CN114181288A

CN114181288A - 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质

Info

Publication number: CN114181288A
Application number: CN202210143693.4A
Authority: CN
Inventors: 孟刚; 魏爱英; 张英; 贾慧萍; 毕国东; 杨立鹏
Original assignee: Beijing Zhongke Yipin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongke Yipin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-02-17
Filing date: 2022-02-17
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2042-02-17
Also published as: CN114181288B

Abstract

本发明公开了制备L‑缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质。该基因编码下述任一种蛋白质：A1）氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；A2）将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A3）在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。该基因具体可为核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。本发明提供的制备L‑缬氨酸的方法是利用导入该基因的工程菌生产L‑缬氨酸。本发明有助于L‑缬氨酸产量及转化率的提高。

Description

制备L-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质

技术领域

本发明属于微生物变异或遗传工程技术领域，具体涉及制备L-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质。

背景技术

L-缬氨酸（L-Valine），又称L-2-氨基-3-甲基丁酸（L-2-Amino-3-methylbutyricacid），是支链氨基酸（Branched Chain Amino Acid，BCAA）中的一种，人和动物自身不能合成。L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，具有促进蛋白合成、抑制蛋白分解的作用，增强机体的免疫防护作用，有助于纠正因手术、创伤、感染等引起的负氮平衡。另外，L-缬氨酸还具有抗中枢疲劳和抗外周疲劳的作用，能够延缓运动性疲劳、加快运动后机体的修复。人体缺乏L-缬氨酸会影响机体生长发育，引起神经障碍、运动失调、贫血等。由L-缬氨酸配制的复合支链氨基酸输液在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗、先天性代谢缺陷病的膳食治疗、败血症及术后糖尿病患者的治疗、加快外科创伤愈合的治疗和肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。L-缬氨酸在食品工业上主要用作食品添加剂、营养添加剂、饲料添加剂等。此外，L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是低分子量凝胶，可以制备形成水凝胶，其在生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域已被广泛应用。

L-缬氨酸生产方法包括微生物发酵法、酶法、化学合成法和蛋白质水解提取法。其中化学合成法生产成本高、反应复杂、步骤多，且有许多副产物；蛋白质水解提取法分离成本高，酶法中的合成酶活性较低，因此均未能大规模工业化生产；微生物发酵法具有原料成本低，生产条件温和，发酵产率较高且易于大规模生产等优点，是目前L-缬氨酸的主要生产方法。工业发酵中获得高产的菌种，对于L-缬氨酸的发酵生产来说是至关重要的，是整个L-缬氨酸发酵工业的核心，是决定发酵产品工业价值的重要因素。随着L-缬氨酸的市场需求不断增加，选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的过量积累，进一步提高L-缬氨酸的产量一直是L-缬氨酸发酵工业技术开发和发酵工程化研究的热点，并且也将一直伴随L-缬氨酸发酵工业的发展，选育高产菌种有利于促进L-缬氨酸产业化的进程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何通过基因的遗传改造提高微生物L-缬氨酸的产量，所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称为CEY17_RS08445^R69S，所述蛋白质可为下述任一种：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

A2）将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3）在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

本发明还提供了核酸分子，名称为CEY17_RS08445^CC204-205TA，所述核酸分子可为下述任一种：

B1）编码所述蛋白质CEY17_RS08445^R69S的核酸分子；

B2）编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

B3）核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。

SEQ ID No.3所示的DNA分子即为本发明所述CEY17_RS08445^CC204-205TA基因。

SEQ ID No.3所示的DNA分子（CEY17_RS08445^CC204-205TA）编码SEQ ID No.4所示的蛋白质CEY17_RS08445^R69S。

所述蛋白质CEY17_RS08445^R69S氨基酸序列（SEQ ID No.4）中的第69位丝氨酸（S）是由精氨酸（R）突变而来。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

C1）含有所述核酸分子CEY17_RS08445^CC204-205TA的表达盒；

C2）含有所述核酸分子CEY17_RS08445^CC204-205TA的重组载体、或含有C1）所述表达盒的重组载体；

C3）含有所述核酸分子CEY17_RS08445^CC204-205TA的重组微生物、或含有C1）所述表达盒的重组微生物、或含有C2）所述重组载体的重组微生物。

本发明还提供了D1）-D8）中任一项在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用，和/或，在制备L-缬氨酸中的应用，和/或，在调控微生物L-缬氨酸的产量中的应用，其中所述D1）-D8）为：

D1）所述蛋白质CEY17_RS08445^R69S；

D2）所述核酸分子CEY17_RS08445^CC204-205TA；

D3）所述生物材料；

D4）核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

D5）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.1所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子；

D6）含有D4）或D5）中所述DNA分子的表达盒；

D7）含有D4）或D5）中所述DNA分子的重组载体、或含有D6）所述表达盒的重组载体；

D8）含有D4）或D5）中所述DNA分子的重组微生物、或含有D6）所述表达盒的重组微生物、或含有D7）所述重组载体的重组微生物。

SEQ ID No.1所示的DNA分子也为本发明所述CEY17_RS08445基因。

SEQ ID No.1所示的DNA分子（CEY17_RS08445基因）编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

本文中，所述90％以上的同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

本文所述调控微生物的L-缬氨酸的产量可为提高或降低微生物中L-缬氨酸的积累量（即促进或抑制L-缬氨酸的生物合成）。

本发明还提供了一种提高微生物L-缬氨酸的产量的方法，所述方法包括下述任一种：

E1）提高目的微生物中的所述核酸分子CEY17_RS08445^CC204-205TA的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E2）提高目的微生物中的D4）或D5）所述DNA分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E3）对所述目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变（如碱基置换、碱基插入或碱基缺失），得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物。

上述方法中，所述突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第69位的精氨酸残基突变为另一种氨基酸残基。

上述方法中，所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第69位的精氨酸残基突变为丝氨酸残基。

上述方法中，所述突变可为通过定点突变方法将SEQ ID No.1所示DNA分子中第204-205位的核苷酸CC进行核酸改造。

上述方法中，所述突变可为通过定点突变方法将SEQ ID No.1所示DNA分子中第204-205位的核苷酸CC突变为TA。

所述突变是指通过定点突变改变基因中的某个或某几个碱基，导致对应的蛋白质氨基酸组成发生改变，产生新的蛋白质或使原蛋白质产生新的功能，即基因定点突变。基因的定点突变技术如寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变或盒式突变等是本领域技术人员所熟知的。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）或病毒载体。具体可为pK18mobsacB或pXMJ19。

本文中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自短杆菌属（Brevibacterium）、棒杆菌属（Corynebacterium）、埃希氏菌属（Escherichia）、气杆菌属（Aerobacter）、微球菌属（Micrococcus）、黄杆菌属（Flavobacterium）或芽孢杆菌属（Bacillus）等。

具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、乳酸发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、产谷氨酸微球菌（Micrococcus glutamicus）、产氨短杆菌（Brevibacterum ammoniagenes）、大肠杆菌（Escherichia coli）或产气气杆菌（Aerobacter aerogenes）但不限于此。

具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCCNo.21260，或谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC14067。

本文中，所述重组载体具体可为重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA、pK18-CEY17_RS08445OE、pK18-RS08445^CC204-205TAOE、pXMJ19-CEY17_RS08445和/或pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA。

所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA是将pK18mobsacB载体的Xba I和BamHI识别位点间的片段（小片段）替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1266位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA含有SEQ ID No.3所示的突变基因CEY17_RS08445^CC204-205TA的第1-826位所示的DNA分子。

所述重组载体pK18-CEY17_RS08445OE用于将外源基因CEY17_RS08445整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达野生型CEY17_RS08445基因。

所述重组载体pK18-RS08445^CC204-205TAOE用于将外源基因CEY17_RS08445^CC204-205TA整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达突变型基因CEY17_RS08445^CC204-205TA。

所述重组载体pXMJ19-CEY17_RS08445是将pXMJ19载体的EcoR I和KpnI识别位点间的片段（小片段）替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的DNA片段，保持pXMJ19载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。所述重组载体pXMJ19-CEY17_RS08445用于将外源基因CEY17_RS08445通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达野生型CEY17_RS08445基因。

所述重组载体pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA是将pXMJ19载体的EcoR I和KpnI识别位点间的片段（小片段）替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.13的DNA片段，保持pXMJ19载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。所述重组载体pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA用于将外源基因CEY17_RS08445^CC204-205TA通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达突变型CEY17_RS08445^CC204-205TA基因。

所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA、pK18-CEY17_RS08445OE、pK18-RS08445^CC204-205TAOE、pXMJ19-CEY17_RS08445和pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA均在本发明的保护范围内。

本文中，所述重组微生物具体可为重组菌YPV-073、YPV-074、YPV-075、YPV-076和/或YPV-077。

所述重组菌YPV-073是将所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA转化入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260中得到的重组菌，所述重组菌YPV-073含有SEQ ID No.3所示的突变的基因CEY17_RS08445^CC204-205TA。

所述重组菌YPV-074含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的CEY17_RS08445基因；具体地，重组菌YPV-074是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为CEY17_RS08445基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝CEY17_RS08445基因的重组菌可以显著和稳定地提高CEY17_RS08445基因的表达量。重组菌YPV-074为在基因组上过表达野生型CEY17_RS08445基因的工程菌，是将所述重组载体pK18-CEY17_RS08445OE导入大肠杆菌DH5α得到的重组菌。

所述重组菌YPV-075含有SEQ ID No.3所示的突变的CEY17_RS08445^CC204-205TA基因；具体地，重组菌YPV-075是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为CEY17_RS08445^CC204-205TA基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。重组菌YPV-075为在基因组上过表达突变型CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌，是将所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TAOE导入大肠杆菌DH5α得到的重组菌。

所述重组菌YPV-076含有SEQ ID No.1所示的CEY17_RS08445基因，重组菌YPV-076为在质粒上过表达野生型CEY17_RS08445基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-CEY17_RS08445在染色体外进行过表达。

所述重组菌YPV-077含有SEQ ID No.3所示的突变的CEY17_RS08445^CC204-205TA基因，重组菌YPV-077为在质粒上过表达突变型CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA在染色体外进行过表达。

所述重组菌YPV-073、YPV-074、YPV-075、YPV-076和YPV-077均在本发明的保护范围内。

本发明还提供了一种构建所述重组微生物的方法，所述方法包括至少下述任一种：

F1）将所述核酸分子CEY17_RS08445^CC204-205TA导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F2）将SEQ ID No.1所示的DNA分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F3）利用基因编辑手段对SEQ ID No.1所示的DNA分子进行编辑，使目的微生物中含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。

所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。

本发明还提供了一种制备L-缬氨酸的方法，所述方法包括利用本文中任一所述的重组微生物生产L-缬氨酸。

上述方法中，所述方法可为发酵法制备L-缬氨酸，所述重组微生物可为棒杆菌属（Corynebacterium），具体可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）及其变体。

本发明首先以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260（经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的CEY17_RS08445基因）的CEY17_RS08445基因编码区（SEQ ID No.1）中引入突变，构建了包含突变（CC-TA）的基因工程菌YPV-073。为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型CEY17_RS08445基因或其突变基因CEY17_RS08445^CC204-205TA可以增加L-缬氨酸的产量，分别将外源基因整合到宿主染色体中或由质粒在染色体外表达，构建了基因组上和质粒上过表达CEY17_RS08445基因或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌YPV-074、YPV-075、YPV-076和YPV-077。实验表明，CEY17_RS08445基因及其变体参与了L-缬氨酸的生物合成，通过对CEY17_RS08445基因进行过表达或敲除、或定点突变可以调控L-缬氨酸在微生物内的积累量。对CEY17_RS08445基因编码区进行突变或在生产菌中过表达CEY17_RS08445基因或其突变基因CEY17_RS08445^CC204-205TA，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对CEY17_RS08445基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。可利用CEY17_RS08445基因及其变体（如CEY17_RS08445^CC204-205TA基因）来构建生产L-缬氨酸的基因工程菌种，以促进L-缬氨酸产量提高。

保藏说明。

菌种名称：谷氨酸棒杆菌

拉丁名：Corynebacterium glutamicum

分类命名：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

菌株编号：YPFV1

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年11月30日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21260。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）YPFV1 CGMCCNo.21260是将谷氨酸棒杆菌ATCC15168进行诱变获得，并已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC No. 21260。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）YPFV1，又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260。

实施例1、构建CEY17_RS08445基因突变体及其重组菌

1、构建包含突变的CEY17_RS08445基因编码区片段的重组载体

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC14067基因组序列，设计并合成两对扩增CEY17_RS08445基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260（经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的CEY17_RS08445基因）的CEY17_RS08445基因编码区（SEQ ID No.1）中引入突变，所述突变为将CEY17_RS08445基因的核苷酸序列（SEQ ID No.1）中的第204-205位胞嘧啶胞嘧啶（CC）突变为胸腺嘧啶腺嘌呤（TA），得到SEQ ID No.3所示的DNA分子（突变的CEY17_RS08445基因，名称为CEY17_RS08445^CC204-205TA）。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质（所述蛋白质名称为蛋白质CEY17_RS08445）。

SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质（所述突变蛋白质名称为CEY17_RS08445^R69S）。所述突变蛋白质CEY17_RS08445^R69S氨基酸序列（SEQID No.4）中的第69位丝氨酸（S）由精氨酸（R）突变而来。

采用NEBuilder重组技术进行载体的构建，对CEY17_RS08445基因进行定点突变，引物设计如下（上海invitrogen公司合成），加粗字体的碱基为突变位置：

P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGCATCCACCGGCGTGAAGAA3'（SEQID No.15），

P2:5'CCATTCGCGGCTACCGTAACCTACCAACGAGAAT3'（SEQ ID No.16），

P3:5'ATTCTCGTTGGTAGGTTACGGTAGCCGCGAATGG3'（SEQ ID No.17），

P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCCAGAGCCAAGAGCTGGATC3'（SEQID No.18）。

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为656 bp和682 bp的CEY17_RS08445基因编码区的DNA片段（CEY17_RS08445Up和CEY17_RS08445 Down）。

PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μL，Mg²⁺（25 mM）4 μL，引物（10 pM）各2 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，总体积50 μL；

PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，（94 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将上述两条DNA片段（CEY17_RS08445 Up和CEY17_RS08445 Down）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，采用试剂盒对目的条带进行切胶回收，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增，得到大小为1304 bp的DNA片段（名称为CEY17_RS08445Up-Down，序列如SEQ ID No.5所示）。SEQ ID No.5所示的DNA片段中，第441-1266位（826bp）为含有突变位点的CEY17_RS08445^CC204-205TA基因片段（对应SEQ ID No.3的1-826位）。

Overlap PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture（各2.5mM）4 μL，Mg²⁺（25 mM）4 μL，引物（10 pM）各2 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，总体积50 μL；

Overlap PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，（94 ℃变性30 s；52 ℃退火30s；72 ℃延伸60 s；30个循环），72℃过度延伸10 min。

所述DNA片段（CEY17_RS08445 Up-Down，SEQ ID No.5）含有突变位点，用于在菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中的CEY17_RS08445基因编码区（SEQ ID No.1）的第204-205位引入核酸改造，具体为将SEQ ID No.1的第204-205位的碱基胞嘧啶胞嘧啶（CC）突变为胸腺嘧啶腺嘌呤（TA），最终导致编码蛋白（SEQ ID No.2）的第69位精氨酸（R）突变为丝氨酸（S）。

将所述DNA片段（CEY17_RS08445 Up-Down，SEQ ID No.5）经琼脂糖凝胶电泳分离后进行纯化，与经过酶切(Xba I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒（购自Addgene公司，该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（购自NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5α（购自TAKARA公司）后长出的单克隆采用PCR法鉴定阳性克隆，经PCR鉴定后获得阳性重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA，该重组载体上含有卡那霉素抗性（Kan^r）标记。将酶切正确的重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA送测序公司测序鉴定，并将含有正确突变（CC-TA）的重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA保存备用。

所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA是将pK18mobsacB载体的Xba I和BamHI识别位点间的片段（小片段）替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1266位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA含有SEQ ID No.3所示的突变基因CEY17_RS08445^CC204-205TA的第1-826位所示的DNA分子。

2、构建包含基因CEY17_RS08445^CC204-205TA的重组菌

构建方法如下：将步骤1中的等位替换质粒（即重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204 ^-205TA）通过电击转化入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过步骤1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出1311 bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物（上海invitrogen公司合成）进行PCR鉴定：

P5:5'CTGGCCCTTCCGGCATGGTG3'（SEQ ID No.19），

P6:5'ATCATCAAAGTTGCCGCGAA3'（SEQ ID No.20）。

将得到的PCR扩增产物（266 bp）通过95 ℃高温变性10 min、冰浴5 min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳（以质粒pK18-CEY17_RS08445^CC204 ^-205TA扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌ATCC14067扩增片段为阴性对照，水作为空白对照），SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增阳性菌株CEY17_RS08445基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变（CC-TA）的菌株为等位替换成功的阳性菌株，并被命名为YPV-073。

重组菌YPV-073是将所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TA转化入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260中得到的重组菌，所述重组菌YPV-073含有SEQ ID No.3所示的突变的基因CEY17_RS08445^CC204-205TA。

表1 培养基的组成和培养条件

成分	配方（其余为水）
		蔗糖	10 g/L
多聚蛋白胨	10 g/L
		牛肉膏	10 g/L
酵母粉	5 g/L
		尿素	2 g/L
氯化钠	2.5 g/L
		琼脂粉	20 g/L
pH	7.0
		培养条件	32 ℃

表2 SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件

成分	用量（丙烯酰胺终浓度为8%）
		40%丙烯酰胺	8 mL
ddH<sub>2</sub>O	26 mL
		甘油	4 mL
10×TBE	2 mL
		TEMED	40 μL
10%APS	600 μL
		电泳条件	将电泳槽置入冰中，使用1×TBE缓冲液电压120 V，电泳时间10 h

实施例2、构建过表达野生型CEY17_RS08445基因或突变型CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌株

为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型CEY17_RS08445基因或其突变基因CEY17_RS08445^CC204-205TA可以增加L-缬氨酸的产量，分别将外源基因整合到宿主染色体中或由质粒在染色体外表达，构建了基因组上和质粒上过表达CEY17_RS08445基因或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌株（重组菌）。

1、构建基因组上过表达CEY17_RS08445基因或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌株

采用NEBuilder重组技术进行载体构建，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及CEY17_RS08445或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260中引入CEY17_RS08445或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因。引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：

P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGTAGTGCCGTGCGTACCCCA3'（SEQID No.21），

P8:5'ACTGATGCAGCGTGCTGATTCCCAACCCCAATCGCAATGT3'（SEQ ID No.22），

P9:5'ACATTGCGATTGGGGTTGGGAATCAGCACGCTGCATCAGT3'（SEQ ID No.23），

P10:5'GTGCGGGTTGGGGTTTTTGATTATGGCCTGCGCCAGGTGT3'（SEQ ID No.24），

P11:5'ACACCTGGCGCAGGCCATAATCAAAAACCCCAACCCGCAC3'（SEQ ID No.25），

P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGTTGGTTTAGCGGAGCTGCA 3'（SEQ ID No.26）。

重组菌（工程菌株）的构建方法如下：

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067或重组菌YPV-073为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段795 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260 CEY17_RS02570基因及其CEY17_RS02575的间隔区，序列如SEQ ID No.6所示），CEY17_RS08445基因及其启动子片段1689 bp（序列如SEQ ID No.7所示）或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因及其启动子片段1689 bp（序列如SEQ ID No.8所示）及下游同源臂片段769 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260 CEY17_RS02575基因及其CEY17_RS02570的间隔区，序列如SEQ ID No.9所示）。

PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xba I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒（购自Addgene公司，该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（购自NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5α（购自TAKARA公司）后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒（重组载体），分别为pK18-CEY17_RS08445OE、pK18-RS08445^CC204 ^-205TAOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。

重组载体pK18-CEY17_RS08445OE用于将外源基因CEY17_RS08445整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达野生型CEY17_RS08445基因。

重组载体pK18-RS08445^CC204-205TAOE用于将外源基因CEY17_RS08445^CC204-205TA整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达突变型基因CEY17_RS08445^CC204-205TA。

PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μL，Mg²⁺（25 mM）4 μL，引物（10 pM）各2 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，总体积50 μL。

PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s（30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将测序正确的整合质粒（pK18-CEY17_RS08445OE、pK18-CEY17_RS08445^CC204- ^205TAOE）分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1688 bp（序列如SEQ ID No.10所示）的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1667 bp（序列如SEQ ID No.11所示）的菌为CEY17_RS08445或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区上的阳性菌株，分别命名为YPV-074（不含突变点）和YPV-075（含突变点）。

重组菌YPV-074含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的CEY17_RS08445基因；具体地，重组菌YPV-074是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为CEY17_RS08445基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝CEY17_RS08445基因的重组菌可以显著和稳定地提高CEY17_RS08445基因的表达量。重组菌YPV-074为在基因组上过表达野生型CEY17_RS08445基因的工程菌，是将所述重组载体pK18-CEY17_RS08445OE导入大肠杆菌DH5α得到的重组菌。

重组菌YPV-075含有SEQ ID No.3所示的突变的CEY17_RS08445^CC204-205TA基因；具体地，重组菌YPV-075是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为CEY17_RS08445^CC204-205TA基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。重组菌YPV-075为在基因组上过表达突变型CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌，是将所述重组载体pK18-CEY17_RS08445^CC204-205TAOE导入大肠杆菌DH5α得到的重组菌。

PCR鉴定引物如下所示：

P13:5'CGGTTAGATTTTTTGGCCCC3'（对应上同源臂CEY17_RS02570的外侧）（SEQ IDNo.27），

P14:5'GGATGACGTCGCGGGCTGCG3'（对应CEY17_RS08445基因内部）（SEQ IDNo.28），

P15:5'TTGAGCCACTGTGGAACTCC3'（对应CEY17_RS08445基因内部）（SEQ IDNo.29），

P16:5'TCTGGACTGGGTGTTGCGCT3'（对应下同源臂CEY17_RS02575的外侧）（SEQ IDNo.30）。

2、构建质粒上过表达CEY17_RS08445基因或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌株

采用NEBuilder重组技术进行载体构建，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成一对扩增CEY17_RS08445或CEY17_RS08445^CC204-205TA基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：

P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCAATCAGCACGCTGCATCAGT3'（带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列）（SEQ ID No.31），

P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTTATGGCCTGCGCCAGGTGT3'（带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列）（SEQ ID No.32）。

重组菌（工程菌株）的构建方法如下：

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067和重组菌YPV-073为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得CEY17_RS08445基因及其启动子片段1719 bp（序列如SEQ ID No.12所示）和CEY17_RS08445^CC204-205TA基因及其启动子片段1719 bp（序列如SEQ ID No.13所示），对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I/KpnI酶切回收的穿梭质粒pXMJ19用NEBuilder酶（购自NEB公司，该质粒上含有氯霉素抗性作为筛选标记）50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5α（购自TAKARA公司）后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达载体pXMJ19-CEY17_RS08445（含有CEY17_RS08445基因）和pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA（含有CEY17_RS08445^CC204-205TA基因），将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。

重组载体pXMJ19-CEY17_RS08445是将pXMJ19载体的EcoR I和KpnI识别位点间的片段（小片段）替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的DNA片段，保持pXMJ19载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。所述重组载体pXMJ19-CEY17_RS08445用于将外源基因CEY17_RS08445通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达野生型CEY17_RS08445基因。

重组载体pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA是将pXMJ19载体的EcoR I和KpnI识别位点间的片段（小片段）替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.13的DNA片段，保持pXMJ19载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。所述重组载体pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA用于将外源基因CEY17_RS08445^CC204-205TA通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达突变型CEY17_RS08445^CC204-205TA基因。

将测序正确的pXMJ19-CEY17_RS08445和pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R（-48）/P18进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1758 bp片段的为阳性菌株，其被命名为YPV-076（不含突变点）和YPV-077（含突变点）。

重组菌YPV-076含有SEQ ID No.1所示的CEY17_RS08445基因，重组菌YPV-076为在质粒上过表达野生型CEY17_RS08445基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-CEY17_RS08445在染色体外进行过表达。

重组菌YPV-077含有SEQ ID No.3所示的突变的CEY17_RS08445^CC204-205TA基因，重组菌YPV-077为在质粒上过表达突变型CEY17_RS08445^CC204-205TA基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-CEY17_RS08445^CC204-205TA在染色体外进行过表达。

实施例3、构建基因组上缺失CEY17_RS08445基因的工程菌株

采用NEBuilder重组技术进行载体构建，根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067的基因组序列，合成两对扩增CEY17_RS08445基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段，以同源重组的方式敲除谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中CEY17_RS08445基因。引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：

P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGTTTCCAAGATCCACTCTGT3'（SEQID No.33），

P20:5'GATCATTTTTTGCCCCTAAAGATGGTAGCGTCACGATCCT3'（SEQ ID No.34），

P21:5'AGGATCGTGACGCTACCATCTTTAGGGGCAAAAAATGATC3'（SEQ ID No.35），

P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACGGAAGTGATTTCGCTGTG3'（SEQ ID No.36）。

重组菌（工程菌株）的构建方法如下：

以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别以引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增，获得CEY17_RS08445的上游同源臂片段670 bp及CEY17_RS08445的下游同源臂片段659 bp。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xba I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒（购自Addgene公司，该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（购自NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5α（购自TAKARA公司）后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除质粒pK18-ΔCEY17_RS08445，此重组质粒pK18-ΔCEY17_RS08445中包含名称为ΔCEY17_RS08445的Up-DownDNA 1289 bp（序列如SEQ ID No.14所示）。

将该质粒中ΔCEY17_RS08445的 Up-Down DNA进行测序，将测序正确的敲除质粒pK18-ΔCEY17_RS08445电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过如下引物（上海invitrogen公司合成）进行PCR鉴定：

P23:5'GTTTCCAAGATCCACTCTGT3'（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260 tal基因内部）（SEQ ID No.37），

P24:5'ACGGAAGTGATTTCGCTGTG3'（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260 CEY17_RS08450基因内部）（SEQ ID No.38）。

上述PCR同时扩增出大小1215 bp及2760 bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2760 bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15%蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1215 bp条带的菌株为CEY17_RS08445基因编码区被敲除的阳性菌株CEY17_RS08445。再次通过P23/P24引物PCR扩增阳性菌株CEY17_RS08445片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPV-078（谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260上的基因组上的CEY17_RS08445基因被敲除）。

实施例4、L-缬氨酸发酵实验

将上述实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（购自上海百仑生物科技有限公司）中以表3所示的培养基和表4所示的发酵控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表5所示。

结果如表5所示，在谷氨酸棒杆菌中对CEY17_RS08445基因编码区进行定点突变CEY17_RS08445^CC204-205TA及过表达，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。

表3 发酵培养基配方（其余为水）

成分	配方
		硫酸铵	14 g/L
磷酸二氢钾	1 g/L
		磷酸氢二钾	1 g/L
硫酸镁	0.5 g/L
		酵母粉	2 g/L
硫酸亚铁	18 mg/L
		硫酸锰	4.2 mg/L
生物素	0.02 mg/L
		维生素B1	2 mg/L
antifoam（CB-442）消泡剂）	0.5 mL/L
		70%葡萄糖（底糖）	40 g/L

表4 发酵控制工艺

校正DO 100%	温度33 ℃、风量1 L/min、转速400 rpm、罐压0.01 mpa，5 min后标定
		接种量	3.5%
培养温度℃	33 ℃
		pH	pH7.0±0.05
溶氧DO	10-20%
		初始条件	温度33℃、pH 7.0、罐压0 Mpa、风量0.1 L/min、转速400 rpm
全程控制	温度33℃、pH 7.0、罐压0 Mpa、风量0.2 L/min、转速400 rpm
		残糖控制	F12h前0.1-0.2%；F12h后结合DO要求控制残糖≤0.02%
培养成熟标准	OD<sub>610</sub> 30-35；OD<sub>610</sub>＞30后停止通风静止2小时（根据批次实验目的，进行菌体分离或连续催化）
		流加物料	氨水、70%浓糖、5%泡敌
发酵周期	18-20 h左右

表5 L-缬氨酸发酵实验结果

菌株	OD<sub>610</sub>	L-缬氨酸产量（g/L）
			谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260	98.2	84.1
YPV-073	99.1	84.3
			YPV-074	98.6	84.7
YPV-075	99.8	84.9
			YPV-076	99.7	85.8
YPV-077	99.5	85.4
			YPV-078	96.1	83.2

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 北京中科伊品生物科技有限公司

<120> 制备L-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 1

gtgagcacaa acacgacccc ctccagctgg acaaacccac tgcgcgaccc gcaggataaa 60

cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct tcggtgtcac tggcgacttg 120

gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa accgcggatt gctgccccca 180

ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca aagaagactt tgaaaaatac 240

gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc gtgaaaatgt ttgggagcgc 300

ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg atgatgcagc tttcgacaac 360

ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca ccgccggcaa ctgggcttac 420

tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc accagctgga gcgttccggc 480

atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca tcgagaagcc tttcggccac 540

aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg cagtcttccc agaatcttct 600

gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct ggctctgcgt 660

tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca cgtccagatc 720

accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg catcggcgca 780

gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc catggaagaa 840

ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct ctctgcgaca 900

aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc cggttggcag 960

ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga gtccaccact 1020

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tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt ggtgtttaaa 1140

gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca aaacgccatc 1200

gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa ggttccaggt 1260

tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc cttcactgaa 1320

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gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc cataa 1545

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 2

Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp

1 5 10 15

Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val

20 25 30

Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala

35 40 45

Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu

50 55 60

Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr

65 70 75 80

Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn

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Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe

100 105 110

Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile

115 120 125

Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile

130 135 140

Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly

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Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys

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Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val

180 185 190

Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu

195 200 205

Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln

210 215 220

Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile

225 230 235 240

Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp

245 250 255

Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu

260 265 270

Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln

275 280 285

Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr

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Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln

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Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro

325 330 335

Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser

340 345 350

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355 360 365

Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His

370 375 380

Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile

385 390 395 400

Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser

405 410 415

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Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg

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Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn

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Trp Asp Ser Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly

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Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg

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Arg Pro

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<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp

1 5 10 15

Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val

20 25 30

Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala

35 40 45

Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu

50 55 60

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Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn

85 90 95

Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe

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Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile

115 120 125

Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile

130 135 140

Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly

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Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys

165 170 175

Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val

180 185 190

Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu

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Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln

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Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile

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Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His

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Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile

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Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

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<212> DNA

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<400> 9

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tttttttcat gaattaaaca tagtactttg ctggtaaaaa tattggagaa ccccactggc 480

ctacatggtc agtgggggca tttttgcgtt tcacccctca aaaatcatca ccacacttgc 540

gggatttccc cctgatttcc cccactccca caccattccc agtggacagt gtggacgtat 600

tggacacatt aaacacattg cgaccaggta aaacgtcatg accaggtatc gtcaatgttc 660

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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cgtaccccat tagaaagtga aaattcactg attctagcca gtcacgctgg gaatcattac 120

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aataggggac agtagacatt aattacacct aaaaagaaaa gggcccccat gaggcgcatc 240

gttgagaggc gttgggggtg ctgttggctt ctacgatata tctaattttg cctgatgtgt 300

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cagccatcga ccctagagac attgacaccg caaaacagcg catacgggca taccaggcaa 660

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cattccacca gattccttca cagcggtctg ccaccagctg gagcgttccg gcatggctga 1380

atccaccgaa gaagcatggc gccgcgtgat catcgagaag cctttcggcc acaacctcga 1440

atccgcacac gagctcaacc agctggtcaa cgcagtcttc ccagaatctt ctgtgttccg 1500

catcgaccac tatttgggca aggaaacagt tcaaaacatc ctggctctgc gttttgctaa 1560

ccagctgttt gagccactgt ggaactccaa ctacgttgac cacgtccaga tcaccatggc 1620

tgaagatatt ggcttgggtg gacgtgctgg ttactacgac ggcatcggcg cagcccgcga 1680

cgtcatcc 1688

<210> 11

<211> 1667

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

ttgagccact gtggaactcc aactacgttg accacgtcca gatcaccatg gctgaagata 60

ttggcttggg tggacgtgct ggttactacg acggcatcgg cgcagcccgc gacgtcatcc 120

agaaccacct gatccagctc ttggctctgg ttgccatgga agaaccaatt tctttcgtgc 180

cagcgcagct gcaggcagaa aagatcaagg tgctctctgc gacaaagccg tgctacccat 240

tggataaaac ctccgctcgt ggtcagtacg ctgccggttg gcagggctct gagttagtca 300

agggacttcg cgaagaagat ggcttcaacc ctgagtccac cactgagact tttgcggctt 360

gtaccttaga gatcacgtct cgtcgctggg ctggtgtgcc gttctacctg cgcaccggta 420

agcgtcttgg tcgccgtgtt actgagattg ccgtggtgtt taaagacgca ccacaccagc 480

ctttcgacgg cgacatgact gtatcccttg gccaaaacgc catcgtgatt cgcgtgcagc 540

ctgatgaagg tgtgctcatc cgcttcggtt ccaaggttcc aggttctgcc atggaagtcc 600

gtgacgtcaa catggacttc tcctactcag aatccttcac tgaagaatca cctgaagcat 660

acgagcgcct cattttggat gcgctgttgg atgaatccag cctcttccct accaacgagg 720

aagtggaact gagctggaag attctggatc caattcttga agcatgggat tccgatggag 780

aacctgagga ttacccagca ggtacgtggg gtccaaagag cgctgatgaa atgctttccc 840

gcaacggtca cacctggcgc aggccataat caaaaacccc aacccgcaca tttttagatt 900

tctattttgt gtacataggg ttcggaacaa agcttaaacc atccccaatt gaaatgtcgt 960

tacacaccca catgtttgaa gtggagcaaa ccgaaaacca gttttcccca acggcagccg 1020

ccccccacgt tgaaccttcg aaatagtagg caacaccatc aagcggatct tcatcaagcg 1080

aaatagtgat tgactcttca ccgttccgct tacaaactgc gttagtgtcg ctattttcca 1140

cccacttgtc acactcgtac ccgttttcat ttagccattt ttcggcatgt cctattttct 1200

cgaaccgggc aggagcgtca gggcttccgc agcccgctag tagtagtccg gctgcaatga 1260

tgcttaatgt ttttttcatg aattaaacat agtactttgc tggtaaaaat attggagaac 1320

cccactggcc tacatggtca gtgggggcat ttttgcgttt cacccctcaa aaatcatcac 1380

cacacttgcg ggatttcccc ctgatttccc ccactcccac accattccca gtggacagtg 1440

tggacgtatt ggacacatta aacacattgc gaccaggtaa aacgtcatga ccaggtatcg 1500

tcaatgttct tgatgaattt ccgcaccgca ggattatcat tcgaggtgga ataaatagcc 1560

tgcagctccg ctaaaccaac aggtagatca taaaaatggc gatactcaac accgctgtaa 1620

ttgagttttt tcgcggactc cggaaccagc gcaacaccca gtccaga 1667

<210> 12

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccaatc agcacgctgc atcagtaacg 60

gcgacataaa atcgaattag ttcgatctta tgtggccgtt acacatcttt cattaaagaa 120

aggatcgtga cgctaccatc gtgagcacaa acacgacccc ctccagctgg acaaacccac 180

tgcgcgaccc gcaggataaa cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct 240

tcggtgtcac tggcgacttg gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa 300

accgcggatt gctgccccca ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca 360

aagaagactt tgaaaaatac gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc 420

gtgaaaatgt ttgggagcgc ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg 480

atgatgcagc tttcgacaac ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca 540

ccgccggcaa ctgggcttac tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc 600

accagctgga gcgttccggc atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca 660

tcgagaagcc tttcggccac aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg 720

cagtcttccc agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc 780

aaaacatcct ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact 840

acgttgacca cgtccagatc accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt 900

actacgacgg catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg 960

ctctggttgc catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga 1020

tcaaggtgct ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc 1080

agtacgctgc cggttggcag ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct 1140

tcaaccctga gtccaccact gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc 1200

gctgggctgg tgtgccgttc tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg 1260

agattgccgt ggtgtttaaa gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat 1320

cccttggcca aaacgccatc gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct 1380

tcggttccaa ggttccaggt tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct 1440

actcagaatc cttcactgaa gaatcacctg aagcatacga gcgcctcatt ttggatgcgc 1500

tgttggatga atccagcctc ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc 1560

tggatccaat tcttgaagca tgggattccg atggagaacc tgaggattac ccagcaggta 1620

cgtggggtcc aaagagcgct gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc 1680

cataagtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgat 1719

<210> 13

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccaatc agcacgctgc atcagtaacg 60

gcgacataaa atcgaattag ttcgatctta tgtggccgtt acacatcttt cattaaagaa 120

aggatcgtga cgctaccatc gtgagcacaa acacgacccc ctccagctgg acaaacccac 180

tgcgcgaccc gcaggataaa cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct 240

tcggtgtcac tggcgacttg gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa 300

accgcggatt gctgccccca ggattctcgt tggtaggtta cggtagccgc gaatggtcca 360

aagaagactt tgaaaaatac gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc 420

gtgaaaatgt ttgggagcgc ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg 480

atgatgcagc tttcgacaac ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca 540

ccgccggcaa ctgggcttac tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc 600

accagctgga gcgttccggc atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca 660

tcgagaagcc tttcggccac aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg 720

cagtcttccc agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc 780

aaaacatcct ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact 840

acgttgacca cgtccagatc accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt 900

actacgacgg catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg 960

ctctggttgc catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga 1020

tcaaggtgct ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc 1080

agtacgctgc cggttggcag ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct 1140

tcaaccctga gtccaccact gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc 1200

gctgggctgg tgtgccgttc tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg 1260

agattgccgt ggtgtttaaa gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat 1320

cccttggcca aaacgccatc gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct 1380

tcggttccaa ggttccaggt tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct 1440

actcagaatc cttcactgaa gaatcacctg aagcatacga gcgcctcatt ttggatgcgc 1500

tgttggatga atccagcctc ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc 1560

tggatccaat tcttgaagca tgggattccg atggagaacc tgaggattac ccagcaggta 1620

cgtggggtcc aaagagcgct gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc 1680

cataagtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgat 1719

<210> 14

<211> 1289

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggttt ccaagatcca ctctgtggct 60

tccttcttcg tctctcgcgt cgacgttgag atcgacaagc gcctcgaggc aatcggatcc 120

gatgaggctt tggctctgcg cggcaaggca ggcgttgcca acgctcagcg cgcttacgct 180

gtgtacaagg agcttttcga cgccgccgag ctgcctgaag gtgccaacac tcagcgccca 240

ctgtgggcat ccaccggcgt gaagaaccct gcgtacgctg caactcttta cgtttccgag 300

ctggctggtc caaacaccgt caacaccatg ccagaaggca ccatcgacgc tgttctggag 360

cagggcaacc tgcacggcga caccctgtcc aactccgcgg cagaagctga cgctgtgttc 420

tcccagcttg aggctctggg cgttgacttg gcagatgtct tccaggtcct ggagaccgag 480

ggcgtggaca agttcgttgc ttcttggagc gaactacttg agtccatgga agctcgcctg 540

aagtagaatc agcacgctgc atcagtaacg gcgacataaa atcgaattag ttcgatctta 600

tgtggccgtt acacatcttt cattaaagaa aggatcgtga cgctaccatc tttaggggca 660

aaaaatgatc tttgaacttc cggataccac cacccagcaa atttccaaga ccctaactcg 720

actgcgtgaa tcgggcaccc aggtcaccac cggccgagtg ctcaccctca tcgtggtcac 780

tgactccgaa agcgatgtcg ctgcagttac cgagtccacc aatgaagcct cgcgcgagca 840

cccatctcgc gtgatcattt tggtggttgg cgataaaact gcagaaaaca aagttgacgc 900

agaagtccgt atcggtggcg acgctggtgc ttccgagatg atcatcatgc atctcaacgg 960

acctgtcgct gacaagctcc agcatgtcgt cacaccactg ttgcttcctg acacccccat 1020

cgttgcttgg tggccaggtg aatcaccaaa gaatccttcc caggacccaa ttggacgcat 1080

cgcacaacga cgcatcactg atgctttgta cgaccgtgac gacgcactag aagatcgtgt 1140

tgagaactat cacccaggtg ataccgacat gacgtgggcg cgccttaccc agtggcgggg 1200

acttgttgcc tcatcattgg atcacccacc acacagcgaa atcacttccg tgggtaccga 1260

gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctg 1289

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggcat ccaccggcgt gaagaa 56

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

ccattcgcgg ctaccgtaac ctaccaacga gaat 34

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

attctcgttg gtaggttacg gtagccgcga atgg 34

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtaccccc agagccaaga gctggatc 58

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

ctggcccttc cggcatggtg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

atcatcaaag ttgccgcgaa 20

<210> 21

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtag tgccgtgcgt acccca 56

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

actgatgcag cgtgctgatt cccaacccca atcgcaatgt 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

acattgcgat tggggttggg aatcagcacg ctgcatcagt 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

gtgcgggttg gggtttttga ttatggcctg cgccaggtgt 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

acacctggcg caggccataa tcaaaaaccc caacccgcac 40

<210> 26

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgt tggtttagcg gagctgca 58

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

cggttagatt ttttggcccc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

ggatgacgtc gcgggctgcg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

ttgagccact gtggaactcc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

tctggactgg gtgttgcgct 20

<210> 31

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccaatc agcacgctgc atcagt 56

<210> 32

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacttatgg cctgcgccag gtgt 54

<210> 33

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggttt ccaagatcca ctctgt 56

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

gatcattttt tgcccctaaa gatggtagcg tcacgatcct 40

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

aggatcgtga cgctaccatc tttaggggca aaaaatgatc 40

<210> 36

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccac ggaagtgatt tcgctgtg 58

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

gtttccaaga tccactctgt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

acggaagtga tttcgctgtg 20

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：

B1）编码权利要求1所述任一蛋白质的核酸分子；

B2）编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

B3）核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

C1）含有权利要求2所述任一核酸分子的表达盒；

C2）含有权利要求2所述任一核酸分子的重组载体、或含有C1）所述任一表达盒的重组载体；

C3）含有权利要求2所述任一核酸分子的重组微生物、或含有C1）所述任一表达盒的重组微生物、或含有C2）所述任一重组载体的重组微生物。

4.D1）-D8）中任一项在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用，和/或，在制备L-缬氨酸中的应用，和/或，在调控微生物L-缬氨酸的产量中的应用，其中所述D1）-D8）为：

D1）权利要求1所述的任一蛋白质；

D2）权利要求2所述的任一核酸分子；

D3）权利要求3所述的任一生物材料；

D4）核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

D6）含有D4）或D5）中所述DNA分子的表达盒；

5.一种提高微生物L-缬氨酸的产量的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：

E1）提高目的微生物中的权利要求2所述任一核酸分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E2）提高目的微生物中的权利要求4中D4）或D5）所述DNA分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E3）对所述目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第69位的精氨酸残基突变为另一种氨基酸残基。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第69位的精氨酸残基突变为丝氨酸残基。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述突变是通过定点突变方法将SEQ IDNo.1所示DNA分子中第204-205位的核苷酸CC突变为TA。

9.一种构建权利要求3或4中所述重组微生物的方法，其特征在于，所述方法包括至少下述任一种：

F1）将权利要求2所述的任一核酸分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

10.一种制备L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求3或4中所述的任一重组微生物生产L-缬氨酸。