CN116949086A - 利用马克斯克鲁维酵母重组表达血红蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体为利用马克斯克鲁维酵母重组表达血红蛋白的方法。本发明采用合成生物学的技术,通过优化马克斯克鲁维酵母合成血红素的合成途径,包括优化血红素前体物5‑氨基乙酰丙酸(5‑ALA)合成途径,优化血红素的下游合成途径基因,敲除马克斯克鲁维酵母血红素降解与蛋白质降解途径的基因,提升大豆血红蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达量;在此基础上,利用基因组编辑技术,敲除马克斯克鲁维酵母血红素与蛋白降解途径的关键基因LSC1和SSN3,进一步提高血红素及血红蛋白的产量。本发明还进行了大豆血红蛋白密码子优化与重组菌株发酵条件优化,实现了大豆血红蛋白高效重组表达,产量达到7.27g/L。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及利用马克斯克鲁维酵母重组表达血红蛋白的方法。
背景技术
植物血红蛋白是一种单体蛋白,分成三种类型:共生血红蛋白、非共生血红蛋白和截短的血红蛋白。其中,共生血红蛋白首次在与根瘤菌共生的植物根瘤中发现的,这些植物通常是豆科植物,因此这些蛋白质被称为豆血红蛋白。豆血红蛋白仅有一条肽链和一个血红素辅基组成,具有更高的氧亲和力,有助于促进固氮所需的氧气扩散,保持细菌固氮酶所需的低游离氧浓度。非共生血红蛋白存在于所有植物中,具有高氧亲和力和较小的氧解离速率常数。在拟南芥中发现了截短血红蛋白,但目前发现的种类较少,具体功能还不清晰。
最初Mark等人从根瘤cDNA文库中克隆了大豆血红蛋白(LBA)的cDNA,并在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得了10mg/L的产物(Duff et al.,J Biol Chem,1997,272:16746-52)。在毕赤酵母KU70缺失菌株中,通过启动子AOX1p驱动血红素合成基因(HEM1、HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14和HEM15)的过表达、通过组成型启动子TEF1p和诱导型AOX1p相结合驱动珠蛋白LegH的高表达、并回补工程菌株KU70基因,提高菌株的稳定性,发酵罐中豆血红蛋白分泌表达产量3.5g/L(Shao et al.,Bioresour Technol.2022,5;363:127884)。
血红素是血红蛋白结构中至关重要的辅基,由亚铁离子和原卟啉IX组成,提高血红蛋白的一个核心策略就是维持细胞内高血红素的含量。血红素合成途径的关键前体是5-氨基乙酰丙酸(5-ALA),根据生物体的种类可以将5-ALA合成方式分为C4途径和C5途径,并经过七步催化反应合成血红素。在大肠杆菌中通过组合过表达下游途径关键酶,优化血红素合成途径,并敲除血红素降解酶yfex基因和乳酸、乙酸形成的基因LDHA和PTA,在摇瓶培养后能产生7.88mg/L的总血红素和1.26mg/L的分泌血红素(Zhao et al.,Nat Catal,2018,1:720-8)。由于研究表明细胞内高浓度的血红素对细胞生长有不利影响(Anzaldi etal.,Infect Immun,2010,78:4977-89),所以该研究团队继续过表达了血红素出口蛋白(CcmABC),提高了菌株分泌血红素的能力,分批补料发酵可获得115.5mg/L的总血红素,其中胞外分泌血红素为73.4mg/L,占总血红素的63.5%。Young等人开发一种利用谷氨酸棒状杆菌系统代谢工程和膜表面修饰技术高产血红素的方法(Ko et al.,Metab Eng,2021,66:217-28)。通过C4和C5途径结合提高血红素合成前体的代谢通量、对下游途径关键蛋白进行组合过表达进一步优化合成途径、全面上调血红素代谢以缓解代谢紊乱、过表达转运蛋白A(HrtA)和B(HrtB)和细胞色素C出口蛋白(CcsA)、破坏作为血红素结合膜蛋白的Hrrs、HtaA和HmuT蛋白、并通过处理ETB改变细胞膜脂质成分,该谷氨酸棒状杆菌工程菌补料分批发酵的最高血红素产量为309.18±16.43mg/L,其中分泌血红素为242.95±11.45mg/L,均为文献报道的最高值。在酿酒酵母中,使用基因组规模代谢模型(GEM)Yeast8,确定平衡生物量和增加血红素产量的84个基因,并通过修饰目标基因来增加血红素的含量,最终工程菌株产生的细胞内血红素水平为53.5mg/L。(Shchuk et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2022,119:e2108245119)。
马克斯克鲁维酵母是已报道的食品安全级酵母,具有耐高温、快速生长和能利用多种氮源、碳源等优点,在工业生产中具有广泛应用,但在马克斯克鲁维酵母中血红素合成途径的改造与大豆血红蛋白表达至今未见报道,缺乏提高血红素和血红蛋白表达能力的有效方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用马克斯克鲁维酵母高效重组表达血红蛋白的方法和应用。
本发明首先构建重组表达大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母重组菌株,具体是将编码大豆血红蛋白基因LBA克隆到马克斯克鲁维酵母重组表达载体pUKDN115(ZL2016108065380)中,构建大豆血红蛋白表达载体pUKDN115/LBA,然后转化马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株,获得重组表达大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母重组菌株,记为FIM-1ura3Δ-LBA。其中:
所述大豆血红蛋白,具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
所述马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株,是以马克斯克鲁维酵母FIM-1(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No.10621)作为出发菌株,通过常规分子生物学技术方法,敲除尿嘧啶合成基因URA3作为筛选标记构建获得。
本发明提供的利用马克斯克鲁维酵母高效重组表达血红蛋白的方法,采用合成生物学的技术,通过优化马克斯克鲁维酵母合成血红素的合成途径,包括优化血红蛋白辅因子血红素合成与降解、蛋白质降解途径等,提升大豆血红蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达量。
(一)所述的优化马克斯克鲁维酵母合成血红素合成途径,是通过优化血红素前体物5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)合成途径,提高马克斯克鲁维酵母合成血红素的产量。
进一步地,在马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株中利用质粒过量表达马克斯克鲁维酵母或酿酒酵母的C4合成途径HEM1基因,促进马克斯克鲁维酵母合成血红素,以及提高血红蛋白的重组表达水平。优选地,过量表达马克斯克鲁维酵母的血红素前体C4途径基因HEM1,血红素及卟啉含量提高了20.6%。
所述的马克斯克鲁维酵母HEM1基因,具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列和SEQID No.4所示的氨基酸序列。
所述的酿酒酵母HEM1基因,具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列和SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
(二)所述的优化马克斯克鲁维酵母合成血红素合成途径,是通过优化血红素的下游合成途径基因,提高马克斯克鲁维酵母合成血红素的产量。
进一步地,所述的血红素的下游合成途径基因包括HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14、HEM15等基因。
进一步地,在马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株中利用质粒过量表达马克斯克鲁维酵母或酿酒酵母HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14或HEM15基因,提升马克斯克鲁维酵母中血红素的合成和血红蛋白的重组表达,其中优选的下游合成途径的基因为马克斯克鲁维酵母HEM2、酿酒酵母HEM3、马克斯克鲁维酵母HEM4、酿酒酵母HEM12、马克斯克鲁维酵母HEM13、酿酒酵母HEM14和HEM15基因。
上述的马克斯克鲁维酵母HEM2基因,具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列和SEQID No.8所示的氨基酸序列。
上述的酿酒酵母HEM3基因,具有SEQ ID No.9所示的核苷酸序列和SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。
上述的马克斯克鲁维酵母HEM4基因,具有SEQ ID No.11所示的核苷酸序列和SEQIDNo.12所示的氨基酸序列。
上述的酿酒酵母HEM12基因,具有SEQ ID No.13所示的核苷酸序列和SEQ IDNo.14所示的氨基酸序列。
上述的马克斯克鲁维酵母HEM13基因,具有SEQ ID No.15所示的核苷酸序列和SEQIDNo.16所示的氨基酸序列。
上述的酿酒酵母HEM14基因,具有SEQ ID No.17所示的核苷酸序列和SEQ IDNo.18所示的氨基酸序列。
上述的酿酒酵母HEM15基因,具有SEQ ID No.19所示的核苷酸序列和SEQ IDNo.20所示的氨基酸序列。
进一步地,在马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株中,再敲除HIS3、TRP1基因,获得马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δhis3Δtrp1Δ。以马克斯克鲁维酵母5-ALA C4合成途径基因HEM1,分别和下游途径的马克斯克鲁维酵母HEM2、酿酒酵母HEM3、马克斯克鲁维酵母HEM4、酿酒酵母HEM12、马克斯克鲁维酵母HEM13、酿酒酵母HEM14或酿酒酵母HEM15基因过量共表达。每个过表达基因用了不同的启动子和终止子,具体为ADH1启动子与终止子调控HEM1,PDC1启动子与终止子调控HEM2,PGK1启动子与终止子调控HEM3,ENO2启动子与终止子调控HEM4,INU1启动子与终止子调控HEM12,AFT1启动子与终止子调控HEM13,TEF1启动子与终止子调控HEM14,OM45启动子与终止子调控HEM15,然后组合克隆到人工染色体载体KM-YAC上,转入马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δhis3Δtrp1Δ。其中,优选的过量共表达基因是马克斯克鲁维酵母HEM1和HEM2。
进一步地,本发明构建了包含马克斯克鲁维酵母5-ALA C4合成途径基因HEM1,马克斯克鲁维酵母HEM2、酿酒酵母HEM3、马克斯克鲁维酵母HEM4、酿酒酵母HEM12、马克斯克鲁维酵母HEM13、酿酒酵母HEM14,酿酒酵母HEM15基因等8个基因的人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,转入马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δhis3Δtrp1Δ,获得马克斯克鲁维酵母工程菌株KMC4D,重构了马克斯克鲁维酵母的血红素合成途径,血红素及卟啉含量提高了23%。
(三)本发明还通过敲除马克斯克鲁维酵母血红素降解与蛋白质降解途径的基因,提高马克斯克鲁维酵母合成血红素的产量。
进一步地,所述的血红素降解与蛋白质降解途径的基因包括马克斯克鲁维酵母LSC1、LSC2、PEP4、SSN3、VPS10、ROX1、TUP1、HAP1等。
进一步地,组合敲除LSC1和PEP4基因;或LSC1和SSN3基因;或LSC1、PEP4和VPS10基因;或LSC1、PEP4、VPS10和ROX1基因;或LSC1、PEP4、VPS10和SSN3基因;或LSC1、PEP4、VPS10、SSN3和TUP1基因,都能提高马克斯克鲁维酵母血红素合成和血红蛋白表达量,其中优选地,组合敲除是LSC1和SSN3基因,构建获得马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δ,血红素及卟啉含量提高了88%。
所述的马克斯克鲁维酵母LSC1基因,具有SEQ ID No.21所示的核苷酸序列和SEQIDNo.22所示的氨基酸序列。
所述的马克斯克鲁维酵母SSN3基因,具有SEQ ID No.23所示的核苷酸序列和SEQIDNo.24所示的氨基酸序列。
进一步地,在马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δ菌株中,再敲除HIS3、TRP1基因后获得马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ。将构建的人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,转入马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ,获得马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT,胞内血红素及卟啉含量是出发菌株FIM-1ura3Δ的7.57倍。
进一步地,上述菌株在YG培养基(2% Yeast extract和4%葡萄糖)中加入20g/L甘氨酸和80μM FeSO4·7H2O后,胞内血红素及卟啉含量是出发菌株FIM-1ura3Δ的15.53倍。
进一步地,通过在马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT中转入大豆血红蛋白表达载体pUKDN115/LBA和重构血红素合成途径的人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,获得高产大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT-LBA,然后经发酵罐高密度发酵获得大豆血红蛋白。
具体地,利用马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT-LBA高产大豆血红蛋白,工程菌株FDTT-LBA在以合成培养基中分批补料流加葡萄糖进行高密度发酵;发酵温度控制32℃,氨水自动控制pH为5.5,无菌过滤空气以3L/min供应氧气,溶氧与搅拌速率(200-850rpm)串级联速;合成培养基包含但不限于含硫酸铵、葡萄糖、硫酸镁,磷酸二氢钾,微量元素和维生素,大豆血红蛋白的产量达到7.27g/L。
本发明在马克斯克鲁维酵母中,敲除血红素降解与蛋白质降解途径的基因LSC1和SSN3,构建获得的马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δ,在此基础上引入重构血红素合成途径人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,获得马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT,其胞内血红素及卟啉含量是FIM-1ura3Δ菌株的15.53倍。
在马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT中转入了重构血红素合成途径人工染色体KM-YAC-8Hemsyn和大豆血红蛋白表达载体pUKDN115/LBA,获得高效表达大豆血红蛋白工程菌株FDTT-LBA,连续补料高密度发酵大豆血红蛋白产量达到7.27g/L,产量是目前报道最高产量的2倍。
附图说明
图1在马克斯克鲁维酵母中筛选不同来源血红素合成途径基因的表达质粒图谱。
图2酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母来源的血红素合成途径基因对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响。
图3为C4途径与血红素合成下游途径基因组合对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响。
图4为利用YAC导入完整血红素合成途径对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响。
图5为在缺失菌株中导入完整血红素合成途径对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响。
图6为血红素合成能力的加强对马克斯克鲁维酵母重组表达血红蛋白的影响。A.大豆血红蛋白LBA、LBC1摇瓶胞内表达的全菌检测结果;A1-A4:115-LBA重组菌株氢氧化钠破菌蛋白表达情况;A5-A8:115-LBC1重组菌株氢氧化钠破菌蛋白表达情况;B.大豆血红蛋白LBC2、LBC3摇瓶胞内表达的全菌检测结果;B1-B4:115-LBC2重组菌株氢氧化钠破菌蛋白表达情况;B5-B8:115-LBC3重组菌株氢氧化钠破菌蛋白表达情况;C.大豆血红蛋白LBA、LBC1摇瓶胞内表达的可溶蛋白检测结果(浓缩一倍);C1-C4:115-LBA重组菌株破菌上清蛋白表达情况;C5-C8:115-LBC1重组菌株破菌上清蛋白表达情况;D.大豆血红蛋白LBC2、LBC3摇瓶胞内表达的可溶蛋白检测结果(浓缩一倍);D1-D4:115-LBC2重组菌株破菌上清蛋白表达情况;D5-D8:115-LBC3重组菌株破菌上清蛋白表达情况;1-6:FDTT-LBA重组菌株氢氧化钠破菌蛋白表达情况;C:FIM-1ura3Δ菌株氢氧化钠破菌蛋白表达情况。
图7为优化马克斯克鲁维酵母重组表达豆血红蛋白的发酵条件。
图8为在5L发酵罐中用马克斯克鲁维酵母工程菌株高效制备豆血红蛋白。其中,A图为将乳球蛋白配置成500、400、300、200、100mg/L的浓度,制样后进行SDS-PAGE分析,使用GenoSens分析软件量化乳球蛋白的条带,制作标准曲线计算重组豆血红蛋白的产量;B图表示高密度发酵36h胞内血红素含量。C图表示高密度发酵后工程菌株血红蛋白产量;FIM-1ura3Δ-LBA表示FIM-1ura3Δ菌株胞内表达豆血红蛋白、FDTT-LBA菌株代表FDTT菌株胞内表达豆血红蛋白。
图9为马克斯克鲁维酵母人工染色体载体KM-YAC质粒图谱。包含来源于FIM-1菌株的酵母复制起始序列ARS1、着丝粒序列CEN、马克斯克鲁维酵母来源端粒序列TEL、筛选标记HIS3、TRP1。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
不同来源的血红素合成途径基因的克隆及其对马克斯克鲁维合成血红素的影响
用PCR方法克隆血红素前体C4途径的合成基因:以马克斯克鲁维酵母FIM-1基因组为模板,用常规PCR扩增HEM1基因。以酿酒酵母S288C基因组为模板,用常规PCR扩增酿酒酵母HEM1基因。
用PCR方法克隆下游途径的血红素合成基因:以马克斯克鲁维酵母FIM-1基因组为模板,用常规PCR扩增HEM2基因、HEM3基因、HEM4基因、HEM12基因、HEM13基因、HEM14基因、HEM15基因。以酿酒酵母S288C基因组为模板,用常规PCR扩增酿酒酵母HEM2基因、HEM3基因、HEM4基因、HEM12基因、HEM13基因、HEM14基因、HEM15基因。
表1血红素合成途径相关基因列表
PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后,用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收,获得目的基因片段,分别克隆到LHZ412载体上(图1),转化酵母FIM-1ura3Δ,在YPD平板上利用潮霉素抗性进行筛选,挑选单克隆在50mL YG液体培养基中摇瓶培养72h,利用荧光法检测菌株的胞内血红素及卟啉含量。
具体地,将酿酒酵母或马克斯克鲁维酵母内源血红素合成途径单基因过表达重组质粒转化酵母FIM-1ura3Δ,在YPD平板上利用潮霉素抗性进行筛选,挑选单克隆在50mL YG液体培养基中摇瓶培养72h,利用荧光法检测菌株的胞内血红素及卟啉总含量。control代表FIM-1ura3Δ菌株血红素及卟啉含量记为1;hem1表示过表达马克斯克鲁维酵母HEM1基因的重组菌株;hem1sc表示过表达酿酒酵母HEM1基因的重组菌株;hem2表示过表达马克斯克鲁维酵母HEM2基因的重组菌株;hem2sc表示过表达酿酒酵母HEM2基因的重组菌株;hem3表示过表达马克斯克鲁维酵母HEM3基因的重组菌株;hem3sc表示过表达酿酒酵母HEM3基因的重组菌株;hem4表示过表达马克斯克鲁维酵母HEM4基因的重组菌株;hem4sc表示过表达酿酒酵母HEM4基因的重组菌株;hem12表示过表达马克斯克鲁维酵母HEM12基因的重组菌株;hem12sc表示过表达酿酒酵母HEM12基因的重组菌株;hem13表示过表达马克斯克鲁维酵母HEM13基因的重组菌株;hem13sc表示过表达酿酒酵母HEM13基因的重组菌株;hem14表示过表达马克斯克鲁维酵母HEM14基因的重组菌株;hem14sc表示过表达酿酒酵母HEM14基因的重组菌株;hem15表示过表达马克斯克鲁维酵母HEM15基因的重组菌株;hem15sc表示过表达酿酒酵母HEM15基因的重组菌株。图2显示了每个重组菌株的胞内血红素相对含量,其中过表达马克斯克鲁维来源HEM1使胞内血红素及卟啉含量提高20.6%、过表达酿酒来源HEM1使胞内血红素及卟啉含量提高3%;过表达马克斯克鲁维来源HEM2使胞内血红素及卟啉含量提高27%、过表达酿酒来源HEM2使胞内血红素及卟啉含量提高12.5%;过表达马克斯克鲁维来源HEM3使胞内血红素及卟啉含量下降7%、过表达酿酒酵母HEM3使胞内血红素及卟啉含量提高3%;过表达马克斯克鲁维来源HEM4使胞内血红素及卟啉含量提高16%、过表达酿酒酵母来源HEM4使胞内血红素及卟啉含量提高10%;过表达马克斯克鲁维来源HEM12使胞内血红素及卟啉含量提高7%、过表达酿酒酵母来源HEM12使胞内血红素及卟啉含量提高150%;过表达马克斯克鲁维来源HEM13使胞内血红素及卟啉含量未改变、过表达酿酒酵母来源HEM13使胞内血红素及卟啉含量提高6%;过表达马克斯克鲁维来源HEM14使胞内血红素及卟啉含量下降13%、过表达酿酒酵母来源HEM14使胞内血红素及卟啉含量提高24%;过表达马克斯克鲁维来源HEM15使胞内血血红素及卟啉含量提高6%、过表达酿酒酵母来源HEM15使胞内血红素及卟啉含量提高27%。
实施例2
利用YAC测试血红素合成途径基因组合对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响。
利用YAC过表达C4与下游途径基因组合:用Swa I和Not I酶切pMD18T-H1H2、pMD18T-H3H4、pMD18T-H12H13、pMD18T-H14H15、pMD18T-H13H14H15或pMD18T-H12H13H14H15载体,经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,利用DNA胶回收试剂盒分别回收约5900bp、5700bp、5000bp、7500bp、10000bp或12000bp目的片段。使用2×MultiF Seamless Assembly Mix试剂分别将目的片段与线性化YAC载体片段(图9)进行无缝连接,转化敲除HIS3、TRP 1的营养缺陷型FIM-1ura3Δ菌株,经PCR的方法筛选鉴定阳性克隆子,并送测验证,获得H1-2、H3-4、H12-13、H14-15、H13-15、H12-15菌株。利用Sac II和Not I酶切pMD18T-H1载体,Sac I和SwaI酶切pMD18T-H2载体,经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,利用DNA胶回收试剂盒回收大约3500bp以及2500bp DNA片段,使用2×MultiF Seamless Assembly Mix试剂连接目的片段与线性化YAC载体,转化敲除HIS3、TRP1的营养缺陷型FIM-1ura3Δ菌株,经筛选鉴定获得H1-4菌株。通过荧光法检测菌株的胞内血红素含量,control代表敲除HIS3、TRP1的FIM-1ura3Δ菌株,该菌株血红素及卟啉含量记为1。图3显示了利用YAC过表达C4与下游途径基因组合菌株的胞内血红素相对含量,其中H1-2菌株过表达马克斯克鲁维酵母来源HEM1、HEM2基因组合,使其胞内血红素及卟啉含量提高40%;H3-4菌株过表达酿酒酵母来源HEM3与马克斯克鲁维酵母来源HEM4基因组合,使其胞内血红素及卟啉含量提高20%;H1-4菌株过表达马克斯克鲁维酵母来源HEM1、HEM2、HEM4与酿酒酵母来源HEM3基因组合,使其胞内血红素及卟啉含量提高28%;H12-13菌株过表达酿酒酵母来源HEM12与马克斯克鲁维酵母来源HEM13基因组合,使其胞内血红素及卟啉含量提高21%;H14-15菌株过表达酿酒酵母来源HEM14与HEM15基因组合,使其血红素及卟啉含量提高26%;H13-15菌株过表达马克斯克鲁维酵母来源HEM13、酿酒酵母来源HEM14与HEM15基因组合,使其胞内血红素及卟啉含量提高15%;H12-15菌株过表达马克斯克鲁维酵母来源HEM13、酿酒酵母HEM12、HEM14与HEM15基因组合,使其胞内血红素及卟啉含量提高18%。
实施例3
利用YAC导入血红素合成途径对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响
用Sac II和Not I酶切pMD18T-H1载体,37℃处理1h,经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,利用DNA胶回收试剂盒回收大约3500bp DNA片段,该片段带有YAC左臂40bp同源序列与HEM2过表达框启动子的同源序列,简称H1片段。利用Sac II、Sac I酶切pMD18T-H2H3sc载体,37℃处理1h,经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,利用DNA胶回收试剂盒回收大约4800bp DNA片段,该片段带有HEM1过表达框终止子的同源片段与HEM4过表达框启动子的同源片段,简称H2H3sc片段。利用Swa I酶切pMD18T-H4H12scH13H14scH15sc载体,25℃处理1h,在体系中再加入Sac I进行双酶切,37℃处理1h,经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,利用DNA胶回收试剂盒回收大约12000bp DNA片段,该片段带有酿酒酵母HEM3过表达框终止子的同源片段与YAC右臂同源片段,简称H4H12scH13H14scH15sc片段。使用2×MultiF Seamless Assembly Mix试剂分别将目的片段与线性化YAC载体片段进行无缝连接,获得人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,转化敲除HIS3、TRP1的营养缺陷型FIM-1ura3Δ菌株,经PCR的方法筛选鉴定阳性克隆子,并送测验证,获得H1-15菌株。
通过荧光法检测菌株的胞内血红素含量,图4显示了利用YAC导入血红素合成途径菌株的胞内血红素相对含量。其中,control代表敲除HIS3、TRP1的FIM-1ura3Δ菌株,该菌株血红素及卟啉含量记为1;KMC4D菌株过表达马克斯克鲁维酵母来源HEM1、HEM2、HEM4、HEM13与酿酒酵母来源HEM3、HEM12、HEM14、HEM15基因,使其胞内血红素及卟啉含量提高23%。
实施例4
血红素降解与蛋白质分泌途径基因缺失对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响利用马克斯克鲁维酵母CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除FIM-1ura3Δ菌株中血红素降解途径与蛋白质分泌途径基因,构建基因工程菌株,通过荧光法检测菌株的胞内血红素含量,表2显示了敲除LSC1基因获得L1菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加43%;敲除PEP4基因获得P4菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加37%;敲除SSN3基因获得S3菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加23%;敲除VPS10基因获得V10菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加11%;敲除ROX1基因获得R1菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加13%;敲除TUP1基因获得T1菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加12%;敲除LSC2基因获得L2菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加38%;敲除HAP1基因获得H1菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加66%;敲除LSC1、PEP4基因获得L1P4菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加46%;敲除LSC1、SSN3基因获得菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δ,其细胞内血红素及卟啉含量增加88%;敲除LSC1、PEP4、VPS10基因获得L1P4V10菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加18%;敲除LSC1、PEP4、VPS10、ROX1基因获得L1P4V10R1菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加10%;敲除LSC1、PEP4、VPS10、SSN3基因获得L1P4V10S3菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加68%;敲除LSC1、PEP4、VPS10、SSN3、TUP1基因获得L1P4V10S3T1菌株,其细胞内血红素及卟啉含量增加71%。
表2血红素降解与蛋白分泌途径基因缺失对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响
实施例5
在基因缺失菌株中导入血红素合成途径对马克斯克鲁维酵母血红素合成的影响利用马克斯克鲁维酵母CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除L1S3菌株中HIS3、TRP1基因,构建获得马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ菌株。
利用YAC导入含有C4途径的血红素合成途径:按照实施例3方法将构建获得的人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,转化进马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ菌株,经PCR的方法筛选鉴定阳性克隆子,并送测验证,获得FDTT菌株。
通过荧光法检测菌株的胞内血红素含量,图5显示了在基因缺失菌株中导入血红素合成途径后细胞内血红素相对含量。其中,control代表敲除HIS3、TRP1的FIM-1ura3Δ菌株,该菌株血红素及卟啉含量记为1;FDTT在YG液体培养基中加入20g/L甘氨酸、80μMFeSO4·7H2O后,工程菌株FDTT胞内血红素及卟啉的相对含量。FDTT菌株是在马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ中转入了重构血红素合成途径的人工染色体,该菌株过表达了马克斯克鲁维酵母来源HEM1、HEM2、HEM4、HEM13与酿酒酵母来源HEM3、HEM12、HEM14、HEM15基因,其胞内血红素含量是改造前菌株FIM-1ura3Δ的7.57倍,在YG液体培养基中加入20g/L甘氨酸、80μM FeSO4·7H2O后,经30℃恒温振荡器培养72小时,FDTT菌株胞内血红素及卟啉含量是改造前菌株FIM-1ura3Δ的15.53倍。
实施例6
在基因缺失菌株中导入血红素合成途径对马克斯克鲁维酵母表达血红蛋白的影响
针对豆血红蛋白LBA、LBC1、LBC2、LBC3编码基因,设计了K.marxianus偏好性的密码子,获得了密码子优化后的4种豆血红蛋白的编码基因(见序列),送公司进行了全基因合成。按照Gibson Assembly构建重组质粒的方法,首先使用Not I、Spe I酶切pUKDN115载体质粒并回收,获得线性化载体片段。将体外扩增带有载体同源臂片段的大豆血红蛋白基因片段分别与线性化表达载体连接,转化Stellar大肠杆菌感受态细胞,通过大肠杆菌菌落PCR进行阳性克隆鉴定,经公司测序验证后获得pUKDN115/LBA、pUKDN115/LBC1、pUKDN115/LBC2、pUKDN115/LBC3胞内表达质粒。将构建的4个重组表达质粒分别转化进K.marxianus酵母菌株FIM-1ura3Δ,获得115-LBA、115-LBC1、115-LBC2、115-LBC3重组菌株、分别挑选SC-ura转化平板上的克隆接种于50mL YG液体培养基,在30℃摇床中培养3天,利用SDS-PAGE检测大豆血红蛋白胞内表达情况。图6中显示LBA与LBC3全菌表达量较高,LBC1与LBC2全菌表达量较低,其中,LBA的可溶条带最多,故选择LBA作为后续的研究对象。
在马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ中转入了重构血红素合成途径人工染色体KM-YAC-8Hemsyn和大豆血红蛋白表达载体pUKDN115/LBA,获得高效表达大豆血红蛋白工程菌株FDTT-LBA、分别挑选SC-URA转化平板上的克隆接种于50mLYG液体培养基,在30℃摇床中培养3天,利用SDS-PAGE检测大豆血红蛋白LBA胞内表达情况。图6中显示与FIM-1ura3Δ菌株表达LBA相比,重组菌株FDTT-LBA胞内表达量明显增加。
实施例7
优化培养条件及5L发酵罐中高效制备豆血红蛋白
通过正交设计原则对基础SM培养基中的葡萄糖、甘氨酸、FeSO4·7H2O这三个因素进行优化,根据L9(33)正交阵列设计正交试验,经SDS-PAGE检测、GenoSens软件进行灰度扫描分析FDTT-LBA菌株胞内LBA的表达量。由极差分析可知,3个因素的主次关系是:甘氨酸浓度>葡萄糖浓度>铁离子浓度,甘氨酸最佳水平为0.1g/L,葡萄糖最佳水平为6%,铁离子最佳水平为100μM。
图7为优化马克斯克鲁维酵母重组表达豆血红蛋白的发酵条件。该图代表SDS-PAGE检测正交设计实验组血红蛋白条带的灰度扫描值,1-9分别代表正交设计进行的9个实验组,1表示SM培养基中葡萄糖浓度为2%、甘氨酸浓度为0.1g/L、铁离子浓度为20μM;2表示SM培养基中葡萄糖浓度为2%、甘氨酸浓度为2g/L、铁离子浓度为200μM;3表示SM培养基中葡萄糖浓度为2%、甘氨酸浓度为10g/L、铁离子浓度为100μM;4表示SM培养基中葡萄糖浓度为4%、甘氨酸浓度为0.1g/L、铁离子浓度为200μM;5表示SM培养基中葡萄糖浓度为4%、甘氨酸浓度为2g/L、铁离子浓度为100μM;6表示SM培养基中葡萄糖浓度为4%、甘氨酸浓度为10g/L、铁离子浓度为20μM;7表示SM培养基中葡萄糖浓度为6%、甘氨酸浓度为0.1g/L、铁离子浓度为100μM;8表示SM培养基中葡萄糖浓度为6%、甘氨酸浓度为2g/L、铁离子浓度为20μM;9表示SM培养基中葡萄糖浓度为6%、甘氨酸浓度为10g/L、铁离子浓度为200μM。方差分析显示,三个影响因素均对LBA全菌表达量具有显著的影响。
在5L自动发酵罐中对FDTT-LBA菌株进行了连续补料发酵培养,发酵参数设置为32℃、pH=5.5,定期取样检测血红蛋白表达情况。图8A为标准蛋白β-乳球蛋白定量计算重组菌株目的蛋白产量,其中32℃发酵72h血红蛋白LBA产量最高为7.27g/L,较改造前提高79.95%(图8C)。图8B显示利用液相色谱法检测血红蛋白高密度发酵细胞内血红素含量,发酵36小时后对照菌株FIM-1ura3Δ-LBA细胞内血红素含量为3.16mg/L,工程菌株FDTT-LBA血红素含量为66.32mg/L,单细胞产血红素含量提高23.74倍。
材料与方法
1.血红素合成途径基因重组表达质粒的构建:
利用单拷贝pFA6a质粒过表达不同来源血红素合成途径基因,该质粒含ARS1自主复制序列、潮霉素抗性筛选标记、ADH1启动子、ADH1终止子,其质粒图谱如图1所示。用Sma I限制性内切酶酶切pFA6a质粒,产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后,用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收7kb左右的载体片段。采用Gibson Assembly无痕连接系统(Vazyme,C112-0250rxn),将基因片段与pFA6a线性载体片段进行连接,连接方法参见产品说明书,获得酿酒酵母或马克斯克鲁维内源血红素合成途径单基因过表达重组质粒。
2.血红素合成途径基因过表达单元的构建:
构建单基因过表达框:抽提FIM-1URA3Δ菌株基因组,稀释50倍后作为PCR模板,利用常规PCR分别扩增HEM1基因序列、ADH1强启动子序列及对应的终止子序列,经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,利用DNA胶回收试剂盒进行回收。将PCR产物与pMD18T线性载体进行一步法连接,产物转化大肠杆菌感受态细胞,利用大肠杆菌菌落PCR进行阳性克隆的鉴定与筛选,送测验证后获得HEM1单基因过表达框载体pMD18T-H1。利用类似的方法,构建剩余单基因过表达单元载体pMD18T-H2、pMD18T-H3sc、pMD18T-H4、pMD18T-H12sc、pMD18T-H13、pMD18T-H14sc、pMD18T-H15sc、pMD18T-HA、pMD18T-HL、pMD18T-G。
构建多基因过表达框:以构建pMD18T-H1H2载体为例,利用Sac II酶切pMD18T-H1载体,37℃处理1h,经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,利用DNA胶回收试剂盒回收单酶切载体DNA片段,简称H1线性载体片段。利用Swa I酶切pMD18T-H2载体,25℃处理1h,在体系中再加入Sac I进行双酶切,37℃处理1h,经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,利用DNA胶回收试剂盒回收大约2400bp DNA片段,该片段包含pMD18T载体同源片段和HEM1过表达框终止子的同源片段,简称H2片段。利用2.2.1.10Gibson Assembly构建重组质粒的方法,将H2片段与H1线性载体片段进行连接,产物转化大肠杆菌感受态细胞,利用大肠杆菌菌落PCR进行阳性克隆的鉴定与筛选,送测验证后获得HEM1-HEM2双基因过表达框载体pMD18T-H1H2。利用类似的方法,构建剩余多基因过表达单元载体pMD18T-H2H3sc、pMD18T-H12scH13、pMD18T-H14scH15sc、pMD18T-H13H14scH15sc、pMD18T-H12scH13H14scH15sc、pMD18T-H4H12scH13H14scH15sc、pMD18T-HAHL、pMD18T-HAHLH1、pMD18T-HAHLG、pMD18T-HAHLGH1。
3.线性化YAC载体的获得
马克斯克鲁维酵母人工染色体载体KM-YAC包含来源于FIM-1菌株的酵母复制起始序列ARS1、着丝粒序列CEN、马克斯克鲁维酵母来源端粒序列TEL、筛选标记HIS3、TRP1。具体载体示意图如下图9,利用Not I、BamH I将KM-YAC载体在37℃酶切1h,回收6700bp作为YAC左臂LA序列、3100bp作为YAC右臂RA序列片段,分别获得YAC载体的左臂与右臂序列。
4.酵母细胞转化:
采用醋酸锂转化法(World Journal of Microbiology&Biotechnology 16:653-654,2000),将血红素合成途径单基因过表达重组质粒分别转入FIM-1URA3Δ中。将转化后的产物涂布于SC-ura平板,将平板放置30℃恒温培养箱培养,培养3天,长出克隆,进行后续培养。
5.摇瓶培养
从每组转化中挑选4个不同的克隆,接种于装有50mL的YG培养基(2%酵母抽提物,4%葡萄糖)中,30℃、220rpm培养72h后收集菌体。
5.酵母细胞血红素分析:
按照OD600*mL=8的细胞数目进行取样检测(若OD600=40,则取200μL发酵菌液),每个样品分别取两份置于两个EP管中;12000rpm离心3分钟,去上清,在EP管中加入500μL的20mM草酸溶液,吹打混匀,在4℃下避光过夜。提前预热2M草酸溶液,向每管中加入500μL 2M草酸溶液,吹打混匀。一份全部转移到棕色EP管中,沸水浴30分钟,另一份在室温中避光放置30分钟;室温冷却后,12000rpm离心3分钟,取200μL上清液于黑色96板中,使用荧光酶标仪检测λ激发=400nm,λ发射=600nm的荧光值,其中加热样品对应荧光是细胞内总卟啉含量(包括结合血红素和游离卟啉),常温放置样品荧光是细胞内游离卟啉含量。
6.马克斯克鲁维酵母菌株发酵培养
重组表达菌株在摇瓶中的培养,选用YG培养基:2%酵母提取物,4%葡萄糖,培养条件是30℃、220rpm下培养72h,检测外源蛋白在K.marxianus中的表达。重组菌株在5L发酵罐(BXBIO,中国上海)中的培养选用补料分批发酵。基础培养基是SM培养基:(NH4)2SO45g/L、Glucose 10g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L,KH2PO4 3g/L,微量元素2mL/L,维生素1mL/L。流加1300g葡萄糖,发酵温度控制30℃,用氨水自动控制pH为5.5,无菌过滤空气以3L/min供应氧气,溶氧与搅拌速率(200-850rpm)串级联速。
7.酵母细胞破碎
8000rpm离心5min收集1mL新鲜的重组酵母细胞,然后用PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4,pH 7.4)清洗一次,最终重悬于500μL的PBS缓冲液中。向其中加入大约400μL玻璃珠。使用Bead-beater(FastPrep-24,MP,California,USA)以6m/s的速度破碎细胞2min。
8.灰度扫描定量蛋白产量
以不同浓度的乳球蛋白作为标准进行重组蛋白的定量。将乳球蛋白配置成500、400、300、200、100mg/L的浓度,制样后进行SDS-PAGE分析。使用GenoSens分析软件量化在SDS-PAGE凝胶上分离的乳球蛋白的条带强弱,制作标准曲线。高密度发酵72h的细胞培养物用PBS缓冲液按1:10稀释,细胞破碎后将上清进行SDS-PAGE分析和灰度扫描,计算重组蛋白的产量。
9.培养基正交设计优化
对SM培养基中的葡萄糖、甘氨酸、FeSO4·7H2O这三个因素进行优化,根据L9(33)正交阵列设计正交试验,进行9个实验。所有数据代表三个平行实验的平均值,每个实验重复两次。将重组FDTT-LBA细胞在含有不同浓度的葡萄糖、甘氨酸、FeSO4·7H2O的培养基中30℃摇瓶培养72h,收集菌体,重悬于PBS缓冲液中破碎细胞,进行SDS-PAGE分析,通过GenoSens软件分析LBA的表达量。
10.马克斯克鲁维酵母基因组编辑技术
该方法是基于酵母细胞的同源重组修复功能进行基因编辑,主要包含三个元件,分别是Cas9内切酶、有目标序列的gRNA以及含有目标突变的模板序列,具体实验步骤如下:
1)构建CRISPR特异性敲除质粒:ARS1-CRISPR质粒含有筛选基因URA3、大肠杆菌筛选序列、酵母自主复制序列和着丝粒序列ARS1、Cas9基因表达单元以及gRNA表达单元。将线性化ARS1-CRISPR片段与特异性gRNA片段连接构建重组质粒;
2)构建含有目标突变的Donor DNA片段:同源序列的长度应大于300bp,利用常规PCR以K.marxianus酵母基因组为模板分别扩增敲除基因ORF的上游500bp序列和下游500bp序列,再利用重叠延伸PCR融合同源序列,即获得Donor DNA片段;
3)K.marxianus酵母转化进行基因组编辑:将构建完成的敲除质粒及Donor DNA片段共转化酵母,涂布SC-ura平板,30℃恒温培养箱培养48h;
4)通过酵母菌落PCR筛选并鉴定阳性克隆,将鉴定的阳性克隆菌落接种于3mL YPD液体培养基,30℃恒温振荡器过夜培养,沾取少量菌液在YPD+5-FOA平板上分区划线进行质粒丢失,30℃恒温培养箱过夜培养,酵母煮菌PCR进行筛选并鉴定,送测后验证获得成功编辑的菌株。
上述实施例是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非对实施方式的限定。应当理解,本领域的普通技术技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出其它不同形式的变化或变动,因此,由此所引伸出的显而易见的技术方案皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (16)
1.一种利用马克斯克鲁维酵母高效重组表达血红蛋白的方法,其特征在于,采用合成生物学的技术,通过优化马克斯克鲁维酵母合成血红素的合成途径,包括优化血红蛋白辅因子血红素合成与降解、蛋白质降解途径,提升大豆血红蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达量;其中:
(一)所述的优化马克斯克鲁维酵母合成血红素合成途径,是通过优化血红素前体物5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)合成途径,提高马克斯克鲁维酵母合成血红素的产量;或者
(二)所述的优化马克斯克鲁维酵母合成血红素合成途径,是通过优化血红素的下游合成途径基因,提高马克斯克鲁维酵母合成血红素的产量;或者
(三)所述的优化马克斯克鲁维酵母合成血红素合成途径,是通过敲除马克斯克鲁维酵母血红素降解与蛋白质降解途径的基因,提高马克斯克鲁维酵母合成血红素的产量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,是在马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株中利用质粒过量表达马克斯克鲁维酵母或酿酒酵母的C4合成途径HEM1基因,促进马克斯克鲁维酵母合成血红素,提高血红蛋白的重组表达水平;
所述的马克斯克鲁维酵母的C4合成途径HEM1基因,具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列和SEQ ID No.4所示的氨基酸序列;
所述的酿酒酵母的C4合成途径HEM1基因,具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列和SEQIDNo.6所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的血红素的下游合成途径基因为HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14、HEM15;具体是在马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株中利用质粒过量表达马克斯克鲁维酵母或酿酒酵母HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14或HEM15基因,提升马克斯克鲁维酵母中血红素的合成和血红蛋白的重组表达。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的下游合成途径基因为马克斯克鲁维酵母HEM2、酿酒酵母HEM3、马克斯克鲁维酵母HEM4、酿酒酵母HEM12、马克斯克鲁维酵母HEM13、酿酒酵母HEM14和HEM15基因;其中:
所述的马克斯克鲁维酵母HEM2基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.7所示,氨基酸序列为SEQ ID No.8所示;
所述的酿酒酵母HEM3基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.9所示,氨基酸序列为SEQ IDNo.10所示;
所述的马克斯克鲁维酵母HEM4基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.11所示,氨基酸序列为SEQ ID No.12所示;
所述的酿酒酵母HEM12基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.13所示,氨基酸序列为SEQIDNo.14所示;
所述的马克斯克鲁维酵母HEM13基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.15所示,氨基酸序列为SEQ ID No.16所示;
所述的酿酒酵母HEM14基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.17所示,氨基酸序列为SEQIDNo.18所示;
所述的酿酒酵母HEM15基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.19所示,氨基酸序列为SEQIDNo.20所示。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,在所述马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株中,进一步敲除HIS3、TRP1基因,获得马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δhis3Δtrp1Δ。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,以马克斯克鲁维酵母5-ALA C4合成途径基因HEM1,分别和下游途径的马克斯克鲁维酵母HEM2、酿酒酵母HEM3、马克斯克鲁维酵母HEM4、酿酒酵母HEM12、马克斯克鲁维酵母HEM13、酿酒酵母HEM14或酿酒酵母HEM15基因过量共表达;每个过表达基因用不同的启动子和终止子;具体为ADH1启动子与终止子调控HEM1,PDC1启动子与终止子调控HEM2,PGK1启动子与终止子调控HEM3,ENO2启动子与终止子调控HEM4,INU1启动子与终止子调控HEM12,AFT1启动子与终止子调控HEM13,TEF1启动子与终止子调控HEM14,OM45启动子与终止子调控HEM15,然后组合克隆到人工染色体载体KM-YAC上,转入马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δhis3Δtrp1Δ。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,构建包含马克斯克鲁维酵母5-ALA C4合成途径基因HEM1,马克斯克鲁维酵母HEM2、酿酒酵母HEM3、马克斯克鲁维酵母HEM4、酿酒酵母HEM12、马克斯克鲁维酵母HEM13、酿酒酵母HEM14,酿酒酵母HEM15基因共8个基因的人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,转入马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δhis3Δtrp1Δ,获得马克斯克鲁维酵母工程菌株KMC4D,重构马克斯克鲁维酵母的血红素合成途径。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的血红素降解与蛋白质降解途径的基因包括马克斯克鲁维酵母LSC1、LSC2、PEP4、SSN3、VPS10、ROX1、TUP1、HAP1。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,组合敲除LSC1和PEP4基因,或LSC1和SSN3基因,或LSC1、PEP4和VPS10基因,或LSC1、PEP4、VPS10和ROX1基因,或LSC1、PEP4、VPS10和SSN3基因,或LSC1、PEP4、VPS10、SSN3和TUP1基因。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,组合敲除LSC1和SSN3基因,构建获得马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δ;其中:
所述的马克斯克鲁维酵母LSC1基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.21所示,氨基酸序列为SEQ ID No.22所示;
所述的马克斯克鲁维酵母SSN3基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.23所示,氨基酸序列为SEQ ID No.24所示。
11.根据权利要求5-10之一所述的方法,其特征在于,在马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δ菌株中,进一步敲除HIS3、TRP1基因后获得马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ;将构建的人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,转入马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ,获得马克斯克鲁维酵母工程菌株,记为FDTT。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,通过在马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT中转入大豆血红蛋白表达载体pUKDN115/LBA和重构血红素合成途径的人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,获得高产大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT-LBA,然后经发酵罐高密度发酵获得大豆血红蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,工程菌株FDTT-LBA在以合成培养基中分批补料流加葡萄糖进行高密度发酵;发酵温度控制32℃,控制pH为5.5,无菌过滤空气以3L/min供应氧气,溶氧与搅拌速率串级联速;合成培养基为含硫酸铵、葡萄糖、硫酸镁,磷酸二氢钾,微量元素和维生素。
14.一种重组表达大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母重组菌株,其特征在于,是将编码大豆血红蛋白基因LBA克隆到马克斯克鲁维酵母重组表达载体pUKDN115中,构建大豆血红蛋白表达载体pUKDN115/LBA;然后转化马克斯克鲁维酵母FDTT菌株,获得重组表达大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母重组菌株,记为FDTT-LBA;其中:
所述大豆血红蛋白,核苷酸序列为SEQ ID No.1所示,氨基酸序列为SEQ ID No.2所示;所述马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株,是以马克斯克鲁维酵母FIM-1(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No.10621)作为出发菌株,通过分子生物学技术,敲除尿嘧啶合成基因URA3作为筛选标记构建获得。
15.根据权利要求14所述的重组表达大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母重组菌株,其特征在于,在所述马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δ菌株中敲除组氨酸合成酶His3与色氨酸合成酶基因TRP1获得的马克斯克鲁维酵母菌株,记为FIM-1ura3Δhis3Δtrp1Δ;
在所述马克斯克鲁维酵母FIM-1ura3Δhis3Δtrp1Δ菌株中组合敲除马克斯克鲁维酵母血红素降解与蛋白质降解途径基因基因LSC1和马克斯克鲁维酵母基因SSN3,获得的马克斯克鲁维酵母菌株,记为FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ;
所述的马克斯克鲁维酵母基因LSC1的核苷酸序列为SEQ ID No.21所示,氨基酸序列为SEQ ID No.22所示;
所述的马克斯克鲁维酵母基因SSN3基因的核苷酸序列为SEQ ID No.23所示,氨基酸序列为SEQ ID No.24所示;
在所述的FIM-1ura3Δlsc1Δssn3Δhis3Δtrp1Δ的菌株中,转入构建的人工染色体KM-YAC-8Hemsyn,获得马克斯克鲁维酵母工程菌株,记为FDTT。
16.根据权利要求15所述的重组表达大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母重组菌株,其特征在于,在马克斯克鲁维酵母工程菌株FDTT中转入大豆血红蛋白表达载体pUKDN115/LBA,而获得的高产大豆血红蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株,记为FDTT-LBA。
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PB01 | Publication | ||
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