KR101249778B1

KR101249778B1 - 저온 내성을 갖는 효모 변이체

Info

Publication number: KR101249778B1
Application number: KR1020100138957A
Authority: KR
Inventors: 송기원
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2013-04-01
Also published as: KR20120077120A

Abstract

본 발명은 STM1 유전자, SRO9 유전자 및 YKL075C 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는 저온에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법 및 효모 변이체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 STM1 유전자, SRO9 유전자 및 YKL075C 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 유전자가 불활성화 되어 저온에서 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체에 관한 것이다. 저온 내성을 갖는 본 발명의 변이체는 외부 온도 변화에 덜 민감하게 안정적으로 생장할 수 있어, 효모의 다양한 응용 분야 예컨대 식품, 의약, 사료, 화장품 등의 분야에 이용하여 생산원가를 절감할 수 있다.

Description

저온 내성을 갖는 효모 변이체{Yeast Variants Having Resistance to Low Temperatures}

본 발명은 저온 내성을 갖는 효모 변이체에 관한 것이다.

낮은 생장온도는 대부분의 세포에서 단백질 해독(translation) 효율 감소, 단백질의 3차구조 형성 능력 감소, 세포막의 기능을 조절하는 유동성(fluidity) 감소, DNA의 이중나선구조나 RNA의 2차구조의 불안정성 초래, 및 단백질 효소 활성의 감소 등 여러 가지 생화학 및 생리적인 변화를 야기한다. 대부분의 유기체는 진화과정에서 이러한 낮은 온도에 의해 유발되는 변화에 적응할 수 있는 기전을 발달시켜왔으나 아직 유전자 수준에서 그 기전이 잘 규명되어 있지는 않다.

출아형 효모는 진핵세포의 매우 좋은 모델생물체이며 주조, 식품, 의약, 사료, 화장품 등의 분야에 널리 사용되는 미생물이다.

산업적인 수요가 높은 출아형 효모 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)에서 낮은 온도에 반응하여 적응하는데 필요한 몇몇 유전자들이 알려져 있으나, 전반적인 기전과 전체 유전체 수준에서의 유전자 발현 조절에 대해서는 최근에야 본격적인 연구가 진행되고 있다.

낮은 온도에 노출된 출아형 효모의 전체 유전자 발현에 관하여 현재까지 밝혀진 연구 결과는 다음과 같다. 1) 생장 온도의 감소는 전사(transcription) 및 해독(translation)에 관련된 여러 가지 유전자들의 발현을 유도한다. 이러한 유전자들 중에 일부는 저온-민감성 표현형(cold-sensitivity phenotype)으로 나타난다. 2) 낮은 온도에 노출된 효모는 냉동 손상(freeze injury)의 영향을 최소화하기 위해 트레할로오스, 글라이세롤 및 열충격단백질의 축적을 유도한다. 3) 세포막 유동성이 저온 충격 반응을 유발하는 초기 시그널로 작용하며 이러한 신호는 고삼투압 글라이세롤 유사분열물질-활성화 단백질 키나아제 경로와 전통적인 스트레스 경로와 Msn2/4p와 같은 전사인자에 의해 변환되고 조절된다(Jaime, A et al., FEMS Microbiol Rev. 31:327-341(2007)). 또한, 낮은 온도로 인해 대사 속도가 느려진 상황에서 일정 기간 견딜 수 있는 능력을 확인한 결과 초기 대사 과정에 관련된 93개의 유전자를 제거시켰을 때 저온 상태에서 58개월 이상 생존 하는 것을 보였다 (Lucie, P et al., AGING. 1:957-960(2009)). 특히, 출아형 효모 세포가 낮은 온도에 적응하기 위해 외부의 자극에 대해 세포막을 보호하는데 매우 중요한 역할을 하는 트레할로오스를 합성하는데 필요한 효소 Tps1을 제거하고 Hsp12(heat shock protein 12)를 과발현 시킨 경우 저온에서 생장이 유지되는 것이 밝혀졌다. 이를 통해 Hsp12 또한 냉동 내성에서 중요한 역할을 하는 것이 규명되었다(Pacheco, A et al., Microbiololy. 155:2021-2028(2009)). 저온에서 적응 기능을 수행하는 유전자들이 없는 경우에 세포는 생장온도의 변화에 적응하지 못하여 저온에서의 생장과 생존이 급격히 감소하게 된다.

발효 등 여러 공정에 중요한 출아형 효모의 생장을 낮은 온도에서 촉진시켜 생장 및 배양의 효율성을 급격히 증가시키고, 동일한 생장 효율 하에서 발효 온도를 낮추어 산업적으로 생산원가를 절감시킬 수 있는 기전과 방법에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

본 발명자는 NST1 유전자 활성을 제거하였을 때 저온에서 생장이 촉진되는 것을 규명하여 보고한 바가 있다(대한민국 특허 제 10-0719465호). NST1은 세포가 복제되는 세포주기(cell cycle)의 G1/S 전이를 억제시켜 세포생장을 조절하는 기능을 하는 유전자로, 상기 유전자의 기능이 불활성화 되면 저온에서 생장이 둔화되는 정상세포와 달리 저온 상태에 반응하지 못하고 생장을 유지하였다. 이러한 발명을 더욱 발전시키기 위해 NST1과 상호 작용을 통해 저온에서 생장을 유지하는 다른 유전자를 찾고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

상술한 종래기술의 배경 하에서, 본 발명자는 NST1과 상호 작용을 통해 저온에서 생장이 억제되지 않는 유전자를 발견함으로써 온도에 반응하여 생장을 조절하는 특정 복합체의 존재를 제안하고 상기의 효모 변이주를 제작하고자 하였다. 본 발명의 STM1, SRO9, YKL075C 유전자는 NST1 유전자와 유전자 레벨에서 상호 작용하며 STM1, SRO9, YKL075C를 제거시킬 경우 저온에서도 효모가 정상적인 속도로 생장하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 저온에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 저온에서 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 저온에서 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 STM1 유전자, SRO9 유전자 및 YKL075C 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는 저온에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 STM1 유전자, SRO9 유전자 및 YKL075C 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는 저온에서 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 STM1 유전자, SRO9 유전자 및 YKL075C 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 유전자가 불활성화 되어 저온에서 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체를 제공한다.

본 발명은 식품, 의약, 사료, 화장품 등의 분야에 널리 사용되는 효모에서 저온에서도 생장이 억제되지 않는 시스템을 구현하기 위한 것이다. 본 발명자는 STM1, SRO9, YKL075C이 세포 주기 조절에 관여하는 유전자인 NST1과 상호 작용함을 밝히고 이를 유전학적으로 조작하여 본 발명을 구현하였다.

NST1은 출아형효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 유전자로, 세포주기의 G1/S 전이를 억제시켜 세포생장을 조절하는 기능을 하며, 이 유전자의 기능이 불활성화 되면 저온 상태에 반응하지 못하고 생장을 유지한다. 본 발명자는 상기 발명의 범위를 확장하기 위해 탠덤 친화도 정제(tandem affinity purification; TAP) 방법을 통하여 NST1과 상호 작용하는 (NST1과의 상호 작용에 가능성이 있는) 다양한 유전자들을 찾아내었다. 상기 유전자들 중 컴퓨터 생물학(computational biology)을 통하여 NST1과 직접적으로 상호 작용하는 유전자들을 선택하여 STM1, SRO9, YKL075C 유전자를 도출하였다.

본 발명의 기본적인 전략은 다양한 효모에서 발견되는 STM1 유전자, SRO9 유전자 및 YKL075C 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 유전자를 불활성화 시키는 것이다.

STM1은 효모에서 영양 스트레스 하에서의 최적 해독에 필요하고 텔로미어 구조를 유지하는 데 필요한 단백질로 알려져 있다(Carmody SR, et al. Mol Cell Biol. 30(21):5168-79(2010); Ossareh-Nazari B, et al. EMBO Rep, 2010 Jul. PMID 20508643; Cuenca-Bono B, et al. BMC Cell Biol, 2010 Mar 15. PMID 20230609; Kaake RM, et al. J Proteome Res, 2010 Apr 5. PMID 20170199).

SRO9는 해독 과정의 라이보좀과 상호작용하는 세포질 RNA-결합 단백질로서, 액틴 필라멘트의 조직화에 관여하는 것으로 알려져 있다(Ossareh-Nazari B, et al. EMBO Rep, 2010 Jul. PMID 20508643; Gong Y, et al. Mol Syst Biol, 2009. PMID 19536198; Wilmes GM, et al. Mol Cell, 2008 Dec 5. PMID 19061648; Hasegawa Y, et al. RNA, 2008 Nov. PMID 18805955).

YKL075C는 2010년 현재까지 기능이 거의 규명되지 않은 단백질로서 스트렙토조토신 및 캠포테신에 대한 내성에 관여하는 것으로 추정되고 있으며, 세포질 단백질로 추정되고 있다(Yu H, et al. Science, 2008 Oct 3. PMID 18719252; Lee W, et al. PLoS Genet, 2005 Aug. PMID 16121259).

본 발명자는 STM1, SRO9, YKL075C이 제거되어 불활성화된 변이체를 제조하고 정상세포는 18℃에서 느린 생장이 일어나는 반면, STM1, SRO9, YKL075C 유전자가 제거된 변이체는 온도와 상관없이 정상적인 생장함을 발견하였다. 이를 통하여, 본 발명자는 STM1, SRO9, YKL075C 이 NST1과 상호작용 하는 유전자로, 상기 유전자들의 기능이 불활성화되면 저온에서 생장이 둔화되는 정상세포와 달리 저온 상태에 반응하지 못하고 생장을 유지함을 규명하였다.

불활성화 대상이 되는 STM1, SRO9 및 YKL075C는 다양한 효모에서 발견되고 동종되었다. 하기의 실시예에서는 사카로마이세스 세레비시애의 STM1, SRO9 및 YKL075C이 예시되어 있다.

사카로마이세스 세레비시애의 STM1은 GenBank 접근번호 NC_001144.4 및 NM_001182037.1에 예시되어 있다. 이외에도 다양한 STM1이 본 발명에 포함된다. 예를 들어, GenBank 접근번호 NC_003424.3 및 NM_001020024.1(Schizosaccharomyces pombe), GenBank 접근번호 CP000500.1(Pichia stipitis), GenBank 접근번호 XM_445725.1(Candida glabrata)에 개시된 STM1이 본 발명에서 불활성화 대상이 될 수 있다.

사카로마이세스 세레비시애의 SRO9은 GenBank 접근번호 NC_001135.4 및 NM_001178682.1에 예시되어 있다. 이외에도 다양한 SRO9이 본 발명에 포함된다. 예를 들어, GenBank 접근번호 NC_006029.1 및 XM_446001.1(Candida glabrata), GenBank 접근번호 NC_005787.5(Ashbya gossypii)에 개시된 SRO9이 본 발명에서 불활성화 대상이 될 수 있다.

사카로마이세스 세레비시애의 YKL075C은 GenBank 접근번호 NC_001143.8 및 NM_001179641.1에 예시되어 있다. 이외에도 다양한 YKL075C이 본 발명에 포함된다. 예를 들어, GenBank 접근번호 NC_006035.2 및 XM_448994.1(Candida glabrata), GenBank 접근번호 NC_005785.5(Ashbya gossypii)에 개시된 SRO9이 본 발명에서 불활성화 대상이 될 수 있다.

본 명세서에서 STM1, SRO9 및 YKL075C을 언급하면서 사용되는 용어, “불활성화(inactivation)”란 유전자의 전사 또는 해독, 유전자 산물의 활성의 손상(impairment)을 초래하는 STM1, SRO9 및 YKL075C의 지놈 상에서의 변형(modifications)을 의미한다. 이런 유전자 변형은 STM1, SRO9 및 YKL075C 코딩 서열의 불활성화뿐만 아니라 이의 프로모터의 불활성화도 포함될 수 있다. 효모 지놈 상에서 목적한 유전자만의 특이적 불활성화는 코딩하는 유전자의 전체 또는 하나 이상의 부분 영역에서 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시킴으로서 가능하다. 예들 들어, 유전자의 결실 및 유전자로의 이형 서열(heterogenous sequence)의 삽입은 유전자의 절단(truncation), 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutation), 미스센스 돌연변이(missense mutation) 등을 초래할 수 있다. 이러한 유전자의 특이적 불활성화는 당 분야에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, STM1, SRO9 및 YKL075C을 불활성화시키는 단계는 STM1, SRO9 및 YKL075C 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시켜 실시된다.

본 명세서에서 STM1, SRO9 및 YKL075C을 언급하면서 사용되는 용어, “결실(deletion)”은 STM1, SRO9 및 YKL075C의 기능을 상실케 하는 모든 결실 변이를 포함하는 의미를 갖는다. 예를 들어, STM1, SRO9 및 YKL075C 유전자의 결실은 STM1, SRO9 및 YKL075C 코딩 서열의 부분 결실 또는 전체 결실을 모두 포함한다.

이러한 NST1 코딩 서열의 결실은 당업계에 공지된 다양한 변이유발(mutagenesis) 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예컨대, STM1, SRO9 및 YKL075C 코딩 서열의 결실은 PCR 돌연변이유발법 또는 카세트 돌연변이유발법으로 실시할 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 STM1, SRO9 및 YKL075C 코딩 서열의 결실은 상동재조합(homologous recombination)에 의해 실시된다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상동재조합에 의한 유전자 타겟팅(gene targeting)으로 지놈상의 각 STM1, SRO9, YKL075C 유전자를 선별마커 유전자로 치환하는 돌연변이를 유발한다. 특정 유전자의 코딩부분(ORF: open reading frame)의 윗부분(upstream)과 아랫부분(downstream)에 해당하는 염기서열이 동일하고, 중간부분에는 선별마커 유전자를 갖는 DNA 절편을 세포내로 전이시키면 상동재조합이 유도되어 지놈의 특정 유전자와 교차(cross-over)가 유도된다. 이때 상동재조합이 한 번만 일어나면 DNA 절편이 지놈의 STM1, SRO9, YKL075C 유전자 내로 삽입되고, 각각의 유전자 코딩부분의 앞과 뒤에서 각각 상동재조합이 유발되면 지놈상의 STM1, SRO9, YKL075C 유전자는 DNA 절편과 핵산교환이 일어나 DNA 절편 내의 선별마커인 이형 유전자가 대신 삽입되게 된다. 이때 통상적으로 사용되는 선별마커(selection marker)는 특별히 제한되지 않는다. 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 하기 실시예에서는 배지에 트립토판(tryptophan)이 없어도 자랄 수 있게 하는 트립토판 생합성 유전자 TRP1 (N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase)을 선별마커로 이용하였다. 상기 DNA 절편의 효모 내 도입 방법은 핵산을 세포내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션(electroporation), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 방법 등이 있고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명이 적용되는 효모는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces), 사이조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아(Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스(Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula) 속(genus)에 속하는 효모이고, 보다 바람직하게는 사카로마이세스에 속하는 효모이고, 가장 바람직하게는 사카로 마이세스 세레비시애이다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 변이주는 기탁번호 제KCCM-11108P호로 기탁된 Saccaromyces cerevisiae YSK2835 변이주, 기탁번호 제KCCM-11109P호로 기탁된 Saccaromyces cerevisiae YSK2836 변이주, 그리고 기탁번호 제KCCM-11110P호로 기탁된 Saccaromyces cerevisiae YSK2837 변이주이다.

본 발명의 방법에 의해 효모의 저온 생장능이 크게 개선된다.

본 명세서에서 용어 “저온 생장능”은 바람직하게는 25℃ 이하, 보다 바람직하게는 18℃ 이하의 온도에서의 생장능을 의미한다. 이 경우 저온 생장능과 관련된 하한(upper) 온도는 5℃, 보다 바람직하게는 8℃, 보다 바람직하게는 10℃이다.

본 명세서에서 본 발명의 효모 변이체를 언급하면서 사용되는 표현 “저온에서의 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체”는 야생형 효모와 비교하여 저온에서의 생장능이 증가된 효모 변이체를 의미하며, 이러한 효모 변이체는 저온에서 야생형 효모의 최적 온도(예컨대, 30℃)에서의 생장과 실질적으로 동일한 생장곡선을 나타낸다.

본 발명의 변이주는 현재 발효공학의 장애로 여겨지고 있는 저온에서의 효모 생장 둔화 및 낮은 생산성을 극복할 수 있다.

본 발명의 효모 변이주를 식품, 의약, 사료, 화장품 등의 분야에 이용하여 생산원가를 절감할 수 있다. 상기 변이주를 그대로 이용하거나 목적에 따라서는 본 발명의 변이주를 모균주로 사용하여 추가의 변이를 유도할 수 있다. 예들 들어, 생합성의 대사조절 기작을 인위적으로 변이시키거나, 의약, 산업적으로 사용되는 단백질을 과발현하도록 변이시킬 수 있다. 본 발명의 저온에서 생장이 촉진되는 변이주를 이용한 다양한 변형은 당 분야의 전문가에 의해 통상적인 방법으로 이루어질 수 있다.

구체적인 예시로서, 본 발명의 변이주를 포도주, 맥주 등과 같은 알코올, 주류 제조 및 간장, 된장, 빵, 치즈, 요구르트, 식초 등과 같은 발효식품제조에 이용할 수 있다. 또한, 항생물질과 항암물질의 생산, 유기산 발효공업, 아미노산 발효공업, 단백질 생산공업, 균체제조 등에 이용할 수 있다. 유기산 발효공업의 대표적인 생산물질은 시트르산(구연산), 젖산, 초산으로, 시트르산은 청량음료의 제조원료로 사용되고 젖산은 식품공업, 음료, 피혁공업, 의약 등에 사용되고 있고, 아세트산은 주로 식용에 사용된다. 또한, 본 발명의 변이주를 메탄발효, 폐액처리, 공해방지, 탈황, 채광 등에 이용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명에 따르면 효모의 STM1 유전자, SRO9 유전자 및 YKL075C 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 유전자를 불활성화하여 저온에서의 효모의 생장 능력을 크게 증가시킨다.

(b) 저온 내성을 갖는 본 발명의 변이체는 외부 온도 변화에 덜 민감하게 안정적으로 생장할 수 있어, 효모의 다양한 응용 분야 예컨대 식품, 의약, 사료, 화장품 등의 분야에 이용하여 생산원가를 절감할 수 있다.

도 1은 염색체에서 STM1, SRO9, YKL075C 각각의 유전자를 제거하기 위한 DNA절편 합성에 주형(template)로 사용된 pFA6a-TRP1 유전자 결손 카세트를 도시화 한 것이다.
도 2는 출아형효모 야생형과 STM1 제거 변이체(stm1), SRO9 제거 변이체(sro9), YKL075C 제거 변이체(YKL075C)의 동일한 개수의 세포를 10 배씩 희석하여 점적한 후 플레이트에서 3일 동안 18°C(저온), 30°C로 배양온도를 달리하며 배양한 결과를 나타낸다.
도 3는 동일한 수의 출아형효모 야생형과 STM1 제거 변이체 (stm1)를 18°C(저온), 30°C에서 64 시간까지 배양하면서 매 8시간마다 세포의 개수를 측정하여 생장을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 동일한 수의 출아형효모 야생형과 SRO9 제거 변이체 (sro9)를 18°C(저온), 30°C에서 64 시간까지 배양하면서 매 8시간마다 세포의 개수를 측정하여 생장을 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 동일한 수의 출아형효모 야생형과 YKL075C 제거 변이체 (YKL075C)를 18°C(저온), 30°C에서 64 시간까지 배양하면서 매 8시간마다 세포의 개수를 측정하여 생장을 비교한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 효모배양 조건과 각 유전자 불활성화 변이체 제조

(1) 효모 배양 조건

효모 야생형의 경우, 효모 생장의 최적조건인 YPAD 배지 또는 선택배지에서 배양하였다. YPAD 배지의 조성은 1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤, 100 μg/ml 아데닌 및 2% 덱스트로오스로 구성되어 있다. 선택배지(Synthetic Complete (SC) medium)는 2 X SC 배지 1 L을 기준으로 효모 질소 베이스 13.4 g, 암모늄 설페이트10 g, 20 종의 아미노산 혼합물 4 g 및 200 mM 이노시톨 2 ml을 넣어 제조하였다.

각 유전자의 불활성화 변이체를 선별하여 배양하기 위하여 SC drop-out 배지를 사용하였다. 각 유전자의 불활성화 변이체는 선별마커로 트립토판 생합성에 필요한 TRP1(N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase) 유전자를 갖게 되므로 기본 선택배지에 이러한 변이체 효모를 선별하기 위해 트랍토판을 제외한 배지(SC-Trp)를 이용한다. 효모 야생형의 경우 아미노산 혼합물 중 트립토판이 제외된 선택배지에서는 성장할 수 없고, 선택마커를 가지고 있는 STM1, SRO9, YKL075C 불활성화 변이체만이 이 배지에서 생장하는 특징을 가지고 있다.

(2) STM1 불활성화 변이체

효모에서 STM1 유전자를 제거하여 불활성화시키기 위해서 상동재조합(homologous recombination)에 의한 유전자 타겟팅(gene targeting)으로 지놈 상의 STM1 유전자를 선별마커 유전자로 치환하는 방법을 사용하였다.

pFA6a-TRP1 유전자 결손 카세트(EUROSCARF; EUROpean Saccharomyces Cerevisiae Archive for Functional analysis, 물질이전양식을 작성하고 제공받음; Longtine, M.S. et al., Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14:953-961(1998))(참조: 도 1)로부터 TRP1 인코딩 영역을 STM1 유전자 ORF의 상부(upstream)와 상동서열을 가지는 프라이머(KS1209: 표 1 참조)와 ORF의 하부(downstream)와 상동부분을 가진 프라이머(KS1210: 표 1 참조)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하였다. 증폭된 TRP1을 포함하고, TRP1의 양쪽으로 STM1 유전자 ORF의 상부 영역(63-19 base ; 45 base에 해당)에 상동인 서열과 STM1 유전자 ORF의 하부 영역(93-136 base ; 44 base에 해당)과 상동인 서열을 갖는 증폭된 DNA 절편을 야생형 효모(w303a; MATa ade2-1 ura3-1 trp1-1 leu2-3, 112 his3-11, 15 can1-100; ATCC))에 리튬 아세테이트(LiAc) 방법으로 전이시켜 형질전환을 유도하였다. 형질전환은 야생형 효모(w303a)를 대수기인 3 X 10⁷ cells/ml(mid-log phase)가 되도록 배양한 후, 0.1 M LiAc를 처리하고, 형질전환 혼합물(50% PEG, 1 M LiAc, 단일가닥 DNA 2 mg/ml)와 전이시키고자 하는 DNA 절편을 효모에 섞어준 후, 30°C에서 1시간 배양하고 42°C에서 30분 배양하는 효모에서 일반적으로 널리 통용되는 방법을 이용하였다. 상기 효모세포를 SC drop-out(-Trp) 플레이트에 도말하고 30℃에서 2-3일 배양하였다. STM1 유전자 코딩부분(ORF: open reading frame)의 윗부분(63-19 bp upstream)과 아랫부분(93-136 bp downstream)에서 각각 상동재조합이 유발되어 지놈 상의 STM1 유전자가 DNA 절편 내의 선별마커인 TRP1으로 치환된 STM1 불활성화 변이체는 TRP1이 발현되므로 트립토판이 없는 배지(SC-Trp media)에서 생장할 수 있다.

제조된 STM1 불활성화 변이주를 Saccaromyces cerevisiae YSK2835 로 명명하였으며 이 변이주는 아래의 유전형질을 갖는다: YSK2835 Saccaromyces cerevisiae (MATa ura3-1 trp1-1 ade2-3 leu2-3 112his3-11,15 △stm1::TRP1)

상기 제조된 Saccaromyces cerevisiae YSK2835 변이주를 2010년 10월 7일에 KCCM(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁하고 기탁번호 제KCCM-11108P호를 부여받았다.

표 1은 Saccaromyces cerevisiae YSK2835 변이체 제조에 사용된 프라이머를 나타낸다.

^*밑줄 그은 서열은 STM1 유전자 코딩부분(ORF: open reading frame)의 윗부분(63-19 bp upstream)과 아랫부분(93-136 bp downstream)에 해당하는 44-45 베이스와 상동부분(44-45 mer)

^*굵은 글씨체의 서열은 도 1의 카세트 중 TRP1의 PCR을 위해 사용된 상동부분(20 mer)

(3) SRO9 불활성화 변이체

효모에서 SRO9 유전자를 제거하여 불활성화시키기 위해서 상동재조합(homologous recombination)에 의한 유전자 타겟팅(gene targeting)으로 게놈상의 SRO9 유전자를 선별마커 유전자로 치환하는 방법을 사용하였다. pFA6a-TRP1 유전자 결손 카세트(EUROSCARF; EUROpean Saccharomyces Cerevisiae Archive for Functional analysis, 물질이전양식을 작성하고 제공받음; Longtine, M.S. et al., Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14:953-961(1998))(참조: 도 1)로부터 TRP1 인코딩 부위를 SRO9 유전자 ORF의 상부(upstream)와 상동서열을 가지는 프라이머(KS1214: 표 2 참조)와 ORF의 하부(downstream)와 상동부분을 가진 프라이머(KS1215: 표 2 참조)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하였다. 증폭된 TRP1을 포함하고, TRP1의 양쪽으로 SRO9 유전자 ORF의 upstream 영역(69-27 base ; 43 base에 해당)에 상동인 서열과 SRO9 유전자 ORF의 downstream 영역(1-44 base ; 43 base에 해당)과 상동인 서열을 갖는 증폭된 DNA 절편을 야생형 효모(w303a)에 lithiume acetate(LiAc) 방법으로 전이시켜 형질전환을 유도하였다. 형질전환은 야생형 효모(w303a)를 log phase인 3X10⁷ cells/ml(mid-log phase)가 되도록 배양한 후, 0.1 M LiAc를 처리하고, transformation mix(50% PEG, 1 M LiAc, single-strand DNA 2 mg/ml)와 전이시키고자 하는 DNA 절편을 yeast에 섞어준 후, 30°C에서 1시간 배양하고 42°C에서 30분 배양하는 효모에서 일반적으로 널리 통용되는 방법을 이용하였다. 상기 효모세포를 SC drop-out (-Trp) plate에 도말하고 30°C에서 2-3일 배양하였다. SRO9 유전자 코딩부분(ORF: open reading frame)의 윗부분(69-27 bp upstream)과 아랫부분(1-44 bp downstream)에서 각각 상동재조합이 유발되어 게놈상의 SRO9 유전자가 DNA 절편 내의 선별마커인 TRP1으로 치환된 SRO9 불활성화 변이체는 TRP1이 발현되므로 트립토판이 없는 배지(SC-Trp media)에서 생장할 수 있다.

제조된 SRO9 불활성화 변이주를 Saccaromyces cerevisiae YSK2836 로 명명하였으며 이 변이주는 아래의 유전형질을 갖는다: YSK2836 Saccaromyces cerevisiae (MATa ura3-1 trp1-1 ade2-3 leu2-3 112his3-11,15 △sro9::TRP1)

상기 제조된 Saccaromyces cerevisiae YSK2836 변이주를 2010년 10월 7일에 KCCM(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁하고 기탁번호 제KCCM-11109P호를 부여받았다.

표 2는 YSK2836 Saccaromyces cerevisiae 변이체 제조에 사용된 프라이머를나타낸다.

^*밑줄 그은 서열은 SRO9 유전자 코딩부분(ORF: open reading frame)의 윗부분(69-27 bp upstream)과 아랫부분(1-44 bp downstream)에 해당하는 43 베이스와 상동부분 (43mer)

^*굵은 글씨체의 서열은 도 1의 카세트 중 TRP1의 PCR을 위해 사용된 상동부분 (20mer)

(4) YKL075C 불활성화 변이체

효모에서 YKL075C 유전자를 제거하여 불활성화시키기 위해서 상동재조합(homologous recombination)에 의한 유전자 타겟팅(gene targeting)으로 게놈상의 YKL075C 유전자를 선별마커 유전자로 치환하는 방법을 사용하였다. pFA6a-TRP1 유전자 결손 카세트(EUROSCARF; EUROpean Saccharomyces Cerevisiae Archive for Functional analysis, 물질이전양식을 작성하고 제공받음; Longtine, M.S. et al., Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14:953-961(1998))(참조: 도 1)로부터 TRP1 encoding region을 SRO9 유전자 ORF의 상부(upstream)와 상동서열을 가지는 프라이머(KS1149: 서열번호 3)와 ORF의 하부(downstream)와 상동부분을 가진 프라이머(KS1150: 서열번호 4)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하였다. 증폭된 TRP1을 포함하고, TRP1의 양쪽으로 YKL075C 유전자 ORF의 upstream 영역(48-1 base ; 48 base에 해당)에 상동인 서열과 YKL075C 유전자 ORF의 downstream 영역(0-48 base ; 48 base에 해당)과 상동인 서열을 갖는 증폭된 DNA 절편을 야생형 효모(w303a)에 lithiume acetate(LiAc) 방법으로 전이시켜 형질전환을 유도하였다. 형질전환은 야생형 효모(w303a)를 log phase인 3X10⁷ cells/ml(mid-log phase)가 되도록 배양한 후, 0.1 M LiAc를 처리하고, transformation mix(50% PEG, 1 M LiAc, single-strand DNA 2 mg/ml)와 전이시키고자 하는 DNA 절편을 yeast에 섞어준 후, 30°C에서 1시간 배양하고 42°C에서 30분 배양하는 효모에서 일반적으로 널리 통용되는 방법을 이용하였다. 상기 효모세포를 SC drop-out (-Trp) plate에 도말하고 30°C에서 2-3일 배양하였다. YKL075C 유전자 코딩부분(ORF: open reading frame)의 윗부분(48-1 bp upstream)과 아랫부분(0-48 bp downstream)에서 각각 상동재조합이 유발되어 게놈상의 YKL075C 유전자가 DNA 절편 내의 선별마커인 TRP1으로 치환된 YKL075C 불활성화 변이체는 TRP1이 발현되므로 트립토판이 없는 배지(SC-Trp media)에서 생장할 수 있다.

제조된 YKL075C 불활성화 변이주를 Saccaromyces cerevisiae YSK2837 로 명명하였으며 이 변이주는 아래의 유전형질을 갖는다. YSK2837 Saccaromyces cerevisiae (MATa ura3-1 trp1-1 ade2-3 leu2-3 112his3-11,15 △YKL075C::TRP1)

상기 제조된 Saccaromyces cerevisiae YSK2837 변이주를 2010년 10월 7일에 KCCM(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁하고 기탁번호 제KCCM-11110P호를 부여받았다.

표 3은 YSK2836 Saccaromyces cerevisiae 변이체 제조에 사용된 프라이머를나타낸다.

^*밑줄 그은 서열은 YKL075C 유전자 코딩부분(ORF: open reading frame)의 윗부분(48-1 bp upstream)과 아랫부분(0-48 bp downstream)에 해당하는 48 베이스와 상동부분 (48mer)

실시예 2: 저온에서의 불활성화 변이체의 생장 속도 분석

효모 야생형과 STM1, SRO9, YKL075C 불활성화 변이체(stm1,sro9,YKL075C)를 30℃의 배양온도조건 하에서 YPAD 배지에서 배양한 후, 동일한 개수의 세포를 10배씩 희석하면서 3개의 2% 글루코오스가 함유된 SC 플레이트에 점적하였다. 이를 각각 18℃(저온), 30℃로 배양 온도만을 달리하여 3일 동안 배양하였다.

그 결과, STM1, SRO9, YKL075C 불활성화 변이체(stm1,sro9,YKL075C)의 경우 효모 야생형에 비해 저온(18℃)에서 현저히 세포 생장이 촉진되었다.(도 2)

실시예 3: 저온에서의 불활성화 변이체의 생장 속도 분석

효모 야생형과 STM1, SRO9, YKL075C 불활성화 변이체(stm1,sro9,YKL075C)를 30℃ YPAD 배지에서 포화(saturation)될 때까지 하루정도 배양한 후, 동일한 개수의 세포를 YPAD 배지 20 ml에 넣고 30°C와 18℃의 배양온도 조건 하에서 72시간 동안 배양하였다. 이 때 일정시간 간격으로 세포의 개수를 측정하여 세포생장정도를 그래프로 나타내었다.

그 결과, STM1, SRO9, YKL075C 불활성화 변이체(stm1,sro9,YKL075C)의 경우, 효모 야생형에 비해 18°C의 저온에서 생장이 현저히 촉진되는 것을 확인할 수 있다 (도 3 및 도 4 및 도 5).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11108P

20101007

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11109P

20101007

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11110P

20101007

Claims

STM1 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는 저온에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 STM1 유전자를 불활성화시키는 단계는 STM1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 STM1 유전자를 불활성화시키는 단계는 STM1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 결실은 상동재조합에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 저온은 18℃ 이하의 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 사이조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아(Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스(Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스인 것을 특징으로 하는 방법.
STM1 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는 저온에서 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 STM1 유전자를 불활성화시키는 단계는 STM1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 STM1 유전자를 불활성화시키는 단계는 STM1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 결실은 상동재조합에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 저온은 18℃ 이하의 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 사이조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아(Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스(Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스인 것을 특징으로 하는 방법.
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STM1 유전자가 불활성화 되어 저온에서 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체로서, 상기 효모 변이체는 사카로마이세스 세레비지애 YSK2835(기탁번호: KCCM-11108P)인 것을 특징으로 하는 효모 변이체.