KR101050125B1

KR101050125B1 - 고온 내성을 갖는 효모 변이체

Info

Publication number: KR101050125B1
Application number: KR1020090010130A
Authority: KR
Inventors: 송기원
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-09
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2011-07-19
Also published as: KR20100090906A

Abstract

본 발명은 NST1(Negatively affects Salt Tolerance 1)을 불활성화시키는 단계를 포함하는 고온에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법 및 고온에서의 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체의 제조방법에 관한 것이다. 고온 내성을 갖는 본 발명의 NST1 변이체는 외부 온도 변화에 덜 민감하게 안정적으로 생장할 수 있어, 효모의 다양한 응용 분야 예컨대 포도주, 맥주 등과 같은 주류 제조 및 간장, 된장, 빵, 치즈, 요구르트, 식초 등과 같은 발효식품 제조에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 고온 내성 효모 변이체는 항생물질과 항암물질의 생산, 유기산 발효공업, 아미노산 발효공업, 단백질 생산 공업, 균체제조 등에 이용할 수 있다.

효모, 고온, 생장, 성장, 내성

Description

고온 내성을 갖는 효모 변이체{Yeast Variants Having Resistance to High Temperature}

본 발명은 고온에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법 및 고온에서의 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체의 제조방법에 관한 것이다.

미생물의 열 안정성은 미생물의 산업적 응용을 고려하였을 때 매우 중요한 고려 요소이다. 이에 따라 호열성 미생물 변이체, 즉 고온 내성을 갖는 미생물 변이체를 제조하려는 많은 시도가 있다. 특히, 산업적으로 유용한 효모 종들에 대하여 열적 안정성에 관여하는 생물학적 물질을 발굴하려는 많은 시도가 있다.

대부분의 진핵세포 및 진핵세포의 대표 모델인 출아형 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 등에서 고온 등 배양 온도의 변화는 세포의 기능을 유지시키는 단백질 구조의 이상을 초래하여 생장을 억제하는 것으로 잘 알려져 있다. 예를 들어, 효모 세포는 최소 5분 동안 50℃에 노출한 경우 효모 세포의 99% 이상이 죽는 것으로 알려져 있다(Yolanda Sanchez et al. EMBO, 11(66):2357-2364(1992)).

한편, 사카로마이세스 세레비시애는 카탈라아제 T 효소를 코딩하고 있는 CTT1 유전자를 포함하고 있다. 이 효소는 열 쇼크에 대하여 효모를 보호하는 것으로 알려져 있다(Rotraud Wieser et al. Journal of Biological Chemistry, 266(19):12406-12411(1991)).

또한, 미국 특허 제5674721호는 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase) 유전자를 효모에 형질전환시켜 고온 내성을 갖는 변이체를 제조하는 기술을 개시하고 있다.

그러나 현재까지 고온에서 정상적인 생장속도로 성장할 수 있는 효모 변이체를 제공할 수 있는 기술들은 미진한 상태이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 고온 내성을 가져 고온에서의 개선된 생장능을 나타내는 효모 변이체를 제조하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, NST1을 불활성화 시키는 경우에는 고온 내성을 가져 다양한 고온 공정에서 이용될 수 있는 효모를 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 고온에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 고온에서의 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 NST1(Negatively affects Salt Tolerance 1)을 불활성화시키는 단계를 포함하는 고온에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 NST1(Negatively affects Salt Tolerance 1)을 불활성화시키는 단계를 포함하는 고온에서의 증가된 생장능을 나타 내는 효모 변이체의 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 고온 내성을 가져 고온에서의 개선된 생장능을 나타내는 효모 변이체를 제조하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, NST1을 불활성화 시키는 경우에는 고온 내성을 가져 다양한 고온 공정에서 이용될 수 있는 효모를 제공할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 기본적인 전략은 다양한 효모에서 발견되는 NST1을 불활성화 시키는 것이다. NST1은 효모에 염 스트레스(salt stress)에 대한 민감성을 제공하고 스프라이싱 인자(splicing factor) Nsl1p과 상호작용하는 것으로 알려졌을 뿐, 이의 정확한 기능은 알려지지 않았다. 한편, 본 발명자는 NST1이 제거되어 불활성화된 변이체가 저온 내성을 나타냄을 규명한 바 있다(참조: 대한민국 특허 제719465호). 그러나 상기 특허문헌에는 NST1과 효모의 고온 내성에 대한 언급은 전혀 없다. 효모의 고온 내성은 효모의 산업적 응용을 고려하였을 때, 저온 내성보다 크게 요구되는 특성이다.

불활성화 대상이 되는 NST1은 다양한 효모에서 발견되고 동종되었다. 하기의 실시예에서는 서열목록 제1서열 및 제2서열의 사카로마이세스 세레비시애의 NST1이 예시되어 있으나, 이외에도 다양한 NST1이 본 발명에 포함된다. 예를 들어, GenBank 접근번호 Q6BUT3(Debaryomyces hansenii), 접근번호 XP_001385669(Pichia stipitis), 접근번호 A6RW62(Botryotinia fuckeliana), 접근번호 A4R2R1(Magnaporthe grisea) 및 접근번호 Q2GZN9(Chaetomium globosum)에 개 시된 NST1이 본 발명에서 불활성화 대상이 될 수 있다.

본 명세서에서 NST1을 언급하면서 사용되는 용어, “불활성화(inactivation)”란 유전자의 전사 또는 해독, 유전자 산물의 활성의 손상(impairment)을 초래하는 NST1의 지놈 열상에서의 변형(modifications)을 의미한다. 이런 유전자 변형은 NST1 코딩 서열의 불활성화뿐만 아니라 이의 프로모터의 불활성화도 포함될 수 있다. 효모 지놈 상에서 목적한 유전자만의 특이적 불활성화는 코딩하는 유전자의 전체 또는 하나 이상의 부분 영역에서 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시킴으로서 가능하다. 예들 들어, 유전자의 결실 및 유전자로의 이형 서열(heterogenous sequence)의 삽입은 유전자의 절단(truncation), 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutation), 미스센스 돌연변이(missense mutation) 등을 초래할 수 있다. 이러한 유전자의 특이적 불활성화는 당 분야에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, NST1을 불활성화시키는 단계는 NST1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시켜 실시된다.

본 명세서에서 NST1을 언급하면서 사용되는 용어, “결실(deletion)”은 NST1의 기능을 상실케 하는 모든 결실 변이를 포함하는 의미를 갖는다. 예를 들어, NST1 유전자의 결실은 NST1 코딩 서열의 부분 결실 또는 전체 결실을 모두 포함한다.

이러한 NST1 코딩 서열의 결실은 당업계에 공지된 다양한 변이유발(mutagenesis) 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예컨대, NST1 코딩 서열의 결실 은PCR 돌연변이유발법 및 카세트 돌연변이유발법으로 실시할 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명이 적용되는 효모는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces), 사이조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아(Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스(Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula) 속(genus)에 속하는 효모이고, 보다 바람직하게는 사카로마이세스에 속하는 효모이고, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시애이다.

본 발명의 방법에 의해 효모의 고온 생장능이 크게 개선된다.

본 명세서에서 용어 “고온 생장능”은 바람직하게는 37℃ 이상, 보다 바람직하게는 38℃ 이상의 온도에서의 생장능을 의미한다. 이 경우 고온 생장능과 관련된 상한(upper) 온도는 60℃, 보다 바람직하게는 50℃, 보다 바람직하게는 45℃이다.

본 명세서에서 본 발명의 효모 변이체를 언급하면서 사용되는 표현 “고온에 서의 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체”는 야생형 효모와 비교하여 고온에서의 생장능이 증가된 효모 변이체를 의미하며, 이러한 효모 변이체는 고온에서 야생형 효모의 최적 온도(예컨대, 30℃)에서의 생장과 실질적으로 동일한 생장곡선을 나타낸다.

본 발명의 고온 내성 효모 변이체는 포도주, 맥주 등과 같은 주류 제조 및 간장, 된장, 빵, 치즈, 요구르트, 식초 등과 같은 발효식품 제조에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 고온 내성 효모 변이체는 항생물질과 항암물질의 생산, 유기산 발효공업, 아미노산 발효공업, 단백질 생산 공업, 균체제조 등에 이용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명에 따르면 효모의 NST1을 불활성화 하여 고온에서의 효모의 생장 능력을 크게 증가시킨다.

(b) 본 발명의 NST1 변이체는 고온에서 효모의 일반적 생장곡선과 거의 동일한 생장곡선을 나타낸다.

(c) 고온 내성을 갖는 본 발명의 NST1 변이체는 외부 온도 변화에 덜 민감하게 안정적으로 생장할 수 있어, 효모의 다양한 응용 분야 예컨대 제빵 과정, 양조 과정, 유기산 발효 공정, 발효 식품 제조와 같은 발효 공정에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: NST1 불활성화 효모 변이체의 제조

효모에서 NST1 유전자를 제거하여 불활성화시키기 위해서 상동재조합(homologous recombination)에 의한 유전자 타겟팅(gene targeting)으로 지놈 상의 NST1 유전자를 선별마커 유전자로 치환하는 방법을 사용하였다. pFA6a-TRP1 유전자 결손 카세트(Longtine, M.S. et al., Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14:953-961(1998))로부터 TRP1 인코딩 영역(encoding region)을 NST1 유전자 ORF의 업스트림과 상동서열을 가지는 프라이머(KS297: GAACT ATATA TCAAA GCTAG AAGAA GAGTG ATTTG TCATA ATTGA TTCAC CGGAT CCCCG GGTTA ATTAA)와 ORF의 다운스트림과 상동부분을 가진 프라이머(KS298: CTCTT CTGAA ATTTC GTCGA ATTAT GTATG TATGT AAATA TTTTT GGCCC GAATT CGAGC TCGTT TAAAC)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하였다. 증폭된 TRP1을 포함하고, TRP1의 양쪽으로 NST1 유전자의 5' 말단 영역(NST1 5' 말단을 기준으로 159-110 bp 업스트림에 해당; 50 base)에 상동인 서열과 NST1 유전자의 3’ 말단 영역(NST1 3' 말단을 기준으로 18-67 bp 다운스트림에 해당; 50 base)과 상동인 서열을 갖는 증폭된 DNA 절편을 야생형 효모(w303a; MATa ade2-1 ura3-1 trp1-1 leu2-3, 112 his3-11, 15 can1-100; ATCC)에 리튬 아세테이트(LiAc) 방법으로 전이시켜 형질전환을 유도하였다. 형질전환은 야생형 효모(w303a)를 대수기인 3 x 10⁷ cells/ml(mid-log phase)가 되도록 배양한 후, 0.1 M LiAc를 처리하고, transformation mix(50% PEG, 1 M LiAc, single-strand DNA 2 mg/ml)와 전이시키고자 하는 DNA 절편을 효모에 섞어준 후, 30℃에서 1시간 배양하고 42℃에서 30분 배양하는 효모에서 일반적으로 널리 통용되는 방법을 이용하였다.

효모 야생형의 경우, 효모 생장의 최적조건인 YPAD 배지 또는 선택배지에서 실시하였다. YPAD 배지의 조성은 1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤, 100 μg/ml 아데닌 및 2% 덱스트로오스로 구성되어 있다. 선택배지(Synthetic Complete (SC) medium)는 2 X SC 배지 1 L을 기준으로 효모 질소 베이스 13.4 g, 암모늄 설페이트10 g, 20 종의 아미노산 혼합물 4 g 및 200 mM 이노시톨 2 ml을 넣어 제조한다.

상기 효모세포를 SC drop-out(-Trp) 플레이트에 도말하고 30℃에서 2-3일 배양하였다. NST1 유전자 코딩부분(ORF: open reading frame)의 윗부분(159-110 bp upstream)과 아랫부분(18-67 bp downstream)에서 각각 상동재조합이 유발되어 지놈상의 NST1 유전자가 DNA 절편 내의 선별마커인 TRP1으로 치환된 NST1 불활성화 변 이체는 TRP1이 발현되므로 트립토판이 없는 배지(SC-Trp media)에서 생장할 수 있다.

NST1 불활성화 변이체를 선별하여 배양하기 위하여 SC drop-out 배지를 사용하였다. NST1 불활성화 변이체는 선별마커로 트립토판 생합성에 필요한 TRP1(N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase) 유전자를 갖게 되므로 기본 선택배지에 이러한 변이체 효모를 선별하기 위해 트랍토판을 제외한 배지(SC-Trp)를 이용한다. 효모 야생형의 경우 아미노산 혼합물 중 트립토판이 제외된 선택배지에서는 성장할 수 없고, 선택마커를 가지고 있는 NST1 불활성화 변이체만이 이 배지에서 생장하는 특징을 가지고 있다.

제조된 NST1 불활성화 변이주를 “Saccharomyces cerevisiae YSK910”라 명명하고, 기탁기관 KCCM(Korean Culture Center of Microorganism)에 2005년 12월 26일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM-10733P를 부여받았다.

실시예 2: NST1 불활성화 효모 변이체의 고온 생장능 평가(플레이트 분석)

플레이트 분석을 위하여, W303a 야생형 효모 및 YSK910 효모 변이체(△nst1변이체)를 SC 배지에서 30℃, 12시간 동안 배양하여 중간-대수기(3 x 10⁷ cells/ml)까지 배양시킨 다음, SC 배지에서 30℃에서 말기 대수기(2 x 10⁸ cells/ml)까지 서브배양 하였다. 이어, 세포수를 계수하고 동일 개수의 세포를 연속적으로 10배씩 희석하고 2% 글루코오스-함유 SC 플레이트 상에 20 ㎕ 스팟팅 하였다. 각각의 플 레이트를 30℃ 24시간, 37℃ 24시간, 38℃ 36시간 및 39℃ 48시간 배양하였다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 30℃에서 배양한 경우에는, △nst1 변이체의 생장 속도는 야생형 효모와 거의 동일하였다. 37℃에서 △nst1 변이체 세포는 야생형 보다 조금 빠른 생장속도를 나타내었다. 그러나, 38℃ 및 39℃ 배양 조건에서, △nst1 변이체 세포는 야생형보다 매우 빠른 생장 속도를 나타내었다. 이 실험 결과는 고온 스트레스 하에서 △nst1 변이체 세포가 야생형 세포보다 빠른 생장 속도를 나타냄을 명확하게 보여 준다.

실시예 3: 고온 조건에서의 NST1 불활성화 효모 변이체의 생장 속도 측정

상이한 온도에서 W303a 야생형 효모 및 YSK910 효모 변이체(△nst1 변이체)의 생장 속도를 측정하기 위하여, W303a 세포 및 YSK910 세포를 YPAD 배지에서 30℃에서 초기 대수기(10⁷세포/ml)까지 배양한 다음, YPAD 배지에서 30℃에서 말기 대수기(2 x 10⁸ cells/ml)까지 서브배양 하였다. 이어, 세포수를 계수하고 동일 개수의 세포(초기 농도: 10⁵세포/ml)를 30℃ 및 38℃에서 각각 배양하였다. 그런 다음, 시료를 채취하고 24시간 동안 2시간 마다 계수 하였다. 상기 실험과 동일한 실험을 3회 반복하였고 평균과 표준편차 값을 구하였다.

도 2a에서 볼 수 있듯이, △nst1 변이체는 30℃에서 야생형보다 조금 느리게 성장하였다. 한편, 38℃에서 △nst1 변이체 세포의 개수는 연속적으로 증가하여 정상기(stationary phase)까지 도달하였으나, 야생형은 정상기에 도달하기 전에 증 식을 멈추었다.

상기 실험 결과는 △nst1 변이체가 고온에서 계속적으로 성장하여 일반적인 조건 하에서의 생장 곡선과 거의 동일한 패턴을 나타내며, NST1 유전자의 결손이 효모 세포에 열 내성을 부여한다는 것을 명확하게 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 W303a 야생형 효모 및 YSK910 효모 변이체(△nst1변이체)의 고온 생장능을 보여주는 플레이트 분석 결과이다.

도 2a는 W303a 야생형 효모 및 YSK910 효모 변이체(△nst1변이체)의 30℃에서의 생장곡선이다.

도 2b는 W303a 야생형 효모 및 YSK910 효모 변이체(△nst1변이체)의 38℃에서의 생장곡선이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Yeast Variants Having Resistance to High Temperature <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 267 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(264) <400> 1 gta gga ctt aac ttg gat tac tcg acg ttt atc aac aaa ttg ata agc 48 Val Gly Leu Asn Leu Asp Tyr Ser Thr Phe Ile Asn Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 atg caa gga gcc tac aat tgc gaa ttc ttt act gat aac aat gga tcc 96 Met Gln Gly Ala Tyr Asn Cys Glu Phe Phe Thr Asp Asn Asn Gly Ser 20 25 30 att acc cac gtt cga ttt gcg aga caa act ccc gct ggc cac tca aag 144 Ile Thr His Val Arg Phe Ala Arg Gln Thr Pro Ala Gly His Ser Lys 35 40 45 ggg ttg ctg aat caa ctc ttt agt gga ttg aac gat cca act gct aca 192 Gly Leu Leu Asn Gln Leu Phe Ser Gly Leu Asn Asp Pro Thr Ala Thr 50 55 60 cca ttt acg tca agg cct cat acc tcc aca agg gct agt ttt cca att 240 Pro Phe Thr Ser Arg Pro His Thr Ser Thr Arg Ala Ser Phe Pro Ile 65 70 75 80 gcc tct tca act acg caa acg tct taa 267 Ala Ser Ser Thr Thr Gln Thr Ser 85 <210> 2 <211> 88 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Val Gly Leu Asn Leu Asp Tyr Ser Thr Phe Ile Asn Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 Met Gln Gly Ala Tyr Asn Cys Glu Phe Phe Thr Asp Asn Asn Gly Ser 20 25 30 Ile Thr His Val Arg Phe Ala Arg Gln Thr Pro Ala Gly His Ser Lys 35 40 45 Gly Leu Leu Asn Gln Leu Phe Ser Gly Leu Asn Asp Pro Thr Ala Thr 50 55 60 Pro Phe Thr Ser Arg Pro His Thr Ser Thr Arg Ala Ser Phe Pro Ile 65 70 75 80 Ala Ser Ser Thr Thr Gln Thr Ser 85

Claims

NST1(Negatively affects Salt Tolerance 1)을 불활성화시키는 단계를 포함하는 38℃ 이상의 온도에서의 효모의 생장을 증가시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 NST1을 불활성화시키는 단계는 NST1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 NST1을 불활성화시키는 단계는 NST1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 사이조사카 로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아(Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스(Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스인 것을 특징으로 하는 방법.
NST1(Negatively affects Salt Tolerance 1)을 불활성화시키는 단계를 포함하는 38℃ 이상의 온도에서의 증가된 생장능을 나타내는 효모 변이체의 제조방법.
제 7 항에 있어서, 상기 NST1을 불활성화시키는 단계는 NST1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 NST1을 불활성화시키는 단계는 NST1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 7 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 사이조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아(Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스(Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스인 것을 특징으로 하는 방법.