JP2009178064A

JP2009178064A - エタノールの製造方法

Info

Publication number: JP2009178064A
Application number: JP2008018009A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Shimoii; 仁下飯; Ko Kure; 洪呉; Tomoko Watabe; 智子渡部
Original assignee: National Research Institute of Brewing
Current assignee: National Research Institute of Brewing
Priority date: 2008-01-29
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2009-08-13

Abstract

【課題】酵母の遺伝子破壊株を用いて、生産性高くエタノールを製造する方法を提供すること。
【解決手段】ユビキチン及びユビキチンシステム関連酵素からなる群より選択される少なくとも１種をコードする遺伝子が破壊されてなる、酵母の遺伝子破壊株を用いたエタノールの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、エタノールの製造方法に関する。さらに詳しくは、高発酵性酵母を用いた、清酒、ビール、ワイン等の酒類やバイオエタノール等を含むエタノールの製造方法に関する。

酒類や燃料用のバイオエタノールに含まれているエタノールは、一般に、ブドウ糖などの糖類をサッカロミセスに属する酵母で発酵させて製造する。

したがって、エタノール発酵において酵母細胞は高濃度のエタノールにさらされることになる。しかしながら、酵母細胞は高温や高濃度エタノールなどのストレス条件にさらされると、細胞内のタンパク質が変性し、その機能の一部又は全部を失うことがある。こうした変性タンパク質の存在は酵母細胞の生命維持にとって有害であるので、酵母細胞は変性タンパク質を取り除くシステムを持っており、ユビキチンが関与していることが知られている。

ユビキチンは変性タンパク質に結合して複合体を形成することにより、該複合体をプロテアソームや液胞で分解する際のシグナルとして働く。変性タンパク質にユビキチンを結合させ、それらを分解するシステムは一般にユビキチンシステムと呼ばれ、様々な遺伝子とそれらの産物であるタンパク質が関与していることが明らかになっている。例えば、ユビキチンをコードする遺伝子ＵＢＩ４、ユビキチン結合酵素をコードする遺伝子ＵＢＣ１３、ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子ＢＵＬ２、脱ユビキチン酵素をコードする遺伝子ＢＲＥ５、ＤＯＡ４、ＵＢＰ２、ＵＢＰ３及びＵＢＰ６などが例示される。従って、ユビキチンシステムの機能が異常になると、ストレス条件化で生成した変性タンパク質の除去が進行せず、ストレス条件化での生育に影響が表れ、例えば、非特許文献１では、ユビキチンシステムの変異株はストレス条件化での生育が遅いことが報告されている。
Finleyら、Cell、1987年、Vol.48、p.1035

酵母を用いたエタノール生産において、エタノール生産速度を上げ、また、最終的に得られるエタノール濃度を高くすることは、極めて重要であるが、酵母に突然変異を導入することにより得られた酵母の遺伝子破壊株を用いて高発酵性を獲得した例は知られていない。

本発明の課題は、酵母の遺伝子破壊株を用いて、生産性高くエタノールを製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、従来の知見から、酵母によるエタノール発酵には正常なユビキチンシステムが必要であると考え、そのことを証明するために、実験室酵母のユビキチン又はユビキチンシステム関連酵素の遺伝子を破壊した酵母の遺伝子破壊株を用いて清酒製造試験を行い、遺伝子破壊が清酒製造に与える影響を解析した。その結果、意外にも、ユビキチン又はユビキチンシステム関連酵素の遺伝子を破壊した酵母の遺伝子破壊株はいずれも、清酒醪において高い発酵性を示すことが判明した。そこで、本発明者らは、この現象は酵母のエタノール発酵性を改善させるために利用可能であると考え、ユビキチン又はユビキチンシステム関連酵素の遺伝子の破壊と清酒醪でのエタノール発酵についてさらに詳細な研究を行うことによって、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、ユビキチン及びユビキチンシステム関連酵素からなる群より選択される少なくとも１種をコードする遺伝子が破壊されてなる、酵母の遺伝子破壊株を用いたエタノールの製造方法に関する。

本発明により、酵母のエタノール発酵において、速いエタノール生産速度で、高濃度のエタノールを製造することができる。

本発明のエタノールの製造方法は、酵母を用いてエタノールを製造するものであって、前記酵母として、ユビキチン及びユビキチンシステム関連酵素からなる群より選択される少なくとも１種をコードする遺伝子が破壊されている酵母の遺伝子破壊株を用いることに大きな特徴を有する。

ユビキチンをコードする遺伝子としては、ＵＢＩ４が知られている。また、ユビキチンシステム関連酵素としては、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチンリガーゼ、脱ユビキチン酵素が挙げられ、ユビキチン結合酵素をコードする遺伝子としてはＵＢＣ１３が、ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子としてはＢＵＬ２、脱ユビキチン化酵素をコードする遺伝子としては、ＢＲＥ５、ＤＯＡ４、ＵＢＰ２、ＵＢＰ３及びＵＢＰ６が例示される。なお、これらの遺伝子は、ＳＧＤ（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＧｅｎｏｍｅＤａｔａｂａｓｅ）のホームページ（http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/）に配列が記載されており、かかる配列に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計して遺伝子破壊や部位特異的変異を行うことができる。例えば、ＵＢＩ４を破壊するために用いるＤＮＡのプライマーとしては、ＵＢＩ４−１（配列表の配列番号１）、ＵＢＩ４−２（配列表の配列番号２）等が例示される。

本発明における酵母とはサッカロミセスに属するエタノール発酵に用いることのできる酵母であって、例えば、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、焼酎酵母、及びパン酵母が挙げられる。なかでも、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、及びパン酵母が好ましく、実験室酵母としては、サッカロミセス・セレビシエに属する二倍体酵母であるＢＹ４７４３株、Ｘ２１８０株が好ましい。

本明細書において「破壊」とは、破壊される遺伝子の機能を喪失させたり、失活させたりするような遺伝子操作のことをいい、目的遺伝子領域の全遺伝子を喪失させる遺伝子操作や、目的遺伝子領域中の機能発現に関連する部位について少なくとも１個の塩基、好ましくは２〜10個の塩基を欠失又は変異させる遺伝子操作のことをいう。具体的には、ユビキチンをコードする遺伝子においてはＵＢＩ４遺伝子を全喪失させる遺伝子操作、ユビキチン結合酵素をコードする遺伝子においてはＵＢＣ１３遺伝子を全喪失させる遺伝子操作、ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子おいてはＢＵＬ２遺伝子を全喪失させる遺伝子操作、脱ユビキチン化酵素をコードする遺伝子においてはＢＲＥ５、ＤＯＡ４、ＵＢＰ２、ＵＢＰ３及びＵＢＰ６のいずれかの遺伝子を全喪失させる遺伝子操作が例示される。かかる遺伝子操作を行う方法としては、特に限定はなく公知の方法を用いることができ、例えば、変異剤処理による突然変異、遺伝子工学を用いた遺伝子破壊、遺伝子工学を用いた部位特異的変異などが挙げられる。なお、本発明においては、自然突然変異により破壊が生じた遺伝子破壊株も用いることができる。

なお、上記遺伝子操作を行う際には、アミノ酸などの栄養要求マーカーや薬剤に対する耐性マーカーなどを選択マーカーとして使用してもよい。

かくして、ユビキチン及びユビキチンシステム関連酵素からなる群より選択される少なくとも１種をコードする遺伝子が破壊されている酵母の遺伝子破壊株が得られるが、本発明においては、かかる酵母として、市販のものを使用することができる。

好適な市販品としては、サッカロミセス・セレビシエ二倍体酵母ＢＹ４７４３株のＵＢＩ４遺伝子破壊株（ＵＢＩ４遺伝子が全喪失された株）、ＢＵＬ２遺伝子破壊株（ＢＵＬ２遺伝子が全喪失された株）、ＵＢＣ１３遺伝子破壊株（ＵＢＣ１３遺伝子が全喪失された株）、ＢＲＥ５遺伝子破壊株（ＢＲＥ５遺伝子が全喪失された株）、ＤＯＡ４遺伝子破壊株（ＤＯＡ４遺伝子が全喪失された株）、ＵＢＰ２遺伝子破壊株（ＵＢＰ２遺伝子が全喪失された株）、ＵＢＰ３遺伝子破壊株（ＵＢＰ３遺伝子が全喪失された株）、ＵＢＰ６遺伝子破壊株（ＵＢＰ６遺伝子が全喪失された株）（いずれも、インビトロジェン社より入手可能）が挙げられる。なお、これらの遺伝子破壊株の作成方法については、Saccharomyces Genome Deletion Projectのホームページ（http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html）に記載されている。

また、ＵＢＩ４遺伝子破壊株の代表株は、ＹＨＳ１３２７と命名、表示され、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにＮＩＴＥＡＰ−４６９（受領番号）として寄託されている。

本発明は、上記で得られた酵母の遺伝子破壊株を用いてエタノールを製造するが、酵母が特定のものである以外は、公知の方法を用いて、エタノールを製造することができる。

本発明は、清酒、ビール、ワイン等の酒類やバイオエタノール等を含むエタノールの製造に適用することができるが、用いる酵母の遺伝子破壊株が高発酵性であることから、清酒の製造に好適に用いられる。

以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。

実施例１
親株であるサッカロミセス・セレビシエ二倍体酵母ＢＹ４７４３、及び遺伝子破壊株（ＵＢＩ４、ＢＵＬ２、ＵＢＣ１３、ＢＲＥ５、ＤＯＡ４、ＵＢＰ２、ＵＢＰ３、ＵＢＰ６）をインビトロジェン社から入手し、以下に示す方法で清酒を製造した。

清酒仕込みは各株について３回繰り返した。仕込み試験には、掛米として精白歩合70％のアルファー米を120g、麹として精米歩合70％の乾燥麹46g、汲水400mL及び乳酸160μLを添加した。各酵母はＹＰＤ培地（イーストエキス1重量％、ペプトン2重量％、ブドウ糖2重量％含有）中において30℃で一夜振盪培養した後、酵母数が2.0×10⁷cell/mLになるように醪に添加した。発酵温度は15℃として、仕込み後２０日目で上槽した。酵母を添加後、毎日重量を測定することにより、重量減少分を発酵に伴う二酸化炭素発生量として求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。結果を図１に示す。また、酵母添加後２０日目には、遠心分離によって回収した清酒におけるエタノール濃度を測定し、各株について平均エタノール濃度を算出した。また、得られた平均エタノール濃度について、親株における濃度に対する遺伝子破壊株における濃度の有意差検定も同時に行った。結果を表１に示す。なお、エタノール濃度の測定は、アルコール濃度計（ＹＳＡ−２００、矢崎計器株式会社製）を用いて行った。

いずれの遺伝子破壊株も親株に比べて、二酸化炭素発生量が多くエタノール発酵速度が速く（図１）、また、最終的なエタノール濃度も高く（表１）、生産性に優れることが分かった。エタノール濃度について平均値の差の検定を行った結果、いずれの遺伝子破壊株も親株と比較して1％未満の危険率で有意であった。

実施例２
サッカロミセス・セレビシエ二倍体酵母Ｘ２１８０株の２個のＵＢＩ４遺伝子を両者共に破壊した株を作製し、清酒製造試験を行った。なお、Ｘ２１８０株はAmerican Type Culture Collection （ATCC）からＡＴＣＣ26109として入手可能である。

〔遺伝子破壊株の作製〕
Ｘ２１８０株の遺伝子破壊はマーカー遺伝子としてkanMX及びnat1を用いて行った。Ｘ２１８０株は二倍体であることから、１コピー目のＵＢＩ４をkanMXをマーカーとして遺伝子破壊した。kanMXを含むプラスミドｐＵＧ６（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから入手可能、http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html）を鋳型として、プライマーＵＢＩ４−１（配列表の配列番号１）及びＵＢＩ４−２（配列表の配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、マーカーであるkanMXの両側に、ＵＢＩ４のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡを持つＤＮＡを作製した。このＤＮＡを用いてＸ２１８０株を形質転換して、ジェネティシン含有培地で増殖した酵母を形質転換体１とした。形質転換体１からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＵＢＩ４−３（配列表の配列番号３）及びＵＢＩ４−４（配列表の配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、１コピー目のＵＢＩ４が遺伝子破壊されていることを確認した。

次に２コピー目のＵＢＩ４をnat1をマーカーとして遺伝子破壊した。nat1を含むプラスミドｐＡＧ２５（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから入手可能、http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html）を鋳型として、ＵＢＩ４−１（配列表の配列番号１）及びＵＢＩ４−２（配列表の配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、マーカーであるnat1の両側に、ＵＢＩ４のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡを持つＤＮＡを作製した。このＤＮＡを用いて上記で得られた形質転換体１を形質転換して、nourseothricin 含有培地で増殖した酵母を形質転換体２とした。形質転換体２からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＵＢＩ４−３（配列表の配列番号３）及びＵＢＩ４−４（配列表の配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、２コピー分のＵＢＩ４が遺伝子破壊されていることを確認し、これをＸ２１８０株のＵＢＩ４遺伝子破壊株とし、ＹＨＳ１３２７と命名した。

〔清酒の製造〕
親株であるＸ２１８０、及び上記で得られたＵＢＩ４遺伝子破壊株を用いて、以下に示す方法で清酒を製造した。

仕込み試験には、掛米として精白歩合70％のアルファー米、麹として精米歩合70％の乾燥麹を用いて、表２の仕込配合による三段仕込（添仕込、仲仕込、留仕込）を行った。なお、添仕込の際には乳酸389μLを添加した。各酵母はＹＰＤ培地（イーストエキス1重量％、ペプトン2重量％、ブドウ糖2重量％含有）中において30℃で一夜振盪培養した後、酵母数が2.0×10⁷cell/mLになるように醪に添加した。発酵温度は15℃として、仕込み後２０日目で上槽した。酵母を添加後、毎日重量を測定することにより、重量減少分を発酵に伴う二酸化炭素発生量として算出した。結果を図２に示す。また、酵母添加後２０日目には、遠心分離によって回収した清酒におけるエタノール濃度を測定した。なお、エタノール濃度の測定は、実施例１と同様にして行った。

その結果、ＵＢＩ４遺伝子破壊株は親株のＸ２１８０に比べて、エタノール発酵速度が速く（図２）、また、最終的なエタノール濃度も、親株が14.9％、遺伝子破壊株が16.9％であり、ＵＢＩ４遺伝子破壊株の方が高かった。これより、遺伝子破壊される酵母が異なったとしても、破壊される遺伝子がユビキチンをコードする遺伝子であれば、発酵性の高い遺伝子破壊株が得られることが分かる。

本発明の製造方法は、清酒、ビール、ワイン等の酒類やバイオエタノール等を含むエタノールの製造に好適に用いられる。

図１は、親株であるサッカロミセス・セレビシエ二倍体酵母ＢＹ４７４３（Ｗｉｌｄ）、及び遺伝子破壊株（ＵＢＩ４、ＢＵＬ２、ＵＢＣ１３、ＢＲＥ５、ＤＯＡ４、ＵＢＰ２、ＵＢＰ３、ＵＢＰ６）を用いて清酒製造を行った際の二酸化炭素発生量を示す図である。図２は、親株であるサッカロミセス・セレビシエ二倍体酵母Ｘ２１８０、及び同株のＵＢＩ４遺伝子破壊株（ＹＨＳ１３２７）を用いて清酒製造を行った際の二酸化炭素発生量を示す図である。

配列表の配列番号１は、ＵＢＩ４破壊用ＤＮＡ作製用プライマーである。
配列表の配列番号２は、ＵＢＩ４破壊用ＤＮＡ作製用プライマーである。
配列表の配列番号３は、ＵＢＩ４増幅用プライマーである。
配列表の配列番号４は、ＵＢＩ４増幅用プライマーである。

Claims

ユビキチン及びユビキチンシステム関連酵素からなる群より選択される少なくとも１種をコードする遺伝子が破壊されてなる、酵母の遺伝子破壊株を用いたエタノールの製造方法。
ユビキチンシステム関連酵素がユビキチン結合酵素である、請求項１記載の製造方法。
ユビキチンシステム関連酵素がユビキチンリガーゼである、請求項１記載の製造方法。
ユビキチンシステム関連酵素が脱ユビキチン酵素である、請求項１記載の製造方法。
酵母が、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、及びパン酵母からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜４いずれか記載の製造方法。
実験室酵母がＢＹ４７４３株又はＸ２１８０株である、請求項５記載の製造方法。
エタノールが清酒である、請求項１〜６いずれか記載の製造方法。