A G
548265 G A
548927 T C
548957 A G et/ou
- une mutation dans le chromosome X au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau :
Figure imgf000041_0001
et/ou - une mutation dans le chromosome XV au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau :
Figure imgf000042_0001
Procédé d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose comprenant l'introduction dans la souche d'une mutation au moins à l'une des positions telles que définies à la revendication 1, avantageusement l'introduction dans la souche d'au moins l'une des mutations telles que définies à la revendication 1. Procédé d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose comprenant les étapes suivantes :
- une étape de sporulation de deux souches parentales possédant des génomes différents ;
- une étape d'hybridation en masse des ségrégeants obtenus ;
- au moins une étape de sélection des ségrégeants en raison de la présence d'une mutation au moins à l'une des positions telles que définies à la revendication 1, avantageusement d'au moins l'une des mutations telles que définies à la revendication 1.
Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) préparer des ségrégeants issus d'une première souche parentale et des ségrégeants issus d'une deuxième souche parentale ;
b) sélectionner parmi les ségrégeants issus de l'étape a) ceux présentant une mutation au moins à l'une des positions telles que définies à la revendication 1, avantageusement d'au moins l'une des mutations telles que définies à la revendication 1 ;
c) hybrider les ségrégeants issus de la première souche parentale et sélectionnés à l'étape b) avec les ségrégeants issus de la deuxième souche parentale, éventuellement sélectionnés à l'étape b) ;
d) sélectionner parmi les hybrides issus de l'étape c) ceux résistants à l'acide organique.
Procédé selon l'un des revendications 3 à 4, caractérisé en ce que la première souche est choisie pour sa capacité de résistance à l'acide organique et la seconde souche pour une autre caractéristique d'intérêt, par exemple sa capacité à métaboliser le xylose.
Procédé selon l'un des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la première souche est la souche EGAcl déposée à la CNCM sous le numéro 1-4839 en date du 13 Mars 2014 et la seconde souche est la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4538 en date du 5 Octobre 201 1.
7. Procédé selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche de levure appartient au groupe des Saccharomyces, avantageusement Saccharomyces cerevisiae.
8. Procédé selon l'un des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la capacité de résistance à l'acide organique est testée sur un milieu comprenant du glucose.
9. Procédé selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche de levure sélectionnée ou obtenue présente une mutation à toutes les positions.
10. Procédé selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche de levure sélectionnée ou obtenue présente toutes les mutations.
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