CN114717237A

CN114717237A - 一种ep6启动子与其相关生物材料及应用

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Publication number: CN114717237A
Application number: CN202210650799.3A
Authority: CN
Inventors: 魏爱英; 孟刚; 贾慧萍; 米杰; 杨立鹏; 苏厚波; 田斌
Original assignee: Beijing Zhongke Yipin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongke Yipin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2042-06-10
Also published as: WO2023236634A1; CN114717237B

Abstract

本发明公开了一种EP6启动子与其相关生物材料及应用。本发明公开的EP6启动子，其序列为序列表中SEQ ID No.3。本发明将EP6启动子启动相应氨基酸合成途径中基因得到相应的表达盒，然后将该表达盒作为外源强启动子整合到高产氨基酸的细菌中替换氨基酸合成关键基因的原始启动子，实现了相应氨基酸产量的提高。说明，本发明的EP6启动子不仅具有高启动活性，还可以用于生产氨基酸，具有很要的应用前景。

Description

一种EP6启动子与其相关生物材料及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种EP6启动子与其相关生物材料及应用。

背景技术

目前工业上产氨基酸的水平已有较大提高，但如何在较高水平的基础上进一步提升氨基酸的产量，则需要全面考虑产氨基酸的菌生长所需的碳源，以及在发酵后期碳源如何最大限度的进入氨基酸的合成途径。为了解决该问题，对于产某种氨基酸的细菌而言，不同强度的启动子需要应用到相应氨基酸代谢通路的不同基因上，以达到氨基酸代谢通路与细菌生长的平衡。

发明内容

本发明的目的是提供一种EP6启动子，利用EP6启动子可以生产氨基酸。

本发明提供的EP6启动子，其序列为序列表中SEQ ID No.3。

本发明还提供了与EP6启动子相关的生物材料，所述生物材料为下述B1）至B7）中的任一种：

B1）含有EP6启动子的表达盒；

B2）含有EP6启动子的重组载体；

B3）含有B1）所述表达盒的重组载体；

B4）含有EP6启动子的重组微生物；

B5）含有B1）所述表达盒的重组微生物；

B6）含有B2）所述重组载体的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，B1）所述的含有EP6启动子的表达盒，是指能够在宿主细胞中EP6启动子可驱动目的基因表达的DNA，该DNA不但可包括目的基因，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有EP6启动子的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌（brevibacterium flavum）、北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌（Pantoea）。

本发明还提供了EP6启动子在作为启动子中的应用。

本发明还提供了EP6启动子或所述生物材料在生产氨基酸中的应用。

上述应用中，所述氨基酸可为赖氨酸、谷氨酸或缬氨酸。

本发明的EP6启动子可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的赖氨酸、谷氨酸与缬氨酸，所生产的产物还可为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。各种产物的生产时，将本发明的EP6启动子置于目的产物合成途径中基因上游并使EP6启动子驱动目的产物合成途径中基因的合成即可实现目的产物的生产。

本发明还提供了一种生产氨基酸的方法，所述方法包括：将EP6启动子导入能合成目的氨基酸的生物细胞中，使EP6启动子驱动所述生物细胞中目的氨基酸合成途径中基因的表达，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到目的氨基酸。

上述方法中，所述生物细胞可为能合成目的氨基酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。

所述生物细胞为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。

所述细菌可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌（brevibacterium flavum）、北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌（Pantoea）。

在本发明的一个实施例中，所述目的氨基酸为赖氨酸，所述细菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.12856。

利用本发明启动子生产赖氨酸所用细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.12856。本发明可将本发明的EP6启动子置于这些细菌的赖氨酸合成途径中基因上游，使本发明的EP6启动子可以通过驱动这些细菌中赖氨酸合成途径中基因的表达进而合成赖氨酸。

在本发明的一个实施例中，所述目的氨基酸为谷氨酸，所述细菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No. 21220。

利用本发明启动子生产谷氨酸所用细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No. 21220。本发明可将本发明的EP6启动子置于这些细菌的谷氨酸合成途径中基因上游，使本发明的EP6启动子可以通过驱动这些细菌中谷氨酸合成途径中基因的表达进而合成谷氨酸。

在本发明的一个实施例中，所述目的氨基酸为缬氨酸，所述细菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260。

利用本发明启动子生产缬氨酸所用细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260。本发明可将本发明的EP6启动子置于这些细菌的缬氨酸合成途径中基因上游，使本发明的EP6启动子可以通过驱动这些细菌中缬氨酸合成途径中基因的表达进而合成缬氨酸。

上述方法中，所述目的氨基酸可为赖氨酸、谷氨酸或缬氨酸。

本发明的EP6启动子可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的赖氨酸、谷氨酸与缬氨酸，所生产的产物还可为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。各种目的产物的生产时，将本发明的EP6启动子置于目的产物合成途径中基因上游并使EP6启动子驱动目的产物合成途径中基因的合成即可实现目的产物的生产。

在本发明的一个实施例中，所述目的氨基酸为赖氨酸，所述细菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.12856，赖氨酸合成途径中基因为lysA基因（SEQID No.4的第149-1486位）。

所述重组生物细胞通过将EP6启动子替换谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.12856中lysA基因原始启动子而实现。

在本发明的一个实施例中，所述目的氨基酸为谷氨酸，所述细菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220，谷氨酸合成途径中基因为BBD29_14295基因（SEQ ID No.11的第37-1161位）。

所述重组生物细胞通过将EP6启动子替换谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220中BBD29_14295基因原始启动子而实现。

在本发明的一个实施例中，所述目的氨基酸为缬氨酸，所述细菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260，缬氨酸合成途径中基因为ilvC基因（SEQID No.18第180-1196位）。

所述重组生物细胞通过将EP6启动子替换谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260中ilvC基因原始启动子而实现。

对产氨基酸的细菌，本发明将EP6启动子启动相应氨基酸合成途径中基因得到相应的表达盒，然后将该表达盒作为外源强启动子整合到高产氨基酸的细菌中替换氨基酸合成关键基因的原始启动子，实现了相应氨基酸产量的提高。说明，本发明的EP6启动子不仅具有高启动活性，还可以用于生产氨基酸，具有很要的应用前景。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

生物材料保藏说明。

分类命名：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。

菌株编号：YPGLU001。

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏单位简称：CGMCC。

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。

保藏日期：2020年11月23日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21220。

生物材料保藏说明。

分类命名：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。

菌株编号：YPFV1。

保藏单位简称：CGMCC。

保藏日期：2020年11月30日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21260。

生物材料保藏说明。

分类命名：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。

菌株编号：YP097158。

保藏单位简称：CGMCC。

保藏日期：2016年8月16日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12856。

附图说明

图1为EP6与yfjB的启动子活性的检测结果。PEP6即为EP6启动子。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

pEC-H10-mCherry载体：记载在申请号为202110256579.8的中国专利申请（公布号为CN 112980867 A）中，其制备方法如下：

以Wei等人(Promoter library-based module combination(PLMC)technologyforoptimizationofthreoninebiosynthesisinCorynebacteriumglutamicum .AppliedMicrobiology and Biotechnology .2018(102)4117-4130 .)报道的在谷氨酸棒杆菌中最强启动子H10(GCTCAACCCTTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATAGTCCGAGCACGGCGAAAGGATACTC)为模板，以及mCherry蛋白的基因序列和谷氨酸棒杆菌中表达载体pEC-XK99E的序列，设计并合成引物用于构建pEC-H10-mCherry的载体。引物设计如下(广州金唯智公司合成)：

引物1：5′-ggatctagagtcgacctgcag-3′；

引物2：5′-ttaACTAGTattgcgttgcgctcac-3′；

引物3：5′-caatACTAGTtaatgtgagttagcgcg-3′；

引物4：5′-AGAGCTTACCATACGCCGCCGGCTTAGAGCCGACCGGTAAGGGTTGAGCctagaggatccccgggtac-3′；

引物5：5′-GCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTTATGTATAGTCCGAGCACGGCGAAAGGATACTCatgcgtaaaggagaagaag-3′；

引物6：5′-cgactctagatccgccaaaacagcc-3′。

构建方法：以pEC-XK99E为模板，以引物1和引物2扩增pEC质粒的骨架区域(6743bp)；以启动子H10为模板，以引物3和引物4扩增含有H10启动子上游区域的片段(387bp)；以含有mCherry基因的质粒pBblactam (Zhang et al ., Development of atranscription factor based lactam biosensor .ACS synthetic biology .2017 ,6 ,439-445 .)为模板，以引物5和引物6扩增含有H10启动子下游区域以及mCherry基因的片段(810bp)。

PCR扩增结束分别获得长度为387bp，810bp以及6743bp的条带，将上述三个条带分别进行琼脂糖凝胶电泳切胶回收，回收完后，以387bp和810bp条带的DNA片段为模板，利用引物3和引物6进行融合PCR扩增。对得到的PCR扩增片段进行切胶回收。然后将回收后的片段（即含有H10和mCherry的片段）与pEC骨架片段分别进行酶切(SpeI ,XbaI)，酶切完成后过柱纯化片段。以1：2的摩尔比将pEC骨架片段与含有H10和mCherry的片段混合，并加入T4DNA连接酶反应液，16℃连接1h后，将片段转入大肠杆菌DH5α菌株中，获得的序列正确的重组载体即为pEC-H10-mCherry载体。

pk18载体：Addgene公司，货号为MLCC1103。

下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.12856，菌株号为YP097158，已于2016年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12856。

下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220，菌株号为YPGLU001，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21220。

下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260，菌株号为YPFV1，已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21260。

实施例1、EP6具有启动子活性。

一、构建大肠杆菌中强启动子PyfjB启动mCherry表达的pEC-PyfjB-mCherry载体。

以pEC-H10-mCherry载体为骨架，采用NEBuilder重组技术构建含大肠杆菌W3110yfjB启动子 (SEQ ID No.1：gaatttctccgcgtttttttcgcattcatctcgctaacttcgcttattatggggatcagtttcagggtttcaagggaagcactcacattgtcatcaatcttcgcaacaaggacctcggaaaa)的pEC-PyfjB-mCherry载体，依据报告蛋白mCherry的表达情况，检测PyfjB启动强度，并作为后续突变启动子序列的对照处理。引物序列如下（上海invitrogen公司合成）：

pEC01：5′-ATGCGTAAAGGAGAAGAAGATAAC-3′；

pEC02：5′-CTAGAGGATCCCCGGGTAC-3′；

P1：5′-CATGGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGGAATTTCTCCGCGTTTTTTT-3′；

P2：5′-AATGATAGCCATGTTATCTTCTTCTCCTTTACGCATTTTTCCGAGGTCCTTGTTGC-3′。

构建方法：以pEC-H10-mCherry载体为模板，利用引物pEC01和pEC02扩增得到pEC-H10-mCherry载体的骨架区域7772bp；以SEQ ID No.1所示的DNA片段为模板，利用引物P1和P2扩增得到含有pEC-H10-mCherry载体同源臂的yfjB启动子（简称为PyfjB）片段194bp。

将上述两条DNA片段（pEC-H10-mCherry载体的骨架区域和含有pEC-H10-mCherry载体同源臂的PyfjB片段）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆经引物pECF/R (pECF：5′-GTACCCGGGGATCCTCTAG-3′，pECR：5′-GTTATCTTCTTCTCCTTTACGCAT-3′)进行鉴定，提取质粒获得序列正确的阳性重组载体，即为pEC-PyfjB-mCherry。

重组载体pEC-PyfjB-mCherry的序列为序列表中SEQ ID No.2，其中yfjB 启动子启动报告基因mCherry的表达，检测mCherry的荧光数值而获得yfjB 启动子的强度。

二、构建突变的yfjB启动子表达载体pEC-EP6-mCherry。

对SEQ ID No.1所示的PyfjB突变，得到EP6启动子，大小124bp，EP6启动子的序列为SEQ ID No.3。

采用NEBuilder重组技术进行载体构建，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P5：5′-CATGGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGGAATTTCTTCGCGTTTTTTT-3′；

P6：5′-AATGATAGCCATGTTATCTTCTTCTCCTTTACGCATGATTTGGAGGTCCCTGCGTT-3′。

构建方法：以pEC-PyfjB-mCherry载体为模板，引物pEC01和pEC02扩增pEC-H10-mCherry载体的骨架区域7772bp；以SEQ ID No.3所示的DNA片段为模板，以引物P5和P6扩增含有pEC-H10-mCherry载体同源臂的EP6启动子片段196bp。

将上述两条DNA片段（pEC-H10-mCherry载体的骨架区域和含有pEC-H10-mCherry载体同源臂的EP6启动子片段）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，用NEBuilder酶（NEB公司）50℃连接30 min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆经引物pECF/R (pECF：5′-GTACCCGGGGATCCTCTAG-3′，pECR：5′-GTTATCTTCTTCTCCTTTACGCAT-3′)进行鉴定，提取质粒获得序列正确的阳性重组载体，记为pEC-EP6-mCherry。

pEC-EP6-mCherry为将pEC-PyfjB-mCherry的PyfjB（SEQ ID No.1）替换为EP6（SEQID No.3）得到的重组载体。

三、启动子活性的测定。

将步骤二的pEC-EP6-mCherry和步骤一pEC-PyfjB-mCherry载体分别导入野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032中，得到重组菌ATCC13032/pEC-EP6-mCherry与ATCC13032/pEC-PyfjB-mCherry；将步骤二的pEC-EP6-mCherry和步骤一pEC-PyfjB-mCherry载体分别导入野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869中，得到重组菌ATCC13869/pEC-EP6-mCherry与ATCC13869/pEC-PyfjB-mCherry；将步骤二的pEC-EP6-mCherry和步骤一pEC-PyfjB-mCherry载体分别导入野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC14067中，得到重组菌ATCC14067/pEC-EP6-mCherry与ATCC14067/pEC-PyfjB-mCherry。比较这两种启动子在谷氨酸棒杆菌中的启动强度。

挑选上述6个重组菌的单克隆分别等量接种至含有900μL LBHIS培养基的96深孔板中，其中每个单克隆均含有3个重复，在30℃，800rpm条件下培养24h后用酶标仪检测mCherry的荧光数值，并根据荧光强度比较yfjB和EP6启动子活性。

LBHIS培养基：5g Tryptone（胰蛋白胨）/L, 5g NaCl/L, 2.5g yeast extract（酵母提取物）/L, 18.5g BHI（Brain Heart Infusion脑心浸液）/L, 91g sorbitol（山梨糖醇）/L, pH 7.2.

结果显示，EP6启动子具有启动子活性，且其启动活性明显高于yfjB启动子的启动活性（图1）。

实施例2、谷氨酸棒杆菌中赖氨酸代谢通路lysA基因启动子的替换及其对赖氨酸产量的影响。

一、重组菌的制备。

采用pk18载体，以同源重组的方法将EP6和yfjB启动子分别替换高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.12856中赖氨酸代谢通路的关键基因lysA的原始启动子（SEQ ID No.4的第1-148位），从而利用外源启动子启动赖氨酸代谢通路中lysA的表达，获得外源启动子-基因组合的赖氨酸生产菌，对这些生产菌发酵测试，发现以EP6启动lysA的菌株，能更高的增加赖氨酸的产量，将该菌株命名为YPL-4-042。SEQ IDNo.4的第149-1486位为lysA的序列。

采用NEBuilder重组技术构建载体，引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：

P7：5′-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCCCAGGTGAAGAAGTCGTTG-3′；

P8：5′-AAAAAAACGCGGAGAAATTCATGCCCCGTTCGACAATAAA-3′；

P9：5′-TTTATTGTCGAACGGGGCATGAATTTCTCCGCGTTTTTTT-3′；

P10：5′-GCGAGATCAGCTGGTGTCATTTTTCCGAGGTCCTTGTTGC-3′；

P11：5′-GCAACAAGGACCTCGGAAAAATGACACCAGCTGATCTCGC-3′；

P12：5′-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTCGAACATCATCTCCACGCC-3′；

P8E：5′-AAAAAAACGCGAAGAAATTCATGCCCCGTTCGACAATAAA-3′；

P9E：5′-TTTATTGTCGAACGGGGCATGAATTTCTTCGCGTTTTTTT-3′；

P10E：5′-GCGAGATCAGCTGGTGTCATGATTTGGAGGTCCCTGCGTT-3′；

P11E：5′-AACGCAGGGACCTCCAAATCATGACACCAGCTGATCTCGC-3′。

同源重组的具体方法如下：

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，以引物P7/P8（PCR产物序列为SEQ ID No.5第1-801位）进行PCR扩增，获得上游同源臂片段801bp；以载体pEC-PyfjB-mCherry为模板，以引物P9/P10进行PCR扩增，获得PyfjB 162bp（PCR产物序列为SEQ ID No.5第762-923位）；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，以引物P11/P12（PCR产物序列为SEQ ID No.5第884-1648位）进行PCR扩增，获得下游同源臂片段765bp。

PCR反应结束后，对得到的3种PCR产物采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。将回收后的3种PCR产物与经过XbalI和BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB载体（Addgene公司，该载体上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆用M13引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定获得阳性整合载体（重组载体），提取序列正确的重组载体记为pK18-PyfjB-lysAOE，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得载体整合到基因组上的重组子。

pK18-PyfjB-lysAOE含有SEQ ID No.5所示的DNA片段，SEQ ID No.5中，第1-801位为上游同源臂片段的序列，第884-1648位为下游同源臂片段的序列，第762-923位为PyfjB的序列。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，以引物P7/P8E（SEQ ID No.6第1-801位）进行PCR扩增，获得上游同源臂片段801bp；以pEC-EP6-mCherry为模板，以P9E/P10E进行PCR扩增，获得EP6 164bp（SEQ ID No.6第762-925位）；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，以引物P11E/P12（SEQ ID No.6第886-1650位）进行PCR扩增，获得下游同源臂片段765bp。

PCR反应结束后，对得到的3种PCR产物采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。将回收后的3种PCR产物与经过XbalI和BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB载体（Addgene公司，该载体上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆用M13引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定获得阳性整合载体（重组载体），提取序列正确的重组载体记为pK18-EP6-lysAOE，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得载体整合到基因组上的重组子。

pK18-EP6-lysAOE含有SEQ ID No.6所示的DNA片段，SEQ ID No.6中，第1-801位为上游同源臂片段的序列，第886-1650位为下游同源臂片段的序列，第762-925位为EP6的序列。

将测序正确的重组载体pK18-PyfjB-lysAOE、pK18-EP6-lysAOE分别电转化入高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.12856中，在恢复培养基中按照复苏培养条件进行培养，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，导入pK18-PyfjB-lysAOE的重组菌PCR扩增出885bp（SEQ ID No.7）片段的为阳性菌株，记为CGMCC No.12856/pK18-PyfjB-lysAOE；导入pK18-EP6-lysAOE的重组菌PCR扩增出885bp（SEQ ID No.8）片段的为阳性菌株，记为CGMCC No.12856/pK18-EP6-lysAOE，扩增不到片段的为原菌。

将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为841bp（SEQ ID No.9）的菌株为PyfjB替换高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.12856lysA原始启动子的阳性菌株，扩增出大小为843bp（SEQ IDNo.10）的菌株为EP6替换高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.12856 lysA原始启动子的阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。

将由导入pK18-PyfjB-lysAOE和pK18-EP6-lysAOE的重组菌得到的阳性菌株分别命名为YPL-4-041（PyfjB-lysA整合菌株）和YPL-4-042（EP6-lysA整合菌株）。

YPL-4-041（PyfjB-lysA整合菌株）是将高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.12856 lysA原始启动子（SEQ ID No.4的第1-148位）替换为yfjB启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌，其可以提高赖氨酸的产量；YPL-4-042（EP6-lysA整合菌株）是将高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.12856 lysA原始启动子（SEQ ID No.4的第1-148位）替换为EP6启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌，EP6启动子作为突变的yfjB启动子，其启动lysA的表达，更能提高赖氨酸的产量。

PCR鉴定引物如下所示：

P13：5′-GGCGACGATCTTGTTTGACC-3′（cg1332基因内部）；

P14：5′-ACTGATCCCCATAATAAGCG-3′（PyfjB内部）；

P15：5′-CGCTTATTATGGGGATCAGT-3′（PyfjB内部）；

P16：5′-GTAGTAGACATCGAAATCGG-3′（argS基因内部）。

恢复培养基：溶剂为水，溶质及其在恢复培养基中的含量分别为葡萄糖5g/L、尿素3g/L、酵母粉10g/L、生物素10μg/L、豆粕粉15g/L、丁二酸0.5g/L、磷酸二氢钾1 g/L、氯化钠2.5g/L、山梨醇91g/L、脑心浸液18.5g/L、pH7.0.

15%蔗糖的培养基：溶剂为水，溶质及其在15%蔗糖的培养基中的含量分别为蔗糖15g/L、尿素3g/L、酵母粉10g/L、生物素10μg/L、豆粕粉15g/L、丁二酸0.5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠2.5g/L、山梨醇91g/L、脑心浸液18.5g/L、琼脂粉15g/L、pH7.0。

复苏培养条件：46℃恢复培养基重悬细胞，转移至EP管，220rpm，37℃摇床培养45-60min，之后转移至30℃摇床培养45-60min，转速不变。

二、L-赖氨酸发酵实验。

将上述菌株YPL-4-041、YPL-4-042和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.12856在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以发酵培养基1和培养条件1进行发酵实验，发酵结束检测L-赖氨酸产量，每个菌株重复三次。

以高效液相色谱法检测L-赖氨酸的产量。

发酵培养基1：溶剂为水，溶质及其在发酵培养基1中的含量分别为淀粉水解糖30g/L、硫酸铵 12g/L、硫酸镁 0.87g/L、糖蜜 20g/L、酸化玉米浆 3mL/L、磷酸 0.4mL/L、氯化钾 0.53g/L、消泡剂(2%泡敌) 4mL/L、硫酸亚铁 120mg/L、硫酸锰 120mg/L、烟酰胺42mg/L、泛酸钙 6.3mg/L、维生素B1 6.3mg/L、硫酸铜 0.6g/L、硫酸锌 0.6g/L、生物素0.88mg/L。酸化玉米浆为宁夏伊品生物科技股份有限公司产品。

培养条件1：

校正DO 100%，温度37℃、风量4L/min、转速1000rpm、罐压0Mpa，5min后标定；

接种量：10%；

培养温度：37℃；

pH：6.9±0.05；

溶氧DO：10-30%；

初始条件：温度37℃、pH6.9、罐压0Mpa、风量3L/min、转速550rpm；

全程控制：全程控制 1、溶氧＜30%时，依次提转速750rpm→800rpm→风量4L/min→850rpm→950rpm；2、发酵6h提罐压0.01Mpa；12h提罐压0.02Mpa→0.03Mpa→0.04Mpa→0.05Mpa；

残糖控制：F12h前0.1-0.2%；F12h后结合DO要求控制残糖0.1-0.05%；

氨氮控制：F12h前0.1-0.15；F12-F32h0.15-0.25；F32h后0.1-0.15；

流加物料：25%氨水、70%浓糖、50%硫铵、10%泡敌；

发酵周期：48h左右。

结果显示，菌株CGMCC No.12856的L-赖氨酸产量为18.9g/100mL；YPL-4-041的L-赖氨酸产量为19.2g/100mL，显著高于菌株CGMCC No.12856（P<0.05）；YPL-4-042的L-赖氨酸产量为19.7g/100mL，显著高于菌株CGMCC No.12856（P<0.05）。由此表明，在赖氨酸生产菌CGMCC No.12856中以yfjB或者EP6启动子替换lysA原始启动子可以增加赖氨酸的产量，并且作为突变过的EP6启动lysA的表达，赖氨酸产量更高。

实施例3、谷氨酸棒杆菌中谷氨酸代谢通路BBD29_14295基因启动子的增加及其对谷氨酸产量的影响。

一、重组菌的制备。

采用pk18载体，以同源重组的方法将EP6和yfjB启动子分别替换高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21220中谷氨酸代谢通路的关键基因BBD29_14295的原始启动子（SEQ ID No.11的第1-36位），从而利用外源启动子启动谷氨酸代谢通路中BBD29_14295的表达，获得外源启动子-基因组合的谷氨酸生产菌，对这些生产菌发酵测试，发现以EP6启动BBD29_14295的菌株，能更高的增加谷氨酸的产量，将该菌株命名为YPG-092。SEQ ID No.11的第37-1161位为BBD29_14295的序列。

P17：5′-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGAAACAACGCAGCCATAG-3′；

P18：5′-AAAAAAACGCGGAGAAATTCTTAGAGGAATTTAACGCCTT-3′；

P19：5′-AAGGCGTTAAATTCCTCTAAGAATTTCTCCGCGTTTTTTT-3′；

P20：5′-TCGTCGATTAGCTCGAACATTTTTCCGAGGTCCTTGTTGC-3′；

P21：5′-GCAACAAGGACCTCGGAAAAATGTTCGAGCTAATCGACGA-3′；

P22：5′-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCATGACGTCCTGGAGCGCTGC-3′；

P18E：5′-AAAAAAACGCGAAGAAATTCTTAGAGGAATTTAACGCCTT-3′；

P19E：5′-AAGGCGTTAAATTCCTCTAAGAATTTCTTCGCGTTTTTTT-3′；

P20E：5′-TCGTCGATTAGCTCGAACATGATTTGGAGGTCCCTGCGTT-3′；

P21E：5′-AACGCAGGGACCTCCAAATCATGTTCGAGCTAATCGACGA-3′。

同源重组的具体方法如下：

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869为模板，以引物P17/P18（SEQ ID No.12第1-792位）进行PCR扩增，获得上游同源臂片段792bp；以载体pEC-PyfjB-mCherry为模板，以引物P19/P20进行PCR扩增，获得PyfjB 162bp（SEQ ID No.12第753-914位）；以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，以引物P21/P22（SEQ ID No.12第875-1699位）进行PCR扩增，获得下游同源臂片段825bp。

PCR反应结束后，对得到的3种PCR产物采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3种PCR产物与经过XbalI和BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB载体（Addgene公司，该载体上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆用M13引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定获得阳性整合载体（重组载体），将得到的序列正确的重组载体记为pK18-PyfjB-BBD29_14295OE，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得载体整合到基因组上的重组子。

pK18-PyfjB-BBD29_14295OE含有SEQ ID No.12所示的DNA片段，SEQ ID No.12中，第1-792位为上游同源臂片段的序列，第875-1699位为下游同源臂片段的序列，第753-914位为PyfjB的序列。

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869为模板，以引物P17/P18E（SEQ ID No.13第1-792位）进行PCR扩增，获得上游同源臂片段792bp；以载体pEC-EP6-mCherry为模板，以引物P19E/P20E进行PCR扩增，获得EP6 164bp（SEQ ID No.13第753-916位）；以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，以引物P21E/P22（SEQ ID No.13第877-1701位）进行PCR扩增，获得下游同源臂片段825bp。

PCR反应结束后，对得到的3种PCR产物采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3种PCR产物与经过XbalI和BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB载体（Addgene公司，该载体上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆用M13引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定获得阳性整合载体（重组载体），将得到的序列正确的重组载体记为pK18-EP6-BBD29_14295OE，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得载体整合到基因组上的重组子。

pK18-EP6-BBD29_14295OE含有SEQ ID No.13所示的DNA片段，SEQ ID No.13中，第1-792位为上游同源臂片段的序列，第877-1701位为下游同源臂片段的序列，第753-916位为EP6的序列。

将测序正确的重组载体（pK18-PyfjB-BBD29_14295OE、pK18-EP6-BBD29_14295OE）分别电转化入高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220中，在恢复培养基（同实施例2）中按照复苏培养条件（同实施例2）进行培养，对培养产生的单菌落通过P23/P24引物进行PCR鉴定，PyfjB-BBD29_14295整合菌PCR 扩增出849bp（SEQ ID No.14）片段的为阳性菌株，EP6-BBD29_14290整合菌PCR 扩增出849bp（SEQ ID No.15）片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。

将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基（同实施例2中的含15%蔗糖培养基。）上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P25/P26引物进行PCR鉴定，扩增出大小为889bp（SEQ IDNo.16）的菌株为PyfjB替换高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No. 21220基因组上BBD29_14295原始启动子的菌株；扩增出大小为891bp（SEQ ID No.17）的菌株为EP6替换高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220基因组上BBD29_14295原始启动子的菌株，扩增不到片段的为原菌。

将由PyfjB替换BBD29_14295原始启动子的重组菌株命名为YPG-091（PyfjB-BBD29_14295整合菌株），由EP6替换BBD29_14295原始启动子的重组菌株命名为YPG-092（EP6-BBD29_14295整合菌株）。

YPG-091（PyfjB-BBD29_14295整合菌株）是将高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21220 BBD29_14295原始启动子（SEQ ID No.11的第1-36位）替换为PyfjB，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌，其可以提高谷氨酸的产量；YPG-092（EP6-BBD29_14295整合菌株）是将高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220 BBD29_14295原始启动子（SEQ ID No.11的第1-36位）替换为EP6，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌，EP6启动子作为突变的yfjB启动子，其启动BBD29_14295的表达更能提高谷氨酸的产量。

PCR鉴定引物如下所示：

P23：5′-GAAGTAGGTC CTCGTGTTGC-3′（BBD29_14290基因内部）；

P24：5′-ACTGATCCCC ATAATAAGCG-3′（PyfjB内部）；

P25：5′-CGCTTATTAT GGGGATCAGT-3′（PyfjB内部）；

P26：5′-GACGAGTTGT GCTTGTAGTC-3′（BBD29_14295基因内部）。

二、L-谷氨酸发酵实验。

将上述菌株YPG-091、YPG-092和原始菌株CGMCC No.21220在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以发酵培养基2和培养条件2进行发酵实验，发酵结束检测L-谷氨酸产量与OD值。每个菌株重复三次。

谷氨酸产量由生物传感仪检测。

发酵培养基2：溶剂是水，溶质及其在发酵培养基2中的浓度为葡萄糖 5.0g/L、磷酸 0.38g/L、硫酸镁 1.85g/L、氯化钾 1.6g/L、生物素 550μg/L、维生素B1 300μg/L、硫酸亚铁 10mg/L、硫酸锰 10g/dl、KH₂PO₄ 2.8g/L、维生素C 0.75mg/L、维生素B12 2.5μg/L、对氨基苯甲酸 0.75mg/L、消泡剂 0.0015mL/dL、甜菜碱 1.5g/L、甘蔗糖蜜 7mL/L、玉米浆77mL/L、天冬氨酸 1.7g/L。

培养条件2：

校正DO 100%，温度32.5℃、风量7L/min、转速700rpm、罐压0Mpa，5min后标定；

接种量：13%；0h：转速400rpm，风量3L/min，压力0.05MPA，培养温度32.5℃；

菌液浓度OD=1.0：转速600rpm，风量5L/min，压力0.08MPA，培养温度37℃；

菌液浓度OD=1.0-菌液浓度OD=1.4：转速700rpm，风量7L/min，压力0.11MPA，培养温度38℃；

培养32h-34h 发酵结束，控制过程以溶氧50-20%做提降风量标准；

pH ：0h控制7.0，14h控制6.8；

流加糖控制：发酵罐流加糖浓度50-55%，控制发酵罐残糖0.5-1.0%。

结果显示，CGMCC No.21220的L-谷氨酸产量为102.1g/L，OD(562nm)为46.1；YPG-091的L-谷氨酸产量为103.3g/L，显著高于菌株CGMCC No.21220（P<0.05），OD(562nm)为46.6；YPG-092的L-谷氨酸产量为105.1g/L，显著高于菌株CGMCC No.21220（P<0.05），OD(562nm)为47.1。由此表明，在谷氨酸生产菌CGMCC No.21220中以yfjB或者EP6启动子替换BBD29_14295原始启动子可以增加谷氨酸的产量，并且作为突变过的EP6启动BBD29_14295的表达，谷氨酸产量更高。

实施例4、谷氨酸棒杆菌中缬氨酸代谢通路ilvC基因启动子的增加及其对缬氨酸产量的影响。

一、重组菌的制备。

采用pk18载体，以同源重组的方法将EP6和yfjB启动子分别替换高产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260中缬氨酸代谢通路的关键基因ilvC的原始启动子（SEQ ID No.18的第1-179位），从而利用外源启动子启动谷氨酸代谢通路中ilvC基因的表达，获得外源启动子-基因组合的缬氨酸生产菌，对这些生产菌发酵测试，发现以EP6启动ilvC的菌株，能更高的增加缬氨酸的产量，将该菌株命名为YPV-098。SEQID No.18的第180-1196位为ilvC的序列。

P27：5′-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGAGATCAACGACCGCCCAG-3′；

P28：5′-AAAAAAACGCGGAGAAATTCTTAGATCTTGGCCGGAGCCA-3′；

P29：5′-TGGCTCCGGCCAAGATCTAAGAATTTCTCCGCGTTTTTTT-3′；

P30：5′-TAAAGCAGTTCAATAGCCATTTTTCCGAGGTCCTTGTTGC-3′；

P31：5′-GCAACAAGGACCTCGGAAAAATGGCTATTGAACTGCTTTA-3′；

P32：5′-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGAGGCGCTTGGTGAAGGTG-3′；

P28E：5′-AAAAAAACGCGAAGAAATTC TTAGATCTTGGCCGGAGCCA -3′；

P29E：5′-TGGCTCCGGCCAAGATCTAAGAATTTCTTCGCGTTTTTTT-3′；

P30E：5′-TAAAGCAGTTCAATAGCCATGATTTGGAGGTCCCTGCGTT-3′；

P31E：5′-AACGCAGGGACCTCCAAATCATGGCTATTGAACTGCTTTA-3′。

同源重组的具体方法如下：

以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，以引物P27/P28（SEQ ID No.19第1-805位）进行PCR扩增，获得上游同源臂片段805bp；以载体pEC-PyfjB-mCherry为模板，以引物P29/P30进行PCR扩增，获得PyfjB 162bp（SEQ ID No.19第766-927位）以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，以引物P31/P32（SEQ ID No.19第888-1822位）进行PCR扩增，获得下游同源臂片段935bp。

PCR反应结束后，对得到的3种PCR产物采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3种PCR产物与经过XbalI和BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB载体（Addgene公司，该载体上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆用M13引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定获得阳性整合载体（重组载体），将得到的序列正确的重组载体记为pK18-PyfjB-ilvCOE，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得载体整合到基因组上的重组子。

pK18-PyfjB-ilvCOE含有SEQ ID No.19所示的DNA片段，SEQ ID No.19中，第1-805位为上游同源臂片段的序列，第888-1822位为下游同源臂片段的序列，第766-927位为PyfjB的序列。

以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，以引物P27/P28E（SEQ ID No.20第1-805位）进行PCR扩增，获得上游同源臂片段805bp；以载体pEC-EP6-mCherry为模板，以引物P29E/P30E进行PCR扩增，获得EP6 164bp（SEQ ID No.20第766-929位）；以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，以引物P31E/P32（SEQ ID No.20第890-1824位）进行PCR扩增，获得下游同源臂片段935bp。

PCR反应结束后，对得到的3种PCR产物采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3种PCR产物与经过XbalI和BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB载体（Addgene公司，该载体上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（NEB公司）50 ℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆用M13引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定获得阳性整合载体（重组载体），将得到的序列正确的重组载体记为pK18-EP6-ilvCOE，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得载体整合到基因组上的重组子。

pK18-EP6-ilvCOE含有SEQ ID No.20所示的DNA片段，SEQ ID No.20中，第1-805位为上游同源臂片段的序列，第890-1824位为下游同源臂片段的序列，第766-929位为EP6的序列。

将测序正确的整合载体（pK18-PyfjB-ilvCOE、pK18-EP6-ilvCOE）分别电转化入高产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中，在恢复培养基（同实施例2）中按照复苏培养条件（同实施例2）进行培养，对培养产生的单菌落通过P33/P34引物进行PCR鉴定，PyfjB-ilvC整合菌PCR 扩增出901bp（SEQ ID No.21）片段的为阳性菌株，EP6-ilvC整合菌株PCR扩增出901bp（SEQ ID No.22）片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。

将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基（同实施例2中的15%蔗糖培养基。）上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P35/P36引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1023bp（SEQ IDNo.23）的菌株为PyfjB替换高产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上ilvC原始启动子的阳性菌株；扩增出大小为1025bp（SEQ ID No.24）的菌株为EP6替换高产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上ilvC原始启动子的菌株，扩增不到片段的为原菌。

将由PyfjB替换ilvC原始启动子的重组菌株命名为YPV-097（PyfjB-ilvC整合菌株），由EP6替换ilvC原始启动子的重组菌株命名为YPV-098（EP6-ilvC整合菌株）。

YPV-097（PyfjB-ilvC整合菌株）是将高产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260ilvC原始启动子（SEQ ID No.18的第1-179位）替换为PyfjB，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌，其可以提高缬氨酸的产量；YPV-098（EP6-ilvC整合菌株）是将高产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260 ilvC原始启动子（SEQ ID No.18的第1-179位）替换为EP6，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌，EP6启动子作为突变的yfjB启动子，其启动ilvC的表达更能提高缬氨酸的产量。

PCR鉴定引物如下所示：

P33：5′-CCCGACTTTG TTACCCTTTC-3′（CEY17_RS06885基因内部）；

P34：5′-ACTGATCCCC ATAATAAGCG-3′（PyfjB内部）；

P35：5′-CGCTTATTAT GGGGATCAGT-3′（PyfjB内部）；

P36：5′-GGGTGGTTGT TGTAGGAAGC-3′（ilvC基因内部）。

二、缬氨酸发酵实验。

将上述菌株YPV-097、YPV-098和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以发酵培养基3和培养条件3进行发酵实验，发酵结束检测L-缬氨酸产量与OD值。每个菌株重复三次。

L-缬氨酸产量的检测方法为高效液相色谱法。

发酵培养基3：溶剂为水，溶质及其浓度分别为硫酸铵 14 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、磷酸氢二钾 1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、酵母粉 2 g/L、硫酸亚铁 18 mg/L、硫酸锰 4.2mg/L、生物素 0.02 mg/L、维生素B1 2 mg/L、antifoam（CB-442）消泡剂 0.5 mL/L、70%葡萄糖（底糖） 40 g/L。

培养条件3：

校正DO 100%，温度33 ℃、风量1 L/min、转速400rpm、罐压0.01Mpa，5 min后标定；

接种量3.5%；培养温度33 ℃；

pH7.0±0.05；溶氧DO10-20%；

初始条件：温度33℃、pH 7.0、罐压0 Mpa、风量0.1 L/min、转速400 rpm；

全程控制：温度33℃、pH 7.0、罐压0 Mpa、风量0.2 L/min、转速400 rpm；

残糖控制：F12h前0.1-0.2%；F12h后结合DO要求控制残糖≤0.02%；

培养成熟标准：OD₆₁₀ 30-35；OD₆₁₀＞30后停止通风静止2小时（根据批次实验目的，进行菌体分离或连续催化）；

流加物料：氨水、70%浓糖、5%泡敌；

发酵周期：18-20 h左右。

结果显示，谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的L-缬氨酸产量为84.1g/L，OD₆₁₀为98.2；YPV-097的L-缬氨酸产量为85.7g/L，显著高于菌株CGMCC No.21260（P<0.05），OD₆₁₀为99.2；YPV-098的L-缬氨酸产量为87.6g/L，显著高于菌株CGMCC No.21260（P<0.05），OD₆₁₀为100.3。由此表明，在缬氨酸生产菌CGMCC No.21260中以yfjB或者EP6启动子替换ilvC原始启动子可以增加缬氨酸的产量，并且作为突变过的EP6启动ilvC的表达，缬氨酸产量更高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京中科伊品生物科技有限公司

<120> 一种EP6启动子与其相关生物材料及应用

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 122

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli)

<400> 1

gaatttctccgcgtttttttcgcattcatctcgctaacttcgcttattatggggatcagt 60

ttcagggtttcaagggaagcactcacattgtcatcaatcttcgcaacaaggacctcggaa 120

aa 122

<210> 2

<211> 7894

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

tctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggctgttttggcggatgagagaagattttc 60

agcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggc 120

ggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagc 180

gccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaa 240

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<210> 11

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tctaagaatttcttcgcgttttttttgcatccatcttgttaacttcgcttattatgggga 840

tcagtttccgggtttcaagggaagcggacacattgtcactatttcatttaacgcagggac 900

ctccaaatcatggctattgaactgctttatgatgctgacgctgacctctccttgatccag 960

ggccgcaaggttgccatcgttggctacggctcccagggccacgcacactcccagaacctc 1020

cgcgattctggcgttgaggttgtcattggtctgcgcgagggctccaagtccgcagagaag 1080

gcaaaggaagcaggcttcgaggtcaagaccaccgctgaggctgcagcttgggctgacgtc 1140

atcatgctcctggctccagacacctcccaggcagaaatcttcaccaacgacatcgagcca 1200

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gttcgccgtcagttcgttgatggcaagggtgttccttgcctcatcgcagtcgaccaggac 1380

ccaaccggaaccgcacaggctctgaccctgtcctacgcagcagcaatcggtggcgcacgc 1440

gcaggcgttatcccaaccaccttcgaagctgagaccgtcaccgacctcttcggcgagcag 1500

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gctggctacgagccagagatggcatacttcgaggttcttcacgagctcaagctcatcgtt 1620

gacctcatgttcgaaggtggcatcagcaacatgaactactctgtttctgacaccgctgag 1680

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gacatcctgaccgatatccaggacggcaccttcaccaagcgcctcagggtaccgagctcg 1800

aattcgtaat catggtcata gctg 1824

<210> 21

<211> 901

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

cccgactttgttaccctttctgagggacttggctgtgttgccatccgcgtcaccaaagcg 60

gaggaagtactgccagccatccaaaaggctcgagagatcaacgaccgcccagtagtcatc 120

gacttcatcgtcggtgaagacgcacaggtatggccaatggtgtctgctggatcatccaac 180

tccgatatccagtacgcactcggattgcgcccattctttgatggtgatgaatctgcagca 240

gaagatcctgccgacattcacgaagccgtcagcgacattgatgccgccgttgaatcgacc 300

gaggcataaggagagacccaagatggctaattctgacgtcacccgccacatcctgtccgt 360

actcgttcaggacgtagacggaatcatttcccgcgtatcaggtatgttcacccgacgcgc 420

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agaatttctccgcgtttttttcgcattcatctcgctaacttcgcttattatggggatcag 900

t 901

<210> 22

<211> 901

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22

cccgactttgttaccctttctgagggacttggctgtgttgccatccgcgtcaccaaagcg 60

gaggaagtactgccagccatccaaaaggctcgagagatcaacgaccgcccagtagtcatc 120

gacttcatcgtcggtgaagacgcacaggtatggccaatggtgtctgctggatcatccaac 180

tccgatatccagtacgcactcggattgcgcccattctttgatggtgatgaatctgcagca 240

gaagatcctgccgacattcacgaagccgtcagcgacattgatgccgccgttgaatcgacc 300

gaggcataaggagagacccaagatggctaattctgacgtcacccgccacatcctgtccgt 360

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cccaggcaagctccgcgcactgcttgatgtgatggaaccattcggaatccgcgaactgat 780

ccaatccggacagattgcactcaaccgcggtccgaagaccatggctccggccaagatcta 840

agaatttcttcgcgttttttttgcatccatcttgttaacttcgcttattatggggatcag 900

t 901

<210> 23

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 23

cgcttattatggggatcagtttcagggtttcaagggaagcactcacattgtcatcaatct 60

tcgcaacaaggacctcggaaaaatggctattgaactgctttatgatgctgacgctgacct 120

ctccttgatccagggccgcaaggttgccatcgttggctacggctcccagggccacgcaca 180

ctcccagaacctccgcgattctggcgttgaggttgtcattggtctgcgcgagggctccaa 240

gtccgcagagaaggcaaaggaagcaggcttcgaggtcaagaccaccgctgaggctgcagc 300

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tcacttcgacctgatcaagccagctgacgacatcatcgttggcatggttgcgccaaaggg 480

cccaggccacttggttcgccgtcagttcgttgatggcaagggtgttccttgcctcatcgc 540

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cttcggcgagcaggctgttctctgcggtggcaccgaggaactggtcaaggttggcttcga 720

ggttctcaccgaagctggctacgagccagagatggcatacttcgaggttcttcacgagct 780

caagctcatcgttgacctcatgttcgaaggtggcatcagcaacatgaactactctgtttc 840

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gtcccgcatgaaggacatcctgaccgatatccaggacggcaccttcaccaagcgcctcat 960

cgcaaacgttgagaacggcaacaccgaacttgagggccttcgtgcttcctacaacaacca 1020

ccc 1023

<210> 24

<211> 1025

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 24

cgcttattatggggatcagtttccgggtttcaagggaagcggacacattgtcactatttc 60

atttaacgcagggacctccaaatcatggctattgaactgctttatgatgctgacgctgac 120

ctctccttgatccagggccgcaaggttgccatcgttggctacggctcccagggccacgca 180

cactcccagaacctccgcgattctggcgttgaggttgtcattggtctgcgcgagggctcc 240

aagtccgcagagaaggcaaaggaagcaggcttcgaggtcaagaccaccgctgaggctgca 300

gcttgggctgacgtcatcatgctcctggctccagacacctcccaggcagaaatcttcacc 360

aacgacatcgagccaaacctgaacgcaggcgacgcactgctgttcggccacggcctgaac 420

attcacttcgacctgatcaagccagctgacgacatcatcgttggcatggttgcgccaaag 480

ggcccaggccacttggttcgccgtcagttcgttgatggcaagggtgttccttgcctcatc 540

gcagtcgaccaggacccaaccggaaccgcacaggctctgaccctgtcctacgcagcagca 600

atcggtggcgcacgcgcaggcgttatcccaaccaccttcgaagctgagaccgtcaccgac 660

ctcttcggcgagcaggctgttctctgcggtggcaccgaggaactggtcaaggttggcttc 720

gaggttctcaccgaagctggctacgagccagagatggcatacttcgaggttcttcacgag 780

ctcaagctcatcgttgacctcatgttcgaaggtggcatcagcaacatgaactactctgtt 840

tctgacaccgctgagttcggtggctacctctccggcccacgcgtcatcgatgcagacacc 900

aagtcccgcatgaaggacatcctgaccgatatccaggacggcaccttcaccaagcgcctc 960

atcgcaaacgttgagaacggcaacaccgaacttgagggccttcgtgcttcctacaacaac 1020

caccc 1025

Claims

1.DNA分子，其序列为序列表中SEQ ID No.3。

2.与权利要求1所述DNA分子相关的生物材料，为下述B1）至B7）中的任一种：

B1）含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；

B2）含有权利要求1所述DNA分子的重组载体；

B3）含有B1）所述表达盒的重组载体；

B4）含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物；

B5）含有B1）所述表达盒的重组微生物；

B6）含有B2）所述重组载体的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物。

3.权利要求1所述DNA分子在作为启动子中的应用。

4.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述生物材料在生产氨基酸中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述氨基酸为赖氨酸、谷氨酸或缬氨酸。

6.一种生产氨基酸的方法，包括：将权利要求1所述DNA分子导入能合成目的氨基酸的生物细胞中，使权利要求1所述DNA分子驱动所述生物细胞中目的氨基酸合成途径中基因的表达，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到目的氨基酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为能合成目的氨基酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述细菌为谷氨酸棒杆菌。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述目的氨基酸为赖氨酸、谷氨酸或缬氨酸。