KR101508635B1 - 유전체 수준의 무작위 돌연변이 유도기술 - Google Patents

유전체 수준의 무작위 돌연변이 유도기술 Download PDF

Info

Publication number
KR101508635B1
KR101508635B1 KR20130097463A KR20130097463A KR101508635B1 KR 101508635 B1 KR101508635 B1 KR 101508635B1 KR 20130097463 A KR20130097463 A KR 20130097463A KR 20130097463 A KR20130097463 A KR 20130097463A KR 101508635 B1 KR101508635 B1 KR 101508635B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pol3
vector
gene
strain
mutant
Prior art date
Application number
KR20130097463A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140047520A (ko
Inventor
권오석
오두병
김오철
황동현
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Publication of KR20140047520A publication Critical patent/KR20140047520A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101508635B1 publication Critical patent/KR101508635B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 교정기능이 결손된 변이 DNA 중합효소 델타의 촉매소단위(DNA polymerase delta catalytic subunit) Pol3를 이용한 한세눌라 폴리모파 게놈의 무작위 돌연변이 유도기술에 관한 것으로, 구체적으로 교정기능이 결손된 Pol3 단백질을 생산하는 신규한 발현벡터를 한세눌라 폴리모파에 도입 후, 표적형질을 나타내는 돌연변이 균주를 분리동정하고, 더 이상의 돌연변이 축적을 방지하기 위하여 본 발명의 교정기능이 결손된 Pol3 단백질 발현벡터를 제거하는 방법을 확립하였다. 본 발명의 무작위 돌연변이 유도기술은 산업상 유용한 균주로 알려진 한세눌라 폴리모파의 알려지지 않거나 복합적인 돌연변이를 유도하여 표적형질을 나타내는 돌연변이를 제조하는데 있어서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유전체 수준의 무작위 돌연변이 유도기술{Method for genome-wide random mutagenesis}
본 발명은 DNA 중합효소 델타의 촉매소단위(DNA polymerase delta catalytic subunit) Pol3의 돌연변이 유전자 및 상기 돌연변이 유전자를 이용하여 유용 산업용 효모인 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)의 유전체에 안정적인 무작위 돌연변이를 유도하는 방법에 관한 것이다.
한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)는 값싼 원료물질인 메탄올 및 글리세롤을 에너지원과 탄소원으로 이용할 수 있어 경제성이 높고, 메탄올 대사에 관련되는 유전자들, 예를 들어 메탄올 옥시다아제(methanol oxidase, MOX)에서 유래된 발현 조절이 용이하면서도 매우 강력한 프로모터를 갖고 있어 산업적 응용 측면에서 그 유용성이 매우 높다. 또한 고농도 배양(100 - 130 g dcw/L)이 용이하고, 형질 전환시 발현 목표 유전자가 숙주의 염색체상으로 다수 도입되어 비선택 배지를 사용한 장기 배양에서도 도입된 발현벡터의 안정성이 뛰어난 장점이 있어서, 재조합 단백질 대량생산에 유용한 숙주로 각광을 받고 있다[Faber et al., Yeast 11, 1331(1995), Hansen and Hollen berg, In Wolf, K(ed), Non-conventional Yeast in Biotechnology(1996)]. 또한 목질계 바이오매스의 주성분중 하나인 오탄당 자일로스를 포함한 다양한 탄소원을 발효할 수 있으며, 45℃ 이상 고온에서 성장할 수 있고, 중금속, 고온, 산화스트레스 등 각종 스트레스에 대한 강한 내성을 갖고 있어 바이오에탄올을 포함한 각종 유용 생물소재 생산숙주로 개발될 수 있는 장점을 갖고 있다[Suwannarangsee et al., Applied Microbiology and Biotechnology 96;697(2012)].
유용산물의 산업적 생산을 목적으로 하는 대사공학 기술은 재조합 DNA 기술을 사용하여 주로 특정 유전자군을 제거, 도입, 혹은 발현 조절함으로써 세포의 효소, 수송, 조절 기능을 조작하여 세포의 기능을 향상시키는데 목표를 두고 있다. 그러나 산업미생물의 경우, 원하는 표적물질의 생산성뿐만 아니라 공정조건, 산물, 저가의 기질에 포함되어 있을 수 있는 불순물 등 다양한 요소에 내성을 갖도록 설계되어야 하나, 많은 경우 이러한 형질은 단일 유전자의 증폭이나 파쇄에 의해 얻을 수 없다. 예를 들어, 에탄올이나 부탄올 내성, 당화된 목질계 바이오매스 내의 초산에 대한 내성, 낮은 pH나 고온 내성 등은 다수의 유전자에 의해 매개되기 때문에 전체 게놈을 대상으로 한 조작을 필요로 한다. 방사능, 자외선, 화학물질, 특정 돌연변이 호발균주, 생물학제제 등 여러 다른 방식으로 전체 유전체 수준에서 돌연변이를 유발하는 방법들이 있는데, 특히 알킬화 제제(alkylating agent)인 NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)가 가장 많이 사용되고 있다. 그런데 이런 방법들은 유독물질을 사용해야 할 뿐만 아니라 일단 원하는 형질을 갖는 균주가 확보되고 나서도 발효공정 개발이나 대량배양 조건에서 표적형질이 최적화되고 안정적으로 유지될 수 있도록 앞서 수행되었던 무작위 돌연변이 선별 작업을 반복적으로 다시 적용해야 하는 많은 노동력을 필요로 하는 단점이 있다.
현재 DNA 중합에 작용하는 효소로 3종류의 DNA 중합효소(DNA polymerase)가 알려져 있으며, 이들 효소들은 DNA 합성을 촉매함에 있어서, 4 종류의 디옥시리보뉴클레오시드-5-3'인산(deoxyribonucleoside-5'-triphosphate)를 필요로 하며 DNA 주형의 지시에 따라 작용, 프라이머(primer)로 3'-OH기를 필요, DNA 합성은 5'→3' 방향으로 진행 및 중합활성 외에 3'→5' 핵산단말분해효소의 활성을 갖는다는 특징이 있다. 상기 특징 중, 3'→5' 핵산단말분해효소의 활성은 DNA 복제시 발생하는 에러를 제거하는 교정 기능을 갖고 있는데, 상기 기능이 제거되면 DNA 복제시 발생하는 돌연변이가 축적되게 된다.
이에 본 발명자들은, 교정기능이 결손된 Pol3 단백질을 생산하는 신규한 발현벡터를 한세눌라 폴리모파에 도입 후, 표적형질을 나타내는 돌연변이 균주를 유도하여 분리동정하고, 더 이상의 돌연변이 축적을 방지하기 위하여 본 발명의 발현벡터를 제거하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 교정기능이 결손된 변이 DNA 중합효소 델타의 촉매소단위(DNA polymerase delta catalytic subunit) Pol3를 이용한 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 게놈의 무작위 돌연변이 유도기술을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Pol3 단백질에서 317D I E319 아미노산 잔기가 각각 317A G A319로 치환되도록 상기 Pol3 단백질을 암호화하는 유전자를 돌연변이 시켜 핵산말단분해효소 활성이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질 발현 유전자를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 돌연변이된 유전자, 복제원점, 프로모터, 및 LEU2 유전자 단편(LEU2-C/N) 또는 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 발현벡터를 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 균주에 형질전환시켜 교정기능이 결손된 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 무작위 돌연변이(random mutagenesis) 유도용 한세눌라 폴리모파 균주를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Pol3 단백질에서 317D I E319 아미노산 잔기가 각각 317A G A319로 치환되도록 상기 Pol3 단백질을 암호화하는 유전자를 돌연변이 시켜 핵산말단분해효소 활성이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질 발현 유전자를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 돌연변이된 유전자, 복제원점, 프로모터, 및 LEU2 유전자 단편(LEU2-C/N) 또는 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 발현벡터를 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 균주에 형질전환시켜 교정기능이 결손된 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 한세눌라 폴리모파 균주를 제조하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 한세눌라 폴리모파 균주를 배양하여 무작위 돌연변이를 균주를 유발시키는 단계;
5) 상기 단계 4)의 무작위 돌연변이 균주들 중에서 표적형질을 갖는 돌연변이 균주를 선별하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)의 선별된 돌연변이 균주 중에서 무작위 돌연변이가 축적되는 것을 방지하기 위해, 돌연변이 벡터를 제거하는 단계를 포함하는 한세눌라 폴리모파 균주의 무작위 돌연변이(random mutagenesis) 유도방법을 제공한다.
본 발명의 교정기능이 결손된 변이 DNA 중합효소 델타의 촉매소단위(DNA polymerase delta catalytic subunit) Pol3를 이용한 한세눌라 폴리모파 게놈의 무작위 돌연변이 유도기술은, 산업상 유용한 균주로 알려진 한세눌라 폴리모파의 알려지지 않거나 복합적인 돌연변이를 유도하여 표적형질을 나타내는 돌연변이를 제조하는데 있어서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) Pol3의 아미노산 서열을 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 시조사카로마이세스 폼비(Schizosaccharomyces pombe)의 Pol3 단백질의 아미노산 서열과 상동성을 비교한 도이다.
도 2는 3'→5' 교정기능이 결여된 돌연변이 Pol3 유전자를 제조하기 위해 돌연변이 시킨 아미노산 서열과 해당 DNA 서열을 나타내는 도이다.
도 3a 및 3b는 돌연변이 유도용 발현벡터인 pHIF8 및 pHIF11의 구조를 각각 나타내는 도이다:
LEU2-C/N: LEU2 유전자 C-말단 단편 및 N-말단 단편서열;
ADE2-C/N: ADE2 유전자 C-말단 단편 및 N-말단 단편서열;
pMOX: 메탄올 옥시다아제(methanol oxidase) 프로모터;
HpPOL3*: 돌연변이 된 Pol3 유전자;
URA3: 유라실 영양요구성 제거용 표지;
ZeoR: 지오신(zeocin) 내성유전자; 및
pUC-Ori: 대장균용 복제원점.
도 3c는 돌연변이 유도용 발현벡터 pHIF11이 ADE2 유전자 위치로 형질전환되었을 때, 형질전환체가 색으로 구분이 되는 것을 나타내는 도이다:
I: 돌연변이 유도용 발현벡터 pHIF11이 삽입되지 않은 ADE2+ 균주인 흰색 한세눌라 폴리모파 DL1-LdU 균주;
II: 돌연변이 유도용 발현벡터 pHIF11이 ADE2 유전자 위치로 형질전환된 ADE2- 균주인 붉은색 한세눌라 폴리모파 형질전환체; 및
III: 형질전환된 돌연변이 유도용 발현벡터 pHIF11이 ADE2 유전자에 의해 제거된 ADE2+ 균주인 흰색 한세눌라 폴리모파 형질전환체.
도 4는 돌연변이 유도용 발현벡터 pHIF8이 형질전환된 한세눌라 폴리모파 균주를 메탄올 액체 배지에서 배양하며 표시된 시간에 시료를 채취하여 유라실 영양요구성을 보이는 돌연변이 유발율을 확인한 도이다:
각 화살표는 2%의 메탄올을 추가 주입한 시점을 나타낸다.
도 5a는 pHIF8이 형질전환된 한세눌라 폴리모파 균주를 메탄올 액체 배지에서 배양한 후, 확보한 자일로스(xylose) 대사능 증진 균주의 자일로스 대사능을 한천배지에서 확인한 도이다:
DL1-L: 야생형 한세눌라 폴리모파; 및
X13-2, X14-2, X15-2, X16-2 및 X17-2; pHIF8이 형질전환된 한세눌라 폴리모파 균주에서 유도된 자일로스 대사능 증진 균주.
도 5b는 자일로스 대사능 증진 균주의 액체배지에서 성장률(OD600)을 확인한 도이다:
□: 야생형 한세눌라 폴리모파; 및
○: 자일로스 대사능 증진 균주 X15-2.
도 5c는 LEU2 유전자 단편을 이용하여 자일로스 대사능 증진 균주의 염색체에서 pHIF8 벡터를 제거하는 방법을 나타내는 도이다.
도 5d는 pHIF8를 제거한 후에도 자일로스 대사능력이 유지됨을 확인한 도이다:
□: 야생형 한세눌라 폴리모파; 및
●: pHIF8을 제거한 자일로스 대사능이 증진된 한세눌라 폴리모파 균주 X15-2[DO].
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Pol3 단백질에서 317D I E319 아미노산 잔기가 각각 317A G A319로 치환되도록 상기 Pol3 단백질을 암호화하는 유전자를 돌연변이 시켜 핵산말단분해효소 활성이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질 발현 유전자를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 돌연변이된 유전자, 복제원점, 프로모터, 및 LEU2 유전자 단편(LEU2-C/N) 또는 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 발현벡터를 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 균주에 형질전환시켜 교정기능이 결손된 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 무작위 돌연변이(random mutagenesis) 유도용 한세눌라 폴리모파 균주를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 돌연변이 Pol3 단백질 발현 유전자는, Pol3 단백질의 3'→5' 방향 핵산단말분해효소 활성이 결여될 수 있도록, 아미노산을 치환, 결실, 삽입 또는 도입하는 것이 바람직하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Pol3 단백질에서 317D I E319 아미노산 잔기를 317A G A319로 치환하는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 Pol3 단백질을 암호화하는 유전자는 한세눌라 폴리모파로부터 유래된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 LEU2 유전자 단편을 포함하는 발현벡터는 도 3a의 벡터 맵(map)을 갖는 pHIF8 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 ADE2 유전자 단편을 포함하는 발현벡터는 도 3b의 벡터 맵(map)을 갖는 pHIF11 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 복제 원점은 상기 벡터를 증폭하기 위한 pUC-Ori인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 프로모터는 돌연변이 Pol3 발현을 메탄올을 이용하여 유도하기 위한 메탄올 옥시다아제(methanol oxidase) 프로모터(pMOX)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 LEU2 유전자 단편(LEU2-C/N) 또는 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)은 본 발명의 벡터를 한세눌라 폴리모파 유전체의 LEU2 유전자 또는 ADE2 유전자 위치에 상동 재조합에 의해 안정적으로 도입하고 무작위 돌연변이 후, 돌연변이가 축적되지 않도록 본 발명의 벡터를 유전체로부터 제거하기 위한 DNA 서열이다.
상기 단계 3)의 한세눌라 폴리모파는 한세눌라 폴리모파 DL1-LdU 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은,
1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Pol3 단백질에서 317D I E319 아미노산 잔기가 317A G A319로 치환되도록 상기 Pol3 단백질을 암호화하는 유전자를 돌연변이 시켜 핵산말단분해효소 활성이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질 발현 유전자를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 돌연변이된 유전자, 복제원점, 프로모터, 및 LEU2 유전자 단편(LEU2-C/N) 또는 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 발현벡터를 한세눌라 폴리모파 균주에 형질전환시켜 교정기능이 결손된 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 한세눌라 폴리모파 균주를 제조하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 한세눌라 폴리모파 균주를 배양하여 무작위 돌연변이를 균주를 유발시키는 단계;
5) 상기 단계 4)의 무작위 돌연변이 균주들 중에서 표적형질을 갖는 돌연변이 균주를 선별하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)의 선별된 돌연변이 균주 중에서 더이상 무작위 돌연변이가 축적되는 것을 방지하기 위해, 돌연변이 벡터를 제거하는 단계를 포함하는 한세눌라 폴리모파 균주의 무작위 돌연변이(random mutagenesis) 유도방법을 제공한다.
상기 단계 5)의 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)을 포함하는 발현벡터가 형질전환된 균주에서 표적형질을 갖는 돌연변이 균주는 붉은 색을 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 6)의 벡터의 제거는 LEU2 유전자 또는 ADE2 유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭한 후, 형질전환하여 상동 재조합 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 한세눌라 폴리모파의 DL-1 유전체 사업 정보 데이터베이스에서 tblastn 프로그램을 이용하여 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 Pol3 단백질의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열의 단백질을 번역하는 한세눌라 폴리모파 Pol3 유전자를 확보하였다. 또한, 한세눌라 폴리모파 Pol3 단백질의 아미노산 서열분석 결과, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) Pol3와는 67%, 사카로마이시스 세레비지애 Pol3와는 57% 및 시조사카로미세스 폼비(Schizosaccharomyces pombe) Pol3와는 55% 상동성을 나타냄을 확인하였으며, 상기 효모의 Pol3 단백질간의 유사성을 확인한 결과, 한세눌라 폴리모파 Pol3 단백질에 Pol3 단백질 군에서 보이는 보존적인 아미노산 서열 및 활성 도메인이 존재함을 확인하였다. 또한, Pol3 단백질의 3'→5' 방향의 핵산단말분해효소 활성에 중요한 아미노산 잔기들을 포함하고 있음을 확인하였다(도 1 참조).
또한, 본 발명자들은 교정기능이 결여된 Pol3 단백질을 발현하는 유전자를 제작하기 위하여, 한세눌라 폴리모파의 Pol3 단백질의 아미노산 서열 중 3'→5' 방향의 핵산말단분해효소 활성에 관여된 잔기 즉, 317D I E319를 치환하여 핵산말단분해효소 활성이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질이 발현되도록 PCR을 이용하여 Pol3 유전자에 317A G A319 돌연변이를 도입하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 교정기능이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질 발현 유전자, 복제원점, 프로모터, 및 LEU2 유전자 단편(LEU2-C/N) 또는 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)을 포함하는 돌연변이 유도용 pHIF8 또는 pHIF11 발현벡터를 각각 제작하였다(도 3a 및 3b 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 pHIF11 발현벡터가 형질전환된 한세눌라 폴리모파 균주는 붉은 색을 나타내는 것을 확인하였다(도 3c 참조).
또한, 본 발명자들은 돌연변이 유도용 벡터 pHIF8 또는 pHIF11을 제한효소 NsiI으로 절단하여 선형으로 만든 후, 한세눌라 폴리모파 DL1-LdU 균주에 형질전환 후, 유라실 영양요구성제거 및 지오신 항생제 내성확인을 통해 형질전환 균주를 제작하였다.
또한, 본 발명자들은 돌연변이 유도용 pHIF8 벡터를 도입한 한세눌라 폴리모파 균주의 돌연변이 유발능을 확인한 결과, 배양시간 의존적으로 돌연변이체 출연빈도가 증가하는 것을 확인하였다(도 4 및 표 2 참조).
또한, 본 발명자들은 돌연변이 유도용 pHIF8 벡터가 도입된 한세눌라 폴리모파 균주를 이용하여 오탄당인 자일로스(xylose)를 탄소원으로 이용하여 성장하는 능력이 증대된 돌연변이 균주를 선별한 후(도 5a 및 도 5b), 상기 선별된 균주에 추가적인 무작위 돌연변이가 축적되는 것을 방지하여 안정적인 균주를 확보하기 위하여 LEU2 유전자를 PCR 증폭한 후, 형질전환하여 상동 재조합 방법에 의하여 pHIF8 벡터를 제거하였고(도 5c) 자일로스 대사능은 pHIF8 제거 후에도 유지됨을 확인하였다(도 5d).
따라서, 본 발명의 교정기능이 결손된 변이 DNA 중합효소 델타의 촉매소단위(DNA polymerase delta catalytic subunit) Pol3를 이용한 한세눌라 폴리모파 게놈의 무작위 돌연변이 유도기술은, 산업상 유용한 균주로 알려진 한세눌라 폴리모파의 알려지지 않거나 복합적인 돌연변이를 유도하여 표적형질을 나타내는 돌연변이를 제조하는데 있어서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 한세눌라 폴리모파 Pol3 유전자 확보
본 발명자들은 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)에서 Pol3 유전자를 찾기 위하여, 먼저 칸디다 알비칸스(Candida albicans, CAA21949.1), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae, CAA43922.1) 및 시조사카로마이세스 폼비(Schizosaccharomyces pombe, CAA41968.1)의 Pol3 단백질의 아미노산 서열 정보를 확인하였다. 그런 다음, 본 발명자들이 구축한 한세눌라 폴리모파 DL-1 유전체 사업 정보 데이터베이스에서 tblastn 프로그램을 이용하여 상기 확보한 사카로미세스 세레비시아의 Pol3 단백질 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열의 단백질을 번역하는 한세눌라 폴리모파 Pol3 유전자를 확인하였다.
한세눌라 폴리모파의 Pol3 단백질의 아미노산 서열분석 결과, 칸디다 알비칸스 Pol3와는 67%, 사카로미세스 세레비시아의 Pol3와는 57%, 및 시조사카로마이세스 폼비의 Pol3와는 55%의 아미노산 동일성을 나타냄을 확인하였다.
또한, 한세눌라 폴리모파 Pol3 단백질과 다른 효모의 Pol3 단백질간의 유사성을 알아보기 위하여 해당 아미노산 서열을 소프트웨어(ClustalW, http;//www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 한세눌라 폴리모파 Pol3 단백질에 Pol3 단백질 군에서 보이는 보존적인 아미노산 서열 및 활성 도메인(domain)이 존재함을 확인하였다. 또한 Pol3 단백질의 3'→5' 방향의 핵산말단분해효소 활성에 중요한 아미노산 잔기들을 포함하고 있음을 확인하였다(도 1).
< 실시예 2> 교정기능이 결여된 Pol3 단백질 발현 유전자 제작
교정기능이 결여된 Pol3 단백질을 발현하는 유전자를 제작하기 위하여, 한세눌라 폴리모파의 Pol3 단백질의 아미노산 서열 중 3'→5' 방향의 핵산말단분해효소 활성에 관여된 잔기 즉, 317D I E319를 치환하여 핵산말단분해효소 활성이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질이 발현되도록 PCR을 이용하여 Pol3 유전자에 317A G A319 돌연변이를 도입하였다.
구체적으로, 한세눌라 폴리모파 DL-1 균주의 게놈 DNA를 주형으로 Pfu DNA 중합효소를 이용하여 Pol3 단백질에 돌연변이가 도입되는 부분을 중심으로 N-말단과 C-말단 둘로 구분하여, N-말단을 번역하는 단편을 프라이머 쌍, 서열번호 6(HpPOL3N-Fw) 및 서열번호 7(HpPOL3N-Rev)으로 증폭하였고(PCR 조건: 94℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 3분, 25 사이클), C-말단을 번역하는 단편을 프라이머 쌍 서열번호 8(HpPOL3C-Fw) 및 서열번호 9(HpPOL3C-Rev)으로 증폭하였으며(PCR 조건; 94℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 3분, 25 싸이클) 두 단편을 GCCGGC 서열을 인지하는 제한효소 NgoMIV로 절단하여 연결함으로써 돌연변이가 유입된 Pol3* 단편을 완성하였다. 상기 확보된 Pol3* 단편을 일련의 클로닝 작업을 통하여 pUC18 벡터에 도입하여 pUC-Pol3-NC를 구축하였다.
사용한 프라이머 서열
서열번호 프라이머 프라이머 서열 표적
2 pHIF5-U GAGCATATGCACGCTAGCACTGGCAATTTACCAGTAG
(NdeI, NheI)		 pHIMAZCH2
3 pHIF5-D CTCCATATGAACTGCAGTGACGTCGATCTCTACAACGA
(NdeI)		 pHIMAZCH2
4 pMOX-N TTCGCTAGCCCTCGAGCTGTTCGC
(NheI, XhoI)		 DL1-L
5 pMOX-C GGGCATATGAATTCAAGCTTTTGT
(NdeI, EcoRI)		 DL1-L
6 HpPOL3N-Fw TCTGAATTCGCTAGCCATATGAGTGCAACTACGTCG
(EcoRI, NheI, NdeI)		 DL1-L
7 HpPOL3N-Rev TCTCCCGGGACGCGCCGGCAAATGACA
(SmaI, NgoMIV)		 DL1-L
8 HpPOL3C-Fw TTTGTCATTTGCCGGCGCGTGT
(NgoMIV)		 DL1-L
9 HpPOL3C-Rev TGTAAGCTTATGCATCAGGTTGTCTAGGAGG
(HindIII, NsiI)		 DL1-L
10 HpLEU2N-Fw TCTGAATTCATGCATTGTGCTTCTCCCTG
(EcoRI, NsiI)		 pDLMOX
11 HpLEU2N-Rev CTCAAGCTTCGCTCTGCAGCGCCAA
(HindIII, PstI)		 pDLMOX
12 HpLEU2C-Fw CACGAATTCTGCAGAGCGACCCACC
(EcoRI, PstI)		 pDLMOX
13 HpLEU2C-Rev TCTAAGCTTATGCATGAGTAGCTTGGCCACCT
(HindIII, NsiI)		 pDLMOX
14 pHIF8Zeo-U TCCCCCGGGACTTCGTGGAGG
(SmaI)		 pHIF8
15 pHIF8Zeo-D CTAGCTAGCATAAGAATGCGGCCGCGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTC
(NheI, NotI)		 pHIF8
16 HpADE2C-Fw ATAAGAATGCGGCCGCAAAGAGCCAGAAAACAACACAGGTG
(NotI)		 DL1-L
17 HpADE2C-Rev TGCATGCATTCTTCATAGCCAACAGAGCCCAAC
(NsiI)		 DL1-L
18 HpADE2N-Fw TGCATGCATAGTGATGGTGGTGCGGGGTC
(NsiI)		 DL1-L
19 HpADE2N-Rev CTAGCTAGCAGACAATGTTGATATGACCCAGTTTCC
(NheI)		 DL1-L
*밑줄친 부분은 제한효소에 의해 인식되는 제한효소 절단위치를 나타낸다.
< 실시예 3> 교정기능이 결여된 Pol3 발현벡터 제작
<3-1> LEU2 유전자 단편서열을 포함하는 교정기능이 결여된 Pol3 발현벡터 제작
상기 교정기능이 결여된 Pol3 단백질을 한세눌라 폴리모파에서 발현하며, 해당 균주의 유전체에 무작위 돌연변이를 축적하기 위하여 다음과 같은 특성을 갖는 돌연변이 유도용 pHIF8 벡터를 구축하였다.
돌연변이된 Pol3 유전자(HpPOL3*): 교정기능이 결여된 우성음성돌연변이 Pol3 유전자;
대장균용 복제원점(pUC-Ori): 벡터의 제작 및 조작을 위한 각종 분자생물학적 작업 후, 해당 벡터를 대장균에서 증폭하기 위한 플라스미드 복제원점;
메탄올 옥시다아제(methanol oxidase) 프로모터(pMOX): 돌연변이 Pol3 발현을 메탄올을 이용하여 강력하게 유도하기 위한 프로모터;
URA3: 유라실 영양요구성 제거용 표지;
지오신(zeocin) 내성 유전자(ZeoR): 한세눌라 폴리모파/대장균에서 사용 가능한 항생제 내성 유전자;
LEU2 유전자 단편서열(LEU2-C/N): 본 돌연변이용 벡터를 한세눌라 폴리모파 유전체의 LEU2 유전자 위치에 상동 재조합에 의해 안정적으로 도입하고 무작위 돌연변이 유도 후, 더 이상의 돌연변이가 축적되지 않도록 유전체로부터 제거하기 위한 DNA 서열; 및
제한효소 절단부위(NsiI): 돌연변이 유도벡터를 한세눌라 폴리모파에 선형으로 형질전환하기 위한 제한효소 절단부위.
이때, pHIF8 벡터의 골격은 연구실에 자체 보유하고 한세눌라 폴리모파 발현용 벡터인 pHIMAZCH2를 주형으로 서열번호 2(pHIF5-U) 및 서열번호 3(pHIF5-D) 프라이머 쌍을 이용하여 역(inverse) PCR을 통해 pUC-Ori-ZEOR-URA3 서열을 포함하는 3.3 kb의 서열 단편을 증폭하여 사용하였다.
1.06 kb의 LEU2-C/N 번역 단편은 한세눌라 폴리모파의 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 쌍 서열번호 12(LEU2C-Fw)와 서열번호 13(LEU2C-Rev)를 이용하여 PCR 증폭한 0.5 kb의 LEU2 유전자 C-말단 번역 단편과 프라이머 쌍 서열번호 10(LEU2N-Fw)와 서열번호 11(LEU2N-Rev)을 이용하여 PCR 증폭한 0.55 kb의 LEU2 유전자 N-말단 번역 단편을 NsiI 제한효소 처리 후, 연결하여 확보하였다.
1.5 kb의 메탄올 옥시다아제 유전자의 프로모터 서열 단편은 한세눌라 폴리모파의 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 쌍 서열번호 4(pMOX-N) 및 서열번호 5(pMOX-C)를 이용하여 PCR 증폭하여 사용하였다.
3.8 kb의 Pol3* 유전자 단편은 상기에서 확보한 pUC-Pol3-NC를 주형으로 프라이머 쌍 서열번호 6(Pol3-NF) 및 서열번호 9(Pol3-CR)을 이용하여 PCR 증폭하여 사용하였다.
<3-2> ADE2 유전자 단편서열을 포함하는 교정기능이 결여된 Pol3 발현벡터 제작
상기 실시예 <3-1>에서 제작된 발현 벡터에서 LEU2 유전자 단편서열을 ADE2 유전자 단편서열로 교체한 pHIF11 벡터를 추가로 제작하였다. 상기 ADE2 유전자 위치에 상동재조합에 의해 교정기능이 결여된 Pol3 단백질이 도입되면, ADE2 돌연변이 균주가 되어 붉은색 형질전환 균주를 형성하기 때문에, 형질전환된 균주를 더욱 용이하게 확보할 수 있다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에서 제작된 pHIF8 벡터를 제한효소 SmaI 및 NheI으로 절단하여 LEU2 부분을 제거한 7.3 kb의 서열 단편, 및 상기 pHIF8을 주형으로 서열번호 14(pHIF8Zeo-U) 및 서열번호 15(pHIF8Zeo-D)의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 지오신 내성 유전자 1.3 kb의 서열 단편을 제한효소 SmaI 및 NheI으로 절단한 후, 연결하여 pHIF10 벡터를 제조하였다.
또한, 1.06 kb의 ADE2-C/N 단편은 한세눌라 폴리모파의 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 쌍 서열번호 16(HpADE2C-Fw)와 서열번호 17(HpADE2C-Rev)를 이용하여 PCR 증폭한 0.54 kb의 ADE2 유전자 C-말단 번역 단편과 프라이머 쌍 서열번호 18(HpADE2N-Fw)과 서열번호 19(HpADE2N-Rev)을 이용하여 PCR 증폭한 0.52 kb의 ADE2 유전자 N-말단 번역 단편을 확보하였다.
또한, 제한효소 NotI 및 NheI으로 절단한 pHIF10 벡터, 제한효소 NotI 및 NsiI으로 절단한 ADE2 유전자 C-말단 번역 단편, 및 제한효소 NheI 및 NsiI으로 절단한 ADE2 유전자 N-말단 번역 단편의 세 조각을 연결하여 pHIF11 벡터를 확보하였다.
< 실시예 4> 교정기능이 결여된 Pol3 유전자가 도입된 한세눌라 폴리모파 균주 제작
교정기능이 결여된 Pol3 유전자가 도입된 한세눌라 폴리모파 균주를 제작하기 위하여, 상기 <실시예 3>의 방법으로 제작된 돌연변이 유도용 발현벡터 pHIF8 또는 pHIF11을 제한효소 NsiI으로 절단하여 선형으로 만든 후, 한세눌라 폴리모파 DL1-LdU 균주에 형질전환 후, 유라실 영양요구성 상실 및 지오신 항생제 내성 확인을 통해 형질전환 균주를 제작하였다.
구체적으로, 한세눌라 폴리모파 균주에 삽입을 위해 pHIF8 또는 pHIF11 벡터 5 μg을 NsiI 제한효소를 이용하여 16시간 절단하고 아가로스 DNA 전기영동을 통해 절단이 확인되어진 벡터 DNA를 추출한 후, 추출되어진 선형의 pHIF8 또는 pHIF11 벡터는 한세눌라 폴리모파 DL1-LdU 균주에 형질 전환하였다.
그 방법은 다음과 같다. 한세눌라 폴리모파 DL1-LdU 균주 50 ml을 600 nm의 파장에서 광학밀도가 0.6이 되도록 500 ml의 플라스크에서 30℃, 200 rpm으로 교반 배양시킨다. 이렇게 배양된 세포는 원심분리기의 침전과정을 거쳐, 배지와 세포로 분리하고, 분리된 세포는 1x TE / 0.1 M LiAc 완충액을 이용하여 2 ~ 3 회 세정과정을 수행한다. 세정과정 이후, 최종 양이 500 μl가 되도록 세포를 풀어주고, 이것이 한세눌라 폴리모파의 형질전환 세포가 된다. 형질전환 세포 100 μl와 연어정자(salmon sperm) DNA 10 μl, 선형의 pHIF8 벡터 1 μg, PEG / 0.1 LiAc 완충액 600 μl를 잘 섞어주고, 30℃에서 30분간 반응 후, 추가적으로 70 μl의 DMSO를 넣어준 뒤 42℃에서 15분간 열충격 반응을 준다. 다음은 얼음에서 약 5분간 식힌 후, 원심분리기를 이용하여 세포와 완충액을 분리하고 증류수로 1 ~ 2회 완충액을 씻어낸 후, 최종적으로 100 μl가량의 TE 완충액으로 풀어서 선택적 배지(Sc-ura-)에 도말하였다. 이렇게 확보한 유라실 영양요구성이 상실되고 항생제 지오신에 대한 내성을 보이는 형질전환 균주를 배양하였고, pHIF8 벡터가 형질전환된 균주의 경우 DNA를 추출하여 프라이머 쌍 서열번호 10(LEU2-N) 및 서열번호 13(LEU2-C)를 이용하여 pHIF8이 염색체의 LEU2 유전자 위치에 상동재조합에 의해 삽입되었음을 확인하였고, 아울러, pHIF11 벡터가 형질전환된 한세눌라 폴리모파 균주는 붉은 색을 나타냄으로써, pHIF11이 염색체의 ADE2 유전자 위치에 상동재조합에 의해 삽입되었음을 확인하였다(도 3c).
< 실시예 5> 한세눌라 폴리모파 균주의 무작위 돌연변이능 조사
돌연변이 유도용 pHIF8 벡터를 도입한 한세눌라 폴리모파 균주의 돌연변이 유발능을 측정하기 위하여, 상기 pHIF8 벡터가 도입된 한세눌라 폴리모파 균주를 메탄올이 2% 포함된 YP(1% Yeast extract, 2% Peptone) 배지에 접종하여 37℃에서 180 rpm으로 진탕배양 하였다. 메탄올 옥시다아제 프로모터에 연결된 돌연변이 Pol3 유전자의 발현을 효율적이고 지속적으로 유도하기 위하여 매 24시간 단위로 2% 메탄올을 추가 주입하였으며, 4시간 단위로 배양액 표본을 추출하여 5-플루오로오로토산(5-Fluoroororic Acid, 5-FOA) 한천배지에 도말하여 5-FOA 내성을 보이는 돌연변이체 출현빈도를 측정하였다.
그 결과, 도 4 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 배양 시간이 지남에 따라 돌연변이 출현빈도가 증가하였으며 배양시작 48시간 후 모균주와 비교하여 약 100정도 증가한 5-FOA 내성 돌연변이 출현빈도를 확인하였다(도 4 및 표 2).
돌연변이 유도 벡터 삽입에 따른 돌연변이 유발 빈도 차이 비교
Plasmid Strain Frequency of colonies
- DL1-L (3.9 ± 0.6) × 10-10
pHIF8 DL1-LdU (4.4 ± 0.22) × 10-8
< 실시예 6> pHIF8 벡터를 이용한 자일로스 대사능이 증대된 한세눌라 폴리모파 균주의 선별
돌연변이 유도 pHIF8가 도입된 한세눌라 폴리모파 균주를 이용하여 오탄당인 자일로스(xylose)를 탄소원으로 이용하여 성장하는 능력이 증대된 돌연변이 균주를 선별하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 5>와 동일한 방법으로 메탄올을 포함하고 있는 YPM 배지에서 pHIF8가 도입된 한세눌라 폴리모파 균주를 배양하며 시간대별로 표본을 추출하여 2%의 자일로스를 포함하고 있는 YPX 한천배지에 도말하여 세포 성장속도가 빠른 돌연변이체만을 선별하였다. 이렇게 확보된 균주들의 자일로스 대사능을 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 야생형 균주(DL1-L)와 비교하여 선발된 균주(X15-2)는 배양액을 집적한 한천배지(도 5a)에서 뿐만 아니라 액체배지(도 5b)에서도 야생형 균주와 비교하여 약 50 %가량 성장속도가 증가함을 확인하였다(도 5).
< 실시예 7> 표적형질을 갖는 한세눌라 폴리모파 균주의 제작
상기 <실시예 6>에서 선발된 자일로스 대사능이 증진된 균주에 추가적인 무작위 돌연변이가 축적되는 것을 방지하기 위해서는 염색체에 도입되어 있는 돌연변이 유도 Pol3* 유전자 발현벡터를 제거할 필요가 있다. 이를 위해 우선 한세눌라 폴리모파 염색체 DNA를 주형으로 프라이머 쌍 서열번호 10(HpLEU2N-Fw) 및 서열번호 13(HpLEU2C-Rev)를 이용하여 PCR 증폭한 1 kb의 야생형 LEU2 유전자 단편을 확보하였다. 이렇게 확보한 LEU2 단편을 pHIF8 형질전환 균주를 바탕으로 확보한 돌연변이 한세눌라 폴리모파균에 전술한 방법으로 형질전환하였다. 이때, 형질전환균주의 염색체상 pHIF8 벡터 서열이 삽입되어 있는 LEU2 유전자 N-말단 및 C-말단의 단편서열과 형질전환되는 LEU2 단편사이에 상동재조합이 일어나면서 pHIF8 벡터 서열이 염색체에서 제거되게 된다. 이렇게 확보한 pHIF8 제거 균주는 PCR과 유라실 영양요구성, 지오신 내성 소실 등을 통해 확인하였다.
또한, 상기 pHIF8을 제거한 후, 해당 균주의 증진된 자일로스 대사능이 유지되는지 확인하기 위하여 전술한 바와 같이 자일로스 포함 배지에 세포성장을 분석하였으며, 그 결과 증대된 자일로스 대사능을 유지하고 있음을 확인하였다(도 5d).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for genome-wide random mutagenesis of Hansenula polymorpha <130> 13p-07-58 <150> KR10-2012-0113279 <151> 2012-10-12 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1102 <212> PRT <213> Hansenula polymorpha <400> 1 Met Ser Ala Thr Thr Ser Lys His Ala Gly Asp Ala Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Pro Asn Lys Arg Gln His Leu Asp Ile Ser Val Asp Asp Gly Val Gly 20 25 30 Thr Ala Thr Ala His Ser Leu Pro Thr Ala Asn Gln Ser Ile Thr Pro 35 40 45 His Gly Tyr His Leu Pro Val His Gly Lys Phe Asp Arg Gln Lys Leu 50 55 60 His Asn Lys Leu Thr Gly Gly Gln Phe Glu Asn Glu Ala Ser Thr Phe 65 70 75 80 Glu Lys Glu Leu Val Ser Met Ser Lys Lys Glu Ser Glu Ala Ser Val 85 90 95 Gln Ser Asp Arg Gln Arg Trp Asp Arg Pro Ala Val Val Gly Tyr Asp 100 105 110 Pro Ala Thr Tyr Asp Val Asp Phe Gln Gln Leu Asp Ala Glu Glu Thr 115 120 125 Leu Ile Asn Asp Glu Ala Ala Val Arg Phe Phe Gly Val Thr Glu Glu 130 135 140 Gly Tyr Ser Val Leu Cys Asn Val Val Gly Phe Arg His Tyr Phe Tyr 145 150 155 160 Val Pro Val Pro Lys Gly Leu Thr Gln Asp Asp Leu Gly Asp Phe His 165 170 175 Lys Tyr Leu Arg Thr Asn Tyr Gln Gly Val Gln Gly Leu Glu Ile Ala 180 185 190 Leu Lys Glu Ser Ile Trp Gly Tyr Asn Asn Asn Thr Lys Leu Pro Phe 195 200 205 Leu Lys Val Val Val Asp Gly Ile Lys His Ile Gly Lys Val Arg Ser 210 215 220 Ala Phe Glu Arg Gly Glu Ile Glu Tyr Lys Gly Leu Phe Pro Pro Thr 225 230 235 240 Gly Ser Met Thr Phe Asp Asn Ile Gln Phe Leu Leu Arg Met Met Val 245 250 255 Asp Cys Arg Ile Thr Gly Met Gly Trp Leu Arg Ala Pro Ala Gly Thr 260 265 270 Tyr Thr Pro Val Pro Pro Glu Lys Val Val Ser Thr Cys Gln Leu Glu 275 280 285 Phe Thr Ile His Tyr Lys Asp Leu Val Ser His Ala Ser Glu Gly Lys 290 295 300 Tyr Leu Asn Met Ala Pro Leu Arg Ile Leu Ser Phe Asp Ile Glu Cys 305 310 315 320 Ala Gly Arg Lys Gly Ile Phe Pro Glu Ala Glu His Asp Pro Val Ile 325 330 335 Gln Ile Ala Asn Val Val Ala Lys Ala Gly Asp Pro Val Pro Phe Val 340 345 350 Arg Asn Val Phe Thr Val Lys Ser Cys Ala Pro Ile Val Gly Ser Glu 355 360 365 Thr Phe Ser Tyr Glu Ser Glu Glu Glu Met Leu Leu Lys Trp Lys Glu 370 375 380 Phe Ile Val Lys Val Asp Pro Asp Val Ile Ile Gly Tyr Asn Ile Ala 385 390 395 400 Asn Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ile Asn Arg Ala Arg Ala Leu Gly Val 405 410 415 His Asp Phe Pro Tyr Phe Ser Arg Leu Lys Asn Ser Lys Gln Glu Ile 420 425 430 Lys Asp Thr Phe Phe Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Arg Glu Asn Lys 435 440 445 Val Val Asn Ile Glu Gly Arg Met Gln Leu Asp Leu Leu Gln Phe Ile 450 455 460 Gln Arg Glu Tyr Lys Leu Arg Ser Tyr Thr Leu Asn Ala Val Ser Ala 465 470 475 480 His Phe Leu Asn Glu Gln Lys Glu Asp Val Gln His Ser Ile Ile Thr 485 490 495 Asp Leu Gln Asn Gly Asn Gln Glu Thr Arg Arg Arg Leu Ala Val Tyr 500 505 510 Cys Leu Lys Asp Ala Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Ala Glu Lys Leu Met 515 520 525 Cys Leu Val Asn Tyr Thr Glu Met Ala Arg Val Thr Gly Val Pro Phe 530 535 540 Ser Phe Leu Leu Ser Arg Gly Gln Gln Ile Lys Val Ile Ser Gln Leu 545 550 555 560 Phe Arg Lys Cys Leu Asp Leu Asp Ile Val Ile Pro Asn Ile Lys Ser 565 570 575 Glu Gly Val Asn Glu Glu Tyr Glu Gly Ala Thr Val Ile Glu Pro Val 580 585 590 Arg Gly Tyr Tyr Asp Val Pro Ile Ala Thr Leu Asp Phe Ala Ser Leu 595 600 605 Tyr Pro Ser Ile Met Met Ala His Asn Leu Cys Tyr Thr Thr Leu Leu 610 615 620 Asn Lys Gln Thr Val Glu Arg Leu Gly Leu Lys Gln Asp Glu Asp Tyr 625 630 635 640 Ile Val Thr Pro Asn Gly Asp Met Phe Val His Pro His Leu Arg Lys 645 650 655 Gly Ile Leu Pro Thr Ile Leu Gln Glu Leu Leu Ala Ala Arg Lys Lys 660 665 670 Ala Lys Gln Asp Leu Lys Lys Glu Thr Asp Pro Phe Lys Lys Gln Val 675 680 685 Leu Asn Gly Arg Gln Leu Ala Leu Lys Ile Ser Ala Asn Ser Val Tyr 690 695 700 Gly Phe Thr Gly Ala Thr Ile Gly Lys Leu Pro Cys Leu Ala Ile Ser 705 710 715 720 Ser Ser Val Thr Ala Phe Gly Arg Val Met Ile Glu Gln Thr Lys Ala 725 730 735 Glu Val Gln Arg His Tyr Ser Ile Glu Asn Gly Tyr Glu Tyr Asp Ala 740 745 750 Gln Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Val Met Val Lys Phe Gly His 755 760 765 Ser Asp Met Glu Thr Cys Met Arg Leu Gly Glu Glu Ala Ala Ala Tyr 770 775 780 Val Ser Thr Lys Phe Lys His Pro Ile Lys Leu Glu Phe Glu Lys Val 785 790 795 800 Tyr Phe Pro Tyr Leu Leu Ile Asn Lys Lys Arg Tyr Ala Gly Leu Phe 805 810 815 Trp Thr Asn Pro Arg Lys Phe Asp Lys Met Asp Thr Lys Gly Ile Glu 820 825 830 Thr Val Arg Arg Asp Asn Cys Arg Leu Val Gln Asn Val Ile Thr Arg 835 840 845 Val Leu Glu Leu Ile Leu Glu Glu Arg Asn Val Glu Ala Ala Glu Gln 850 855 860 Phe Val Lys Lys Thr Ile Ala Asp Leu Leu Gln Asn Arg Val Asp Leu 865 870 875 880 Ser Gln Leu Val Ile Ser Lys Ala Leu Ser Arg Gln Asp Tyr Ala Ala 885 890 895 Lys Gln Pro His Val Glu Leu Ala Glu Arg Met Arg Lys Arg Asp Ala 900 905 910 Gly Ser Ala Pro Thr Leu Gly Asp Arg Val Ala Tyr Val Ile Ile Lys 915 920 925 Thr Ala Gly Asp Lys Asn Tyr Glu Lys Ser Glu Asp Pro Leu Tyr Val 930 935 940 Leu Glu Asn Ser Leu Pro Ile Asp Thr Lys Tyr Tyr Leu Glu Asn Gln 945 950 955 960 Leu Ala Asn Pro Leu Thr Arg Ile Phe Glu Pro Ile Leu Gly Glu Arg 965 970 975 Arg Thr Lys Glu Leu Leu His Gly Ser His Thr Arg Thr Val Ala Val 980 985 990 Ser Ala Ala Lys Thr Gly Gly Leu Met Lys Phe Ala Arg Lys Ser Asn 995 1000 1005 Thr Cys Lys Asn Cys Lys Ser Pro Ile Pro Ala Gly Glu Ala Leu Cys 1010 1015 1020 Arg Asn Cys Gln Gly Met Ala Gly Glu Leu Tyr Gly Arg Glu Leu Ala 1025 1030 1035 1040 Lys Met Asn Asn Leu Glu Thr Lys Phe Ser Arg Leu Trp Thr Glu Cys 1045 1050 1055 Gln Arg Cys Gln Gly Ser Leu His Gln Glu Val Leu Cys Ser Asn Lys 1060 1065 1070 Asp Cys Pro Ile Phe Tyr Met Arg Lys Lys Cys Gln Lys Asp Val Leu 1075 1080 1085 Asn Gln Ala Glu Glu Leu Lys Lys Trp Asp Ala Ala Ala Trp 1090 1095 1100 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHIF5-U <400> 2 gagcatatgc acgctagcac tggcaattta ccagtag 37 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHIF5-D <400> 3 ctccatatga actgcagtga cgtcgatctc tacaacga 38 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMOX-N <400> 4 ttcgctagcc ctcgagctgt tcgc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMOX-C <400> 5 gggcatatga attcaagctt ttgt 24 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpPOL3N-Fw <400> 6 tctgaattcg ctagccatat gagtgcaact acgtcg 36 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpPOL3N-Rev <400> 7 tctcccggga cgcgccggca aatgaca 27 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpPOL3C-Fw <400> 8 tttgtcattt gccggcgcgt gt 22 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpPOL3C-Rev <400> 9 tgtaagctta tgcatcaggt tgtctaggag g 31 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpLEU2N-Fw <400> 10 tctgaattca tgcattgtgc ttctccctg 29 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpLEU2N-Rev <400> 11 ctcaagcttc gctctgcagc gccaa 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpLEU2C-Fw <400> 12 cacgaattct gcagagcgac ccacc 25 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpLEU2C-Rev <400> 13 tctaagctta tgcatgagta gcttggccac ct 32 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHIF8Zeo-U <400> 14 tcccccggga cttcgtggag g 21 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHIF8Zeo-D <400> 15 ctagctagca taagaatgcg gccgcgagtt ttcgttccac tgagcgtc 48 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpADE2C-Fw <400> 16 ataagaatgc ggccgcaaag agccagaaaa caacacaggt g 41 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpADE2C-Rev <400> 17 tgcatgcatt cttcatagcc aacagagccc aac 33 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpADE2N-Fw <400> 18 tgcatgcata gtgatggtgg tgcggggtc 29 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpADE2N-Rev <400> 19 ctagctagca gacaatgttg atatgaccca gtttcc 36 <210> 20 <211> 3306 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 20 atgagtgcaa ctacgtcgaa acacgcaggt gacgcgcgtt tggaggggcc gaacaaacgc 60 cagcacctgg acatttctgt cgacgacggt gtgggcacgg ccacggcgca ctcgctgccg 120 acggcaaacc agtcgatcac cccccacggg taccatttgc ctgtacacgg caagttcgac 180 cgccagaagc tccataacaa gctgacgggc ggacagtttg agaacgaggc aagcactttt 240 gagaaagagc tcgtgtcaat gtccaagaag gagtcggagg ccagcgtcca gagcgacagg 300 caaagatggg atcgtcccgc ggtggtgggg tacgatccgg ccacgtacga cgtggacttc 360 cagcagctgg atgctgagga gacgctgatc aatgatgagg ccgcagtgcg gttttttggg 420 gtcactgagg aagggtactc ggtgctgtgc aacgttgtag ggtttcgaca ctatttttac 480 gtgccagtgc caaagggcct gacgcaggac gatctgggcg acttccacaa gtatctgcgc 540 acaaactacc agggtgtaca agggctggag attgcgctta aggagagcat ctggggctac 600 aataataaca caaagctgcc gtttcttaaa gtggtggtgg acggcattaa gcacatcggc 660 aaggtgcgct cggcatttga acgcggtgag attgagtaca aaggcctgtt tccgcctact 720 ggatcgatga cgtttgacaa tatccagttt ctgctgcgga tgatggtgga ttgtcgtatc 780 acaggtatgg gctggctgcg ggcgccagcg ggaacttaca cgccagtgcc gccagagaag 840 gttgtttcaa cgtgccagct ggagtttacc atccactaca aggaccttgt gtcgcacgct 900 tcggagggca aatacctgaa catggctcca ttgcggattt tgtcatttga cattgagtgt 960 gcgggccgca agggcatttt ccccgaggcg gaacacgacc cggtgatcca gatcgcgaac 1020 gtggtggcta aggcgggtga cccggtgccg tttgtgcgca atgtgttcac tgtcaagtcg 1080 tgtgcgccga tcgtcgggtc agagacgttt tcgtacgagt ctgaggagga gatgctgctc 1140 aaatggaagg agttcatcgt caaggtggat ccggacgtga tcatcgggta caacattgcc 1200 aactttgact tcccgtacct gatcaacagg gctcgggcgc tcggcgtcca cgacttcccg 1260 tacttctcgc gtctgaagaa tagcaagcag gagatcaagg acacattttt cagctcgcgc 1320 gcgtacggca gccgcgaaaa caaggtggtc aatattgagg gccgcatgca gctggacctg 1380 ctccaattca tccagcgcga gtacaagctg cgctcgtaca cgctgaacgc ggtgtcggca 1440 cattttctta acgaacagaa agaggatgtg cagcactcga tcatcacaga tctccagaac 1500 ggcaaccagg agaccagaag gcggctggca gtgtactgtc tgaaagacgc gtacttgccg 1560 ttgcgactag ccgaaaaact catgtgtctg gtcaactaca cagagatggc cagggtgacc 1620 ggcgtgccgt tcagtttcct gctctcgcgt ggccagcaga ttaaggtcat ctcgcagctg 1680 ttccgcaagt gtctggacct ggacattgtg atcccgaaca tcaagtcgga gggcgtgaac 1740 gaggagtacg agggagccac cgtgatcgag cctgtgcgtg gctactacga cgtgccgatc 1800 gcaacgctcg actttgcctc gctgtaccca tcgatcatga tggcgcacaa cctgtgctac 1860 acgacgctgc taaacaagca gacagttgaa cggctgggct tgaagcagga cgaggattac 1920 atagtcacgc cgaacggcga catgttcgtg cacccgcatc tgcggaaggg cattttgcca 1980 acgattttgc aggaactgct tgcagcacgg aagaaagcaa agcaggatct gaaaaaggag 2040 acagacccgt tcaagaaaca ggtgttgaac ggacggcagc ttgcactgaa aatctcggcc 2100 aactcggtgt acgggtttac gggcgcgaca atcggaaaac tgccctgttt ggccatttcg 2160 tcgtctgtga cggcgttcgg ccgtgtcatg atcgagcaga ccaaggccga ggtccagcgc 2220 cactacagca tcgaaaacgg gtacgagtat gacgcccagg tcatctatgg tgataccgac 2280 tccgtgatgg tcaagttcgg ccacagcgac atggaaacgt gcatgcggct cggcgaagag 2340 gcggcggcct acgtctcgac caagttcaag caccctatca aacttgagtt cgagaaggtg 2400 tacttccctt acctgctcat taataaaaaa cgatatgcgg ggctgttctg gaccaacccg 2460 cgcaagttcg ataagatgga caccaagggt atcgaaacgg tgcgtcggga caactgccga 2520 ttggttcaga acgttatcac gcgggtcctg gagttgattc tggaggagcg aaacgtggaa 2580 gctgcagagc agtttgtcaa gaaaacgatc gcggacctgc tccagaaccg cgtcgacctg 2640 tcacaactgg ttatcagtaa ggctttgtca cgtcaagact acgccgccaa acagccgcac 2700 gtggaacttg cggagcggat gcgcaagaga gacgctggtt cggcccctac gctcggcgac 2760 cgtgttgctt atgtcatcat caagacggcc ggagataaga attacgagaa gagcgaggat 2820 ccgttgtacg tgctagaaaa ctcgctgccg atcgacacca agtattactt ggagaaccag 2880 ctggcgaatc cactgacgcg gattttcgag ccgattttgg gcgagcgtcg caccaaagaa 2940 ctgcttcacg gctcccacac gcggacggtt gccgtgagcg cggcaaagac gggagggttg 3000 atgaaatttg cccgaaagag caacacatgc aaaaactgta agtcgcctat tcctgcgggc 3060 gaagctctgt gccgaaactg tcagggtatg gcgggagagt tgtacggacg cgagctggct 3120 aaaatgaaca acctggagac caagttcagt cggctttgga ccgagtgtca gcgttgccag 3180 ggctcgctac accaggaagt tttgtgttcc aacaaggact gtccaatctt ctacatgcgg 3240 aagaagtgtc agaaagacgt tttgaatcaa gcggaggagc taaaaaagtg ggacgcggct 3300 gcctgg 3306

Claims (10)

1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Pol3 단백질에서 317D I E319 아미노산 잔기가 각각 317A G A319로 치환되도록 상기 Pol3 단백질을 암호화하는 유전자를 돌연변이 시켜 핵산말단분해효소 활성이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질 발현 유전자를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 돌연변이된 유전자, 복제원점, 프로모터, 및 LEU2 유전자 단편(LEU2-C/N) 또는 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 발현벡터를 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 균주에 형질전환시켜 교정기능이 결손된 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 무작위 돌연변이(random mutagenesis) 유도용 한세눌라 폴리모파 균주의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 Pol3 단백질을 암호화하는 유전자는 한세눌라 폴리모파로부터 유래된 것을 특징으로 하는 무작위 돌연변이 유도용 한세눌라 폴리모파 균주의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 LEU2 유전자 단편을 포함하는 발현벡터는 도 3a의 벡터 맵(map)을 갖는 pHIF8 벡터인 것을 특징으로 하는 무작위 돌연변이 유도용 한세눌라 폴리모파 균주의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 ADE2 유전자 단편을 포함하는 발현벡터는 도 3b의 벡터 맵(map)을 갖는 pHIF11 벡터인 것을 특징으로 하는 무작위 돌연변이 유도용 한세눌라 폴리모파 균주의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 한세눌라 폴리모파는 한세눌라 폴리모파 DL1-LdU 균주인 것을 특징으로 하는 무작위 돌연변이 유도용 한세눌라 폴리모파 균주의 제조방법.
1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Pol3 단백질에서 317D I E319 아미노산 잔기가 각각 317A G A319로 치환되도록 상기 Pol3 단백질을 암호화하는 유전자를 돌연변이 시켜 핵산말단분해효소 활성이 결여된 돌연변이 Pol3 단백질 발현 유전자를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 돌연변이된 유전자, 복제원점, 프로모터, 및 LEU2 유전자 단편(LEU2-C/N) 또는 ADE2 유전자 단편(ADE2-C/N)을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 발현벡터를 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 균주에 형질전환시켜 교정기능이 결손된 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 한세눌라 폴리모파 균주를 제조하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 돌연변이 Pol3 효소를 발현하는 한세눌라 폴리모파 균주를 배양하여 무작위 돌연변이를 균주를 유발시키는 단계;
5) 상기 단계 4)의 무작위 돌연변이 균주들 중에서 표적형질을 갖는 돌연변이 균주를 선별하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)의 선별된 돌연변이 균주 중에서 무작위 돌연변이가 축적되는 것을 방지하기 위해, 돌연변이 벡터를 제거하는 단계를 포함하는 한세눌라 폴리모파 균주의 무작위 돌연변이(random mutagenesis) 유도방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 LEU2 유전자 단편을 포함하는 발현벡터는 도 3a의 벡터 맵(map)을 갖는 pHIF8 벡터인 것을 특징으로 하는 한세눌라 폴리모파 균주의 무작위 돌연변이 유도방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 ADE2 유전자 단편을 포함하는 발현벡터는 도 3b의 벡터 맵(map)을 갖는 pHIF11 벡터인 것을 특징으로 하는 한세눌라 폴리모파 균주의 무작위 돌연변이 유도방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 3)의 한세눌라 폴리모파는 한세눌라 폴리모파 DL1-LdU 균주인 것을 특징으로 하는 한세눌라 폴리모파 균주의 무작위 돌연변이 유도방법.
제 6항에 있어서, 단계 6)의 벡터의 제거는 LEU2 또는 ADE2 유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭한 후, 형질전환하여 상동 재조합 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 한세눌라 폴리모파 균주의 무작위 돌연변이 유도방법.
KR20130097463A 2012-10-12 2013-08-16 유전체 수준의 무작위 돌연변이 유도기술 KR101508635B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120113279 2012-10-12
KR20120113279 2012-10-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140047520A KR20140047520A (ko) 2014-04-22
KR101508635B1 true KR101508635B1 (ko) 2015-04-07

Family

ID=50654079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20130097463A KR101508635B1 (ko) 2012-10-12 2013-08-16 유전체 수준의 무작위 돌연변이 유도기술

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101508635B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008220172A (ja) 2006-07-14 2008-09-25 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 酵母の製造方法、酵母、及び糖タンパク質又はβ−グルカンの製造方法
JP2011507512A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 グライコフィ， インコーポレイテッド タンパク質の製造のための酵母株

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008220172A (ja) 2006-07-14 2008-09-25 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 酵母の製造方法、酵母、及び糖タンパク質又はβ−グルカンの製造方法
JP2011507512A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 グライコフィ， インコーポレイテッド タンパク質の製造のための酵母株

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
인터넷자료1- 연구보고서, BINT융합기술개발사업 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140047520A (ko) 2014-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7846712B2 (en) L-arabinose fermenting yeast
US7833764B2 (en) DNA encoding xylitol dehydrogenase
US20090053784A1 (en) Expression of an active carrier from xylose in genetically modified saccharomyces cerevisae
CN111549012B (zh) 核糖激酶突变体及其应用
CN108034667B (zh) 一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用
Hon et al. Development of a plasmid-based expression system in Clostridium thermocellum and its use to screen heterologous expression of bifunctional alcohol dehydrogenases (adhEs)
US11913016B2 (en) Synthetic yeast cells and methods of making and using the same
JP2009027999A (ja) シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするｄｎａ、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼの製造方法、及び、イタコン酸の製造方法
US20140162335A1 (en) Recombinant Yeast Expressing AGT1
KR101508635B1 (ko) 유전체 수준의 무작위 돌연변이 유도기술
CN110628748A (zh) 提高比活的α-淀粉酶突变体BasAmy-2及其编码基因和应用
CN111073864B (zh) 提高苹果酸产量的新突变蛋白
DK2844731T3 (en) MUSHROOM CELLS WHICH MAKE REDUCED QUANTITIES OF PEPTAIBOLS
WO2007143247A2 (en) Cloning and characterization of l-arabinose transporters from non-conventional yeast
JP2018033399A (ja) 酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母の作出方法
US20190002873A1 (en) Methods and compositions for creating altered and improved cells and organisms
KR101837130B1 (ko) 효모 캔디다 뷰티리 sh-14 유래의 신규 리파아제 및 그의 용도
EP3080253B1 (en) Mutant nnk1 allele and its use
CN114395571B (zh) 三角褐指藻zep1基因、蛋白及应用
KR101392968B1 (ko) 신규한 자기복제서열 및 이의 용도
KR101050125B1 (ko) 고온 내성을 갖는 효모 변이체
CN116949086A (zh) 利用马克斯克鲁维酵母重组表达血红蛋白的方法
KR20200135469A (ko) 자일로스 대사 효모
AU2015213393A1 (en) Recombinant yeast expressing AGT1
AU2006277127A2 (en) Expression of an active carrier for xylose in genetically modified Saccharomyces cerevisiae

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180205

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190207

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200204

Year of fee payment: 6