CN108350464A - 来自谷氨酸棒杆菌的启动子 - Google Patents

Abstract

提供了包含分离自谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的天然启动子，及源于其的突变启动子，所述启动子可用于调节，即增加或减少基因表达。还提供了包含多个具有递增启动子活性的启动子的启动子梯。还提供了包含所述启动子的宿主细胞和重组载体，及使用所述宿主细胞表达目标基因并产生生物分子的方法。

Description

来自谷氨酸棒杆菌的启动子

交叉引用

本申请要求2015年12月7日提交的美国临时专利申请第62/264,232号和2016年12月7日提交的美国临时专利申请第62/431,409号的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

作为文本文件提供的序列表以引用方式并入

序列表作为创建于2016年11月30日且大小为4,575字节的文本文件“ZMG-001-PCT_SL.txt”随函提供。该文本文件的内容以引用的方式整体并入本文。

背景

领域

本发明涉及包含分离自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的多核苷酸的天然启动子及源于其的突变启动子、包含所述启动子的宿主细胞和重组载体，及改变靶基因的表达和产生生物分子的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞。

相关技术说明

棒状细菌菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌，在生物分子如氨基酸、有机酸、维生素、核苷和核苷酸的生成中起着重要作用，并且正不断努力改进生产过程。所述过程可以就以下方面进行改进：发酵相关的措施例如搅拌和供氧，或营养培养基的组成例如发酵期间的糖浓度，或对产品形式的后处理，例如借助于离子交换色谱法，或微生物自身的固有性能特性。

性能特性可包括，例如，产量、滴度、生产率、副产物消除、过程偏移耐受性、最适生长温度和生长速率。改善微生物菌株性能的一种方式是增加控制代谢产物生成的基因的表达。增加基因的表达可以增加由该基因编码的酶的活性。增加酶活性可增加由该酶所属途径产生的代谢产物的合成速率。在一些情况下，增加代谢产物的生产速率可使其它细胞过程失去平衡并且抑制微生物培养物的生长。有时，使活性下调对于改善菌株性能很重要。例如，使流量重新定位远离副产物可以提高产量。因此，代谢途径中各个组分的表达水平同时微调往往是必要的。

启动子调节基因转录的速率并且可以各种方式影响转录。组成型启动子，例如，不管细胞内部或外部条件如何，指导其相关基因以恒定速率转录，而可调控启动子根据细胞内部和/或外部条件，例如生长速率、温度、对特定环境化学品的反应等来增加或降低基因转录的速率。启动子可从其正常细胞环境中分离并且经工程改造以调节几乎任何基因的表达，使得能够有效改变细胞生长、产物产量和/或其它目标表型。

显然需要比此前已经描述的更广泛分类的定义明确的棒杆菌类启动子。此类启动子在棒杆菌细胞内的基因的协调表达中将是有用的。例如，一批谷氨酸棒杆菌启动子将通过增强编码所需生物分子的生物合成途径的组分的基因表达来促进谷氨酸棒杆菌细胞内生物分子的工业化生产。本文描述的启动子有助于满足这些和其它需要。

发明概要

简言之，本公开涉及包含分离自谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的天然启动子及源于其的突变启动子，所述启动子可各自由短DNA序列(理想地小于100个碱基对)编码并且一起表示具有递增表达水平的组成型启动子梯。对于不同基因而言可能有利地在所述启动子的控制下表达。

本发明的一个实施方案涉及包含选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的序列的第一启动子多核苷酸。在一些实施方案中，第一启动子多核苷酸由选自：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的序列组成。本发明的一个实施方案涉及包含本文描述的至少两个第一启动子多核苷酸的启动子多核苷酸组合。本发明的一个实施方案涉及包含本文描述的至少一个第一启动子多核苷酸和至少一个第二启动子多核苷酸的启动子多核苷酸组合，第二启动子多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。本发明的一个实施方案涉及包含本文描述的至少一个第一启动子多核苷酸和至少一个第二启动子多核苷酸的启动子多核苷酸组合，第二启动子多核苷酸由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。

本发明的一个实施方案涉及包含本文描述的第一启动子多核苷酸的宿主细胞。本发明的一个实施方案涉及包含本文描述的第一启动子多核苷酸的重组载体。在一些实施方案中，第一启动子多核苷酸与第一靶基因功能性连接。本发明的一个实施方案涉及包含本文描述的启动子多核苷酸组合的宿主细胞。本发明的一个实施方案涉及包含本文描述的启动子多核苷酸组合的重组载体。在一些实施方案中，每个启动子多核苷酸与不同的靶基因功能性连接。在一些实施方案中，靶基因是相同代谢途径的一部分。在一些实施方案中，靶基因不是相同代谢途径的一部分。本发明的一个实施方案涉及经本文描述的重组载体转化的宿主细胞。

本发明的一个实施方案涉及包含至少一个与靶基因功能性连接的启动子多核苷酸的宿主细胞；其中所述启动子多核苷酸包含选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列；其中当启动子多核苷酸包含选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQID NO:8的序列时，靶基因不同于启动子多核苷酸的内源基因。在一些实施方案中，宿主细胞包含至少两个启动子多核苷酸，其中每个启动子多核苷酸与不同的靶基因功能性连接。本发明的一个实施方案涉及包含至少一个与靶基因功能性连接的启动子多核苷酸的重组载体，其中所述启动子多核苷酸包含选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列；其中当启动子多核苷酸包含选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的序列时，靶基因不同于启动子多核苷酸的内源基因。在一些实施方案中，重组载体包含至少两个启动子多核苷酸，其中每个启动子多核苷酸与不同的靶基因功能性连接。在一些实施方案中，靶基因是相同代谢途径的一部分。在一些实施方案中，靶基因不是相同代谢途径的一部分。本发明的一个实施方案涉及经本文描述的重组载体转化的宿主细胞。

本发明的一个实施方案涉及改变一个或多个靶基因的表达的方法，其包括培养本文描述的宿主细胞，其中对每个靶基因的改变独立地选自：上调和下调。靶基因优选编码生物分子的生物合成途径的一种或多种多肽或蛋白质，所述生物分子包括例如，氨基酸、有机酸、核酸、蛋白质和聚合物。

本发明的另一个实施方案涉及产生生物分子的方法，其包括在适于产生所述生物分子的条件下，培养本文描述的宿主细胞。在一些实施方案中靶基因与产生生物分子的生物合成途径相关，所述生物分子选自：氨基酸、有机酸、香精香料、生物燃料、蛋白质和酶、聚合物/单体和其它生物材料、脂质、核酸、小分子治疗剂、蛋白质或肽治疗剂、精细化学品和保健营养品。在优选实施方案中，生物分子为L-氨基酸。在特定实施方案中，L-氨基酸为赖氨酸。

在一些实施方案中，宿主细胞属于棒杆菌属(Corynebacterium)。在一些实施方案中，宿主细胞为谷氨酸棒杆菌。

附图简述

图1显示了对于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组中的每个基因而言5’UTR长度(x轴)相对于在两种生长条件下的表达比率(y轴)的图表。在两种生长条件下的表达比率介于0.33和3之间且5’UTR长度介于26和40个碱基对之间的基因用黑色圆圈表示。无法匹配两个标准的基因用灰色圆圈表示。

图2显示了在基于黄色荧光蛋白的测定中8个候选启动子(y轴)的标准化活性(x轴)的图表。每个候选启动子的每个生物复制用黑色圆圈表示。亲本质粒pK18rep充当阴性对照。

图3呈现了生物合成氨基酸L-赖氨酸的遗传和生化途径的图解。在生物合成途径中转换中间产物的基因(例如，pck、odx、icd和hom)加下划线。

图4呈现了经重组核酸分子转化的谷氨酸棒杆菌宿主细胞中L-赖氨酸生成的变化根据本说明书的示例性实施方案的结果的图表，所述重组核酸分子具有选自由SEQ ID NO:1至8组成的组，与来自谷氨酸棒杆菌的异源靶基因fbp、dapB、ptsG、lysA、pgi和ppc功能性连接的启动子多核苷酸序列。

图5呈现了经重组核酸分子转化的谷氨酸棒杆菌宿主细胞中L-赖氨酸生成的变化根据本说明书的示例性实施方案的结果的图表，所述重组核酸分子具有选自由SEQ ID NO:1至8组成的组，与来自谷氨酸棒杆菌的异源靶基因dapS、cg0931、DapB和lysA功能性连接的启动子多核苷酸序列。

具体实施方式

在以下描述中，阐述某些具体细节是为了提供对本公开各个实施方案的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可以实践本公开，无需这些细节。

除非上下文另有要求，否则在本说明书和权利要求书通篇，词“包含”及其变型应以开放、包容性意义来解释，即“包括但不限于”。

如本文中所用，术语“重组核酸分子”是指重组DNA分子或重组RNA分子。重组核酸分子是含有来自不同原始来源并且非天然附连在一起的连接核酸分子的任何核酸分子。重组RNA分子包括由重组DNA分子转录的RNA分子。具体而言，重组核酸分子包括含与异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1至8的启动子的核酸分子。

如本文中所用，术语“异源靶基因”是指在自然状态下(例如，在非基因修饰细胞中)不受特定基因组中与之可操作性连接的启动子控制的任何基因或编码序列。如本文所提供的，与非自然存在的启动子功能性连接的所有靶基因被视为“异源靶基因”。更具体地，因为SEQ ID NO:1、5和7的启动子多核苷酸序列在自然界中不存在，所以所有功能性连接的靶基因序列为“异源靶基因”序列。如本文中所用，异源靶基因可包括为操纵子的一部分的一个或多个靶基因。即，操纵子的内源性启动子经具有SEQ ID NO:1至8的核酸序列的启动子多核苷酸序列置换。如本文中所用，术语“启动子多核苷酸序列”是指具有如同相关SEQID NO中列举的序列的核酸。

本说明书全篇提到“一个实施方案”或“一实施方案”意指结合该实施方案描述的具体特征、结构或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”在本说明书全篇各处的出现不一定全部指同一实施方案。应认识到，为了清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以呈组合在单个实施方案中提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各个特征，也可以单独地或呈任何合适的子组合提供。

具有启动子活性的多核苷酸

经鉴定天然谷氨酸棒杆菌启动子满足以下两个条件：1)表示组成型启动子梯，即多个具有递增启动子活性水平的启动子；和2)由短DNA序列(理想地小于100个碱基对)编码。检查描述谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中的全局基因表达水平的公开数据集(Lee等人，Biotechnol Lett(2013)35:709-717)以鉴定在不同生长条件下组成型表达的基因。在两种生长条件下，即在添加和未添加过氧化氢的基本培养基中的恒化器生长，表达水平保持恒定(定义为介于0.33和3之间的表达比率)的基因满足第一个条件。检查描述谷氨酸棒杆菌ATCC 13032转录组的公开数据集(Pfeifer-Sancar等人，BMC Genomics 2013,14:888)以找出具有紧密启动子的基因，即由60个碱基对的核心启动子区和长度介于26和40个碱基对之间的5’非翻译区组成的那些。所述两个数据集交叉引用以鉴定满足两个条件的启动子。参见图1。鉴定了以下五个野生型启动子(表1)。

表1：在不同生长条件下表达和组成型表达水平增加的谷氨酸棒杆菌的启动子

菌株	SEQ ID NO	平均活性
			Pcg1860-eyfp	2	89243
Pcg0007-eyfp	3	44527
			Pcg0755-eyfp	4	43592
Pcg3381-eyfp	6	4723
			Pcg3121-eyfp	8	98

文献中未描述野生型启动子cg1860和cg3121。文献中也未描述野生型启动子cg0007-gyrB，然而，Neumann和(J Basic Microbiol.1997；37(1):53-69)描述了对大肠杆菌(E.coli)中gyrB基因表达的调控。野生型启动子cg0755是甲硫氨酸生物合成途径的已知部分(Suda等人，Appl Microbiol Biotechnol(2008)81:505-513；和Rey等人，Journal of Biotechnology 103(2003)51-65)。野生型启动子cg3381为tatA同系物。Kikuchi等人描述了棒杆菌中的tatA途径，Applied and Environmental Microbiology，2006年11月，第7183-7192页。选择强组成型启动子Pcg0007进行诱变。Pcg0007的预测-10元件(TAAGAT)中6个位置中有4个随机化产生更强和减弱的启动子变体(SEQ ID NO 1、5和7)。

因此，本发明的一个实施方案涉及包含分离自谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的天然启动子，及源于其的突变启动子，所述启动子一起表示具有递增启动子活性水平的组成型启动子梯。在一些实施方案中，谷氨酸棒杆菌启动子可由短DNA序列编码。在一些实施方案中，谷氨酸棒杆菌启动子可由小于100个碱基对的DNA序列编码。

本发明的一个实施方案涉及包含选自以下的序列的启动子多核苷酸：SEQ ID NO:1(Pcg0007_lib_39)、SEQ ID NO:2(Pcg1860)、SEQ ID NO:3(Pcg0007)、SEQ ID NO:4(Pcg0755)、SEQ ID NO:5(Pcg0007_lib_265)、SEQ ID NO:6(Pcg3381)、SEQ ID NO:7(Pcg0007_lib_119)或SEQ ID NO:8(Pcg3121)。在另一个实施方案中，本说明书提供并包括包含与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸。在一实施方案中，本说明书提供并包括与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸。在另一个实施方案中，本说明书提供并包括与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQID NO:3的启动子多核苷酸。在另一个实施方案中，本说明书提供并包括与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸。在另一个实施方案中，本说明书提供并包括与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸。在另一个实施方案中，本说明书提供并包括包含与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸。在另一个实施方案中，本说明书提供并包括与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸。在另一个实施方案中，本说明书提供并包括与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸。

如本文中所用，“启动子盒”是指包含与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ IDNO:1至8的启动子多核苷酸的多核苷酸序列。在本公开的某些实施方案中，“启动子盒”还可包括以下的一种或多种：接头多核苷酸、异源基因之后的转录终止子、异源基因起始密码子上游的核糖体结合位点及各自的组合。本发明的一个实施方案涉及由选自以下的序列组成的启动子多核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。在一实施方案中，本说明书提供并包括SEQ IDNO:1的启动子多核苷酸序列。在一实施方案中，本说明书提供并包括SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列。在一实施方案中，本说明书提供并包括SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列。如本文中所用，可通过引用描述启动子盒，启动子名称后面是与之功能性连接的异源靶基因的名称。例如，命名为Pcg1860，与编码葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶基因的基因zwf功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子称为Pcg1860-zwf。类似地，Pcg0007_39-lysA是与编码多肽二氨基庚二酸脱羧酶的靶基因lysA功能性连接的SEQ ID NO:1的0007_39启动子。

本发明的一个实施方案涉及本文描述的启动子多核苷酸的组合。在这个上下文中，术语“启动子多核苷酸的组合”是指可作为单独分离的序列、作为单独多核苷酸分子的组分或作为同一多核苷酸分子的组分及其组合存在的两个或更多个多核苷酸。多核苷酸分子的实例包括染色体和质粒。

本发明还涉及分离的启动子多核苷酸，其基本上由具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中描绘的核苷酸序列的多核苷酸组成。在一实施方案中，本说明书提供并包括SEQ ID NO:1的分离的启动子多核苷酸。在一实施方案中，本说明书提供并包括SEQ ID NO:5的分离的启动子多核苷酸。在一实施方案中，本说明书提供并包括SEQ ID NO:7的分离的启动子多核苷酸。

在这个上下文中，术语“基本上”意指长度不超过1,000个、不超过800个、不超过700个、不超过600个、不超过500或不超过400个核苷酸的多核苷酸，和长度不超过15,000个、不超过10,000个、不超过7,500个、不超过5,000个、不超过2,500个、不超过1,000个、不超过800个、不超过700个、不超过600个、不超过500或不超过400个核苷酸的多核苷酸已经分别添加到SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸的5’末端和3’末端。

来自分别添加到SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸的5’末端和3’末端的前述两个多核苷酸列表的特征的任何有用组合，都是依据这里的发明。“有用组合”意指，例如，导致实现有效重组的特征组合。在要置换的DNA区域侧面使用相同长度的添加利于在实验程序中通过同源重组转移该区域。相对较长的侧翼同源区域对于环状DNA分子间的有效重组有利，但增加侧翼序列的长度使得置换型载体的克隆更加困难(Wang等人，MolecularBiotechnology,432:43-53(2006))。本说明书提供并包括在与至少一个异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列(例如，“启动子盒”)侧翼以指导靶基因序列的同源重组和置换的同源区域。在一实施方案中，同源区域是正向重复区域。在一实施方案中，同源区域包含在启动子盒侧翼的各介于500个碱基对(bp)和5000bp之间的靶基因序列。在一实施方案中，同源区域包含在启动子盒侧翼的各至少500bp的靶基因序列。在一实施方案中，同源区域包含在启动子盒侧翼的各至少1000bp(1Kb)的靶基因序列。在一实施方案中，同源区域包含在启动子盒侧翼的各至少2Kb的靶基因序列。在一实施方案中，同源区域包含在启动子盒侧翼的各至少5Kb的靶基因序列。

此外本发明涉及一种分离的启动子多核苷酸，其由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中描绘的核苷酸序列组成。在一实施方案中，分离的启动子多核苷酸由SEQ ID NO:1的多核苷酸序列组成。在一实施方案中，分离的启动子多核苷酸由SEQ ID NO:5的多核苷酸序列组成。在一实施方案中，分离的启动子多核苷酸由SEQ ID NO:7的多核苷酸序列组成。

关于生物如微生物中存在的多核苷酸的生物化学性质和化学结构的详情，例如，尤其可在Berg等人所著的教科书“Biochemie”[Biochemistry]中找到(SpektrumAkademischer Verlag Heidelberg Berlin,Germany,2003；ISBN 3-8274-1303-6)。

由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的脱氧核糖核苷酸单体组成的多核苷酸称为脱氧核糖多核苷酸或脱氧核糖核酸(DNA)。由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的核糖核苷酸单体组成的多核苷酸称为核糖多核苷酸或核糖核酸(RNA)。所述多核苷酸中的单体通过3’,5’-磷酸二酯键相互共价连接。

“启动子多核苷酸”或“启动子”或“具有启动子活性的多核苷酸”意指多核苷酸，优选脱氧核糖多核苷酸或核酸，优选脱氧核糖核酸(DNA)，在与要转录的多核苷酸功能性连接时其确定了编码多核苷酸的转录起始点和频率，从而使得受控多核苷酸的表达强度会受影响。如本文中所用的术语“启动子梯”是指多个具有递增启动子活性水平的启动子。如本文中所用的术语“启动子活性”是指启动子引发多核苷酸序列转录为mRNA的能力。评估启动子活性的方法是本领域技术人员公知的并且包括，例如下面实施例2中描述的方法。如本文中所用的术语“组成型启动子”是指不管细胞内部或外部条件如何，指导其相关基因以恒定速率转录的启动子。

由于DNA的双链结构，与序列表的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的链互补的链同样是本发明的主题。

试剂盒

本发明的一个实施方案涉及包含第一启动子多核苷酸和多核苷酸的合适储存装置的试剂盒，第一启动子多核苷酸包含选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的序列。在一些实施方案中，第一启动子多核苷酸由选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQID NO:7的序列组成。在一些实施方案中，试剂盒包含含至少两个本文描述的第一启动子多核苷酸的启动子多核苷酸的组合。在一些实施方案中，试剂盒包含含至少一个本文描述的第一启动子多核苷酸和至少一个第二启动子多核苷酸的启动子多核苷酸的组合，第二启动子多核苷酸包含选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:8的序列。在一些实施方案中，试剂盒包含含至少一个本文描述的第一启动子多核苷酸和至少一个第二启动子多核苷酸的启动子多核苷酸的组合，第二启动子多核苷酸由选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的序列组成。

靶基因

本发明的一个实施方案涉及表达靶基因的方法，其包括培养经包含本文所描述的启动子多核苷酸的重组载体转化的宿主细胞。靶基因是其表达受本文描述的启动子控制的多核苷酸。靶基因可以是编码一种或多种多肽的编码多核苷酸或非编码多核苷酸如非编码RNA。编码蛋白质/多肽的多核苷酸基本上由以下组成：选自由ATG、GTG和TTG组成的组，优选为ATG或GTG，特别优选为ATG的起始密码子，蛋白质编码序列和选自由TAA、TAG和TGA组成的组的一个或多个终止密码子。

“转录”意指从DNA模板开始产生互补RNA分子的过程。该过程涉及蛋白质如RNA聚合酶、“σ因子”和转录调控蛋白。靶基因为编码多核苷酸时，合成的RNA(信使RNA，mRNA)在随后产生多肽或蛋白质的翻译过程中用作模板。

在这个上下文中“功能性连接”意指根据本发明的启动子多核苷酸与另一寡核苷酸或多核苷酸依序排列，引起所述另一多核苷酸转录以产生有义RNA转录产物。

如果另一多核苷酸是编码多肽/蛋白质并且由多肽的编码区组成的靶基因，以起始密码子开始，包括终止密码子并且在适当情况下，包括转录终止序列，则“功能性连接”意指根据本发明的启动子多核苷酸与靶基因依序排列，引起所述靶基因的转录和合成的RNA的翻译。

如果靶基因编码多种蛋白质/多肽，则每个基因前面可为核糖体结合位点。在适当情况下，终止序列位于最后一个基因的下游。

靶基因优选编码生物分子的生物合成途径的一种或多种多肽或蛋白质，生物分子优选选自由蛋白氨基酸、非蛋白氨基酸、维生素、核苷、核苷酸和有机酸组成的组。靶基因优选由据此通过引用并入的EP 1 108 790A2的表1所列的一个或多个多核苷酸组成。

本说明书提供并包括包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子，所述启动子多核苷酸序列与京都基因与基因组百科全书(KEGG)中可鉴定为代谢和生物合成途径中所涉及的基因的任一异源靶基因功能性连接。KEGG数据库在互联网genome.jp/kegg上可用。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与KEGG图号00300所示的赖氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，所述一个或多个靶基因选自赖氨酸琥珀酰-DAP生物合成途径，M00016。在一实施方案中，所述一个或多个靶基因选自赖氨酸乙酰-DAP生物合成途径，M00525。在一实施方案中，所述一个或多个靶基因选自赖氨酸DAP脱氢酶生物合成途径，M00526。在一实施方案中，所述一个或多个靶基因选自赖氨酸DAP转氨酶生物合成途径，M00527。在一实施方案中，所述一个或多个靶基因选自AAA途径生物合成途径，M00030。在一实施方案中，所述一个或多个靶基因选自从2-酮戊二酸的赖氨酸生物合成途径M00433或LysW介导的赖氨酸生物合成途径M00031。

本公开提供并包括，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含条目M00020的基因的丝氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ IDNO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00018的基因的苏氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00021的基因的半胱氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00338的基因的半胱氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00609的基因的半胱氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00017的基因的甲硫氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00019的基因的缬氨酸/异亮氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00535的基因的异亮氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00570的基因的异亮氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00432的基因的亮氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00015的基因的脯氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00028的基因的鸟氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00763的基因的鸟氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00026的基因的组氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00022的基因的莽草酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ IDNO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00023的基因的色氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00024的基因的苯丙氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00025的基因的酪氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1至8的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00040的基因的酪氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。

本公开提供并包括，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含条目M00020的基因的丝氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ IDNO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00018的基因的苏氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00021的基因的半胱氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00338的基因的半胱氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ IDNO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00609的基因的半胱氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00017的基因的甲硫氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00019的基因的缬氨酸/异亮氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00535的基因的异亮氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00570的基因的异亮氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00432的基因的亮氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00015的基因的脯氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00028的基因的鸟氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00763的基因的鸟氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00026的基因的组氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00022的基因的莽草酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00023的基因的色氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00024的基因的苯丙氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00025的基因的酪氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。在一实施方案中，SEQ ID NO:1、5或7的启动子多核苷酸序列与包含KEGG条目M00040的基因的酪氨酸生物合成途径的一个或多个靶基因功能性连接。

本说明书提供并包括包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组，与表2提供的来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或其任何谷氨酸棒杆菌等效物的任一异源靶基因功能性连接的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。序列起始和终止位置对应于基因组核苷酸登记号NC_003450.3。本领域的普通技术人员将理解，相应基因存在于谷氨酸棒杆菌的其它菌株中并且可从表2中容易地鉴定。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:6的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组核酸分子。

表2：根据本说明书来自谷氨酸棒杆菌的靶基因

在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:6的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组载体。

在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:6的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表2列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。如本文中所用，宿主细胞是指下面在标题为‘表达’的部分中描述的已经用一个或多个启动子盒转化的生物。正如对本领域技术人员显而易见的，宿主细胞可包含如本文所描述的一个或多个启动子盒。

在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:6的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。如本文中所用，宿主细胞是指下面在标题为‘表达’的部分中描述的已经用一个或多个启动子盒转化的生物。正如对本领域技术人员显而易见的，宿主细胞可包含如本文所描述的一个或多个启动子盒。

表3：谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸生物合成途径

在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:6的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组载体。

在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:6的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表3列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。如本文中所用，宿主细胞是指下面在标题为‘表达’的部分中描述的已经用一个或多个启动子盒转化的生物。正如对本领域技术人员显而易见的，宿主细胞可包含如本文所描述的一个或多个启动子盒。

本说明书提供经包含启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞，所述启动子多核苷酸序列选自由SEQ ID NO:1至8组成的组，与表4中提供的来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032或其谷氨酸棒杆菌等效物的任一异源靶基因功能性连接。序列起始和终止位置对应于基因组核苷酸登记号NC_003450.3。本领域的普通技术人员将理解，相应基因存在于谷氨酸棒杆菌的其它菌株中并且可从表4中容易地鉴定。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ IDNO:6的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。如本文中所用，宿主细胞是指下面在标题为‘表达’的部分中描述的已经用一个或多个启动子盒转化的生物。正如对本领域技术人员显而易见的，宿主细胞可包含如本文所描述的一个或多个启动子盒。

表4：谷氨酸棒杆菌L-甲硫氨酸生物合成途径

在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:6的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组载体。在一实施方案中，本说明书提供并包括包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组载体。

在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:2的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:3的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:5的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:6的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:7的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。在一实施方案中，本说明书提供并包括经包含与表4列举的异源靶基因功能性连接的SEQ ID NO:8的启动子多核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞。

在一些实施方案中靶基因与产生生物分子的生物合成途径相关，所述生物分子选自：氨基酸、有机酸、香精香料、生物燃料、蛋白质和酶、聚合物/单体和其它生物材料、脂质、核酸、小分子治疗剂、蛋白质治疗剂、精细化学品和保健营养品。

在一些实施方案中靶基因与产生次级代谢产物的生物合成途径相关，所述次级代谢产物选自：抗生素、生物碱、萜类和聚酮。在一些实施方案中靶基因与产生初级代谢产物的代谢途径相关，所述初级代谢产物选自：醇、氨基酸、核苷酸、抗氧化剂、有机酸、多元醇、维生素和脂质/脂肪酸。在一些实施方案中靶基因与产生大分子的生物合成途径相关，所述大分子选自：蛋白质、核酸和聚合物。

另外对于产生L-氨基酸可能有利的是增强，尤其是过表达各个生物合成途径的一种或多种酶，糖酵解、补复作用、柠檬酸循环、戊糖磷酸循环、氨基酸输出和任选调控蛋白。

因此例如，对于产生L-氨基酸，可能有利的是增强，尤其是过表达选自下组的一个或多个基因：编码二氢吡啶二羧酸合酶(EP-B 0 197 335)的基因dapA；编码烯醇酶(DE:19947791.4)的基因eno；编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因gap(Eikmanns(1992),Journalof Bacteriology 174:6076-6086)；编码磷酸丙糖异构酶的基因tpi(Eikmanns(1992),Journal of Bacteriology 174:6076-6086)；编码3-磷酸甘油酸激酶的基因pgk(Eikmanns(1992),Journal of Bacteriology 174:6076-6086)；编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf(JP-A-09224661)；编码丙酮酸羧化酶的基因pyc(DE-A-198 31 609；Eikmanns(1992),Journal of Bacteriology 174:6076–6086)；编码苹果酸-醌-氧化还原酶的基因mqo(Molenaar等人，European Journal of Biochemistry 254,395-403(1998))；编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶的基因lysC(登记号P26512)；编码赖氨酸输出(DE-A-195 48 222)的基因lysE；编码高丝氨酸脱氢酶(EP-A 0131171)的基因hom；编码苏氨酸脱水酶的基因ilvA(等人，Journal of Bacteriology(1992)8065-8072))或编码抗反馈抑制的苏氨酸脱水酶的等位基因ilvA(Fbr)(等人，(1994)Molecular Microbiology 13:833-842)；编码乙酰羟酸合酶的基因ilvBN(EP-B 0356739)；编码二羟酸脱水酶的基因ilvD(Sahm和Eggeling(1999)Applied and Environmental Microbiology 65:1973-1979)；及编码Zwa1蛋白(DE:19959328.0,DSM 13115)的基因zwa1。

此外，对于产生L-氨基酸还可能有利的是减弱，尤其是减少选自下组的一个或多个基因的表达：编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因pck(DE 199 50 409.1；DSM 13047)；编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因pgi(美国专利第6,586,214号；DSM 12969)；编码丙酮酸氧化酶的基因poxB(DE:1995 1975.7；DSM 13114)；及编码Zwa2蛋白的基因zwa2(DE:19959327.2，DSM 13113)。

另外，对于产生氨基酸尤其是L-赖氨酸，还可能有利的是消除不良副反应(Nakayama:“Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms”,in:Overproduction of Microbial Products,Krumphanzl,Sikyta,Vanek(eds.),AcademicPress,London,UK,1982)。

因此根据本发明的启动子可用于在谷氨酸棒杆菌中过表达或低表达靶基因的每种情况。

接头

靶基因位于根据本发明的启动子多核苷酸下游，即3’末端，使得两个多核苷酸直接或借助于接头寡核苷酸或接头多核苷酸相互功能性连接。优选启动子和靶基因借助于接头寡核苷酸或接头多核苷酸相互功能性连接。所述接头寡核苷酸或接头多核苷酸由脱氧核糖核苷酸组成。

在这个上下文中，表达“直接相互功能性连接”意指SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的3’末端的核苷酸与靶基因起始密码子的第一个核苷酸直接连接。这样产生直接以5’-端AUG起始密码子开始的“无前导”mRNA并且因此没有任何其它翻译起始信号。

在这个上下文中，表达“借助于接头寡核苷酸相互功能性连接”意指SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQID NO:8的3’末端的核苷酸通过长度为1、2、3、4或5个核苷酸的寡核苷酸与靶基因起始密码子的第一个核苷酸连接。

在这个上下文中，表达“借助于接头多核苷酸相互功能性连接”意指SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQID NO:8的3’末端的核苷酸通过长度为6个至不超过600个核苷酸的多核苷酸与靶基因起始密码子的第一个核苷酸连接。

在这个上下文中，表达“相互功能性连接”意指靶基因以确保靶基因转录和合成的RNA翻译的方式与根据本发明的启动子多核苷酸结合。

根据技术要求，接头多核苷酸长度为：

6-600、6-500、6-400、6-300、6-200、6-180、6-160、6-140、6-120、6-100、6-80、6-60、6-50、6-40、6-30、6-28、6-27、6-26、6-25；或

8-600、8-500、8-400、8-300、8-200、8-180、8-160、8-140、8-120、8-100、8-80、8-60、8-50、8-40、8-30、8-28、8-27、8-26、8-25；或

10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-180、10-160、10-140、10-120、10-100、10-80、10-60、10-50、10-40、10-30、10-28、10-27、10-26、10-25；或

12-600、12-500、12-400、12-300、12-200、12-180、12-160、12-140、12-120、12-100、12-80、12-60、12-50、12-40、12-30、12-28、12-27、12-26、12-25；或

14-600、14-500、14-400、14-300、14-200、14-180、14-160、14-140、14-120、14-100、14-80、14-60、14-50、14-40、14-30、14-28、14-27、14-26、14-20；或

16-600、16-500、16-400、16-300、16-200、16-180、16-160、16-140、16-120、16-100、16-80、16-60、16-50、16-40、16-30、16-28、16-27、16-26、16-25；或

18-600、18-500、18-400、18-300、18-200、18-180、18-160、18-140、18-120、18-100、18-80、18-60、18-50、18-40、18-30、18-28、18-27、18-26、18-25；或

20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-180、20-160、20-140、20-120、20-100、20-80、20-60、20-50、20-40、20-30、20-28、20-27、20-26、20-25个核苷酸。

在特别优选的实施方案中，接头多核苷酸长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，因为这样产生优选的功能构建体。

因此本发明还涉及一种分离的启动子多核苷酸，其基本上由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸组成，其经由在其3’末端的核苷酸，直接或借助于确保RNA翻译的接头多核苷酸与在其5’末端含有ATG或GTG起始密码子并且编码一种或多种多肽的靶基因功能性连接。优选启动子和靶基因借助于接头多核苷酸相互功能性连接。

此外本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其基本上由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸组成，其经由在其3’末端的核苷酸与接头多核苷酸功能性连接。

另外，本发明还涉及一种分离的多核苷酸，基本上由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸组成，其经由在其3’末端的核苷酸与确保RNA翻译的接头多核苷酸功能性连接。

在这个上下文中，术语“基本上”意指已经向SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸的5’末端添加了长度不超过1,000个、不超过800个、不超过700个、不超过600个、不超过500个或不超过400个核苷酸的多核苷酸并且已经向靶基因的3’添加了长度不超过1,000个、不超过800个、不超过700个、不超过600个、不超过500个或不超过400个核苷酸的多核苷酸，或已经向接头寡核苷酸或多核苷酸的3’末端添加了长度不超过15,000个、不超过10,000个、不超过7,500个、不超过5,000个、不超过2,500个、不超过1,000个、不超过800个、不超过700个、不超过600个、不超过500个或不超过400个核苷酸的多核苷酸。

来自前述三个多核苷酸列表的特征的任何有用组合都依据这里的发明。“有用的组合”意指，例如，导致实现有效组合的特征组合。在要置换的DNA区域侧翼使用相同长度的添加利于在实验程序中通过同源重组转移该区域。相对较长的侧翼同源区域对于环状DNA分子间的有效重组有利，但增加侧翼序列的长度使得置换型载体的克隆更加困难(Wang等人，Molecular Biotechnology 32:43-53(2006))。

另外，当3’末端与在其5’末端含有ATG或GTG起始密码子并且编码一种或多种多肽的靶基因功能性连接时，接头寡核苷酸或多核苷酸3’末端的侧翼序列长度增加到不超过15,000个核苷酸。

接头多核苷酸的这些特别优选的实施方案确保RNA以有利方式翻译。

为促进根据本发明的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列的多核苷酸，确保RNA翻译的接头多核苷酸和编码一种或多种多肽，在其5’末端含有ATG或GTG起始密码子的靶基因之间的化学连接，可将克隆所需的功能性核苷酸序列并入到所述多核苷酸的5’和3’末端并且即使在所述克隆之后也至少部分保留。

术语“克隆所需的功能性核苷酸序列”在这里表示存在的其序列通常由4至8个核苷酸组成的任何REII(II型限制性内切核酸酶)裂解位点。

另外，这里应当提到借助于诱变引物或基因从头合成(例如通过GENEART AG(Regensburg,Germany))定点诱变核苷酸序列以去除限制性内切核酸酶的裂解位点，可以向序列中引入沉默突变以便使得所述裂解位点有利地用于后续克隆步骤。

由根据本发明的启动子与确保RNA翻译的接头多核苷酸功能性连接产生的多核苷酸下文也称为表达单元。

表达

此外本发明涉及根据本发明的启动子或根据本发明的表达单元用于在微生物中表达靶基因或多核苷酸的用途。根据本发明的启动子或根据本发明的表达单元确保合成的RNA(优选mRNA)转录并翻译成多肽。如本文中所用，术语“宿主细胞”是指微生物的经转化的细胞。

本公开提供并包括包含上文详细描述的重组核酸和重组载体的经转化的宿主细胞。本公开还提供并包括经两种重组核酸转化的宿主细胞。在一实施方案中，宿主细胞经三种重组核酸转化。如以上所提供的，核酸可基于对所需产物产量的总体影响从生物合成途径选择。对可以并入本说明书的宿主细胞内的重组核酸的数量没有实际限制。优选在棒杆菌属微生物中进行表达。优选基于以下种类的棒杆菌属的菌株：有效棒杆菌(C.efficiens)，保存的模式菌株为DSM44549；谷氨酸棒杆菌，保存的模式菌株为ATCC13032；和产氨棒杆菌(C.ammoniagenes)，保存的模式菌株为ATCC6871。特别优选谷氨酸棒杆菌类。这样可能表达编码具有在相应宿主中不存在或不可检测到的性质(优选酶活性)的多肽的多核苷酸。因此，例如，Yukawa等人描述了大肠杆菌基因的表达以利用谷氨酸棒杆菌R中受组成型Ptrc启动子控制的D-木糖(Applied Microbiology andBiotechnology 81,691-699(2008))。

本说明书提供并包括生物合成途径的两个或更多个基因受以上描述的启动子多核苷酸控制的谷氨酸棒杆菌。在各个实施方案中，一个或多个靶基因处于具有如上所述的SEQ ID NO:1至8的序列的启动子多核苷酸序列的控制之下。在其它实施方案中，一个或多个靶基因处于具有如上所述的SEQ ID NO:1、5或7的序列的启动子多核苷酸序列的控制之下。

在根据本说明书的某些实施方案中，谷氨酸棒杆菌宿主细胞有两个靶基因受具有SEQ ID NO:1至8的序列的启动子控制。在根据本说明书的某些其它实施方案中，谷氨酸棒杆菌宿主细胞有两个靶基因受具有SEQ ID NO:1、5或7的序列的启动子控制。使用同源重组，本公开的启动子置换内源性启动子和内源性序列以制备与异源基因功能性连接的启动子。本领域的普通技术人员将认识到，重组导致内源性启动子的置换，而将基因保持在其天然基因座上。下面在表8中说明了具体的非限制性实例。多个启动子-异源靶标对(例如，启动子盒)可以容易地并入到宿主细胞的基因组中。在一实施方案中，启动子盒可以依序并入到宿主细胞中。在某些实施方案中，本公开的重组载体在单一构建体中提供了两个或更多个不同的启动子。本说明书对可以使用描述的方法开发的启动子置换的数量未提供实际限制。

在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007-lysA和Pcg3121-pgi的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-pyc和Pcg0007-zwf的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007-lysA和Pcg0007-zwf的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3121-pck和Pcg0007-zwf的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_39-ppc和Pcg0007-zwf的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3121-pck和Pcg3121-pgi的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-ddh和Pcg0007-zwf的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_265-dapB和Pcg0007-zwf的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007-zwf和Pcg3121-pgi的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-ddh和Pcg3121-pgi的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3121-pgi和Pcg1860-pyc的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-pyc和Pcg0007_265-dapB的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-pyc和Pcg0007-lysA的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-asd和Pcg0007-zwf的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_265-dapB和Pcg3121-pgi的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-pyc和Pcg1860-asd的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-aspB和Pcg1860-pyc的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-fbp和Pcg1860-pyc的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-ddh和Pcg3381-fbp的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0755-ptsG和Pcg3121-pgi的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-pyc和Pcg3121-pck的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-asd和Pcg3121-pgi的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-asd和Pcg3381-fbp的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_39-lysE和Pcg3381-fbp的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-fbp和Pcg0007-lysA的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_39-lysE和Pcg1860-pyc的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3121-pgi和Pcg3381-fbp的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3121-pck和Pcg0007-lysA的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007-lysA和Pcg0007_265-dapB的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_265-dapB和Pcg1860-asd的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3121-pgi和Pcg0007_265-dapD的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007-lysA和Pcg3381-ddh的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3121-pck和Pcg1860-asd的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007-lysA和Pcg1860-asd的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3121-pck和Pcg0007_265-dapB的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-ddh和Pcg1860-asd的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_39-ppc和Pcg1860-asd的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_39-ppc和Pcg0007-lysA的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-ddh和Pcg0007_265-dapB的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_265-dapB和Pcg3381-fbp的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_39-ppc和Pcg0007_265-dapB的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-aspB和Pcg3121-pck的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_265-dapB和Pcg0007_265-dapD的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_39-lysE和Pcg3381-aspB的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007_39-lysE和Pcg0007_265-dapD的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-aspB和Pcg0007_265-dapB的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg1860-asd和Pcg0007_265-dapD的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-aspB和Pcg0007-lysA的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg3381-aspB和Pcg3381-ddh的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0755-ptsG和Pcg1860-pyc的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0755-ptsG和Pcg3381-fbp的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0007-zwf和Pcg3381-fbp的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。在一实施方案中宿主细胞是包含启动子盒Pcg0755-ptsG和Pcg0007_265-dapD的转基因谷氨酸棒杆菌宿主细胞。

本公开提供并包括具有三个或更多个如上所述的启动子盒的宿主细胞。在一实施方案中，宿主细胞包括Pcg0007_39-zwf、Pcg0007_39-lysA和Pcg1860-pyc启动子盒。在一实施方案中，宿主细胞为谷氨酸棒杆菌宿主细胞。

根据本发明的启动子或根据本发明的表达单元此外用于改善微生物的性能特性，性能特性可包括，例如，产量、滴度、生产率、副产物消除、过程偏移耐受性、最适生长温度和生长速率。在一些实施方案中，根据本发明的启动子或根据本发明的表达单元用于上调微生物中的靶基因(过表达)。过表达通常意指相比于原始菌株(亲本菌株)或野生型菌株(若后者为原始菌株)，核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的细胞内浓度或活性增加。在一些实施方案中，根据本发明的启动子或根据本发明的表达单元用于下调微生物中的靶基因(低表达)。低表达通常意指相比于原始菌株(亲本菌株)或野生型菌株(若后者为原始菌株)，核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的细胞内浓度或活性降低。在一些实施方案中，根据本发明的启动子和/或表达单元的组合用于调节微生物中一个以上靶基因的表达，其中每个靶基因被上调或下调。在一些实施方案中，受启动子和/或表达单元的组合上调或下调的靶基因是相同代谢途径的一部分。在一些实施方案中，受启动子和/或表达单元的组合上调或下调的靶基因不是相同代谢途径的一部分。

本文描述的启动子可与本领域众所周知的其它方法组合使用，用于减弱(降低或消除)微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性，例如通过使用弱启动子或使用编码具有低活性的相应酶，或使相应基因或酶(蛋白质)失活的基因或等位基因，及任选地组合这些措施。

基因表达的减少可通过合适的培养或通过基因表达信号结构的基因修饰(突变)而发生。基因表达的信号结构是，例如，阻遏基因、活化基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。专家可以找到关于此的信息，例如在专利申请WO 96/15246中，在Boyd和Murphy(Journal of Bacteriology 170:5949(1988))中，在Voskuil和Chambliss(Nucleic Acids Research 26:3548(1998)中，在Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58:191(1998))中，在Patek等人(Microbiology142:1297(1996))，等人(Journal of Bacteriology 181:6188(1999))及在已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers编著的教科书(“Molekulare Genetik[Molecular Genetics]”，第6版，Georg Thieme Verlag,Stuttgart,Germany,1995)或Winnacker编著的教科书(“Gene und Klone[Genes and Clones]”,VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)。

导致酶蛋白的催化性质变化或降低的突变从现有技术中已知，可能提到的实例是Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 272:8611–8617(1997))，Sugimoto等人(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61:1760-1762(1997))和的著作(“Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum:Aufhebung derallosterischen Regulation und Struktur des Enzyms[Threonine dehydratase fromCorynebacterium glutamicum:Cancelling the allosteric regulation and structureof the enzyme]”,Reports from the Jülich Research Centre,Jül-2906,ISSN09442952,Jülich,Germany,1994)。在已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Hagemann编著的教科书中找到综合性描述(“Allgemeine Genetik[General Genetics]”,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)。

可能的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸交换对酶活性的影响，称为错义突变或无义突变。基因中至少一个碱基对的插入或缺失导致移码突变，因而并入了不正确的氨基酸或翻译过早中断。几个密码子的缺失通常导致酶活性完全丧失。关于产生此类突变的说明是现有技术并且可在已知的遗传学和分子生物学教科书中找到，例如Knippers编著的教科书(“Molekulare Genetik[Molecular Genetics]”，第6版，Georg ThiemeVerlag,Stuttgart,Germany,1995)，Winnacker编著的教科书(“Gene und Klone[Genesand Clones]”,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)或Hagemann编著的教科书(“Allgemeine Genetik[General Genetics]”,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)。使谷氨酸棒杆菌的基因突变的常用方法是Schwarzer和Pühler描述的基因破坏和基因置换方法(Bio/Technology 9,84-87(1991))。

在基因破坏法中在可以在宿主(通常为大肠杆菌)中而不是在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体中克隆目标基因编码区的中心部分。可能的载体为，例如，pSUP301(Simon等人，Bio/Technology 1,784–791(1983))、pK18mob或pK19mob(等人，Gene 145,69–73(1994))、pK18mobsacB或pK19mobsacB(等人，Journal of Bacteriology 174:5462–65(1992))、pGEM-T(Promega corporation,Madison,Wis.,USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman(1994).Journal of Biological Chemistry 269:32678–84；美国专利第5,487,993号)、Blunt(Invitrogen,Groningen,Holland；Bernard等人，Journal ofMolecular Biology,234:534–541(1993))或pEM1(Schrumpf等人，1991,Journal ofBacteriology 173:4510–4516)。然后通过偶联或转化将含有基因编码区的中心部分的质粒载体转移到所需谷氨酸棒杆菌菌株中。例如，等人描述了偶联法(Applied andEnvironmental Microbiology 60,756–759(1994))。例如，Thierbach等人(AppliedMicrobiology and Biotechnology 29,356–362(1988))，Dunican和Shivnan(Bio/Technology 7,1067–1070(1989))及Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123,343–347(1994))描述了转化法。借助于“交叉”事件同源重组后，所讨论的基因的编码区被载体序列中断并获得两个不完整的等位基因，一个缺少3’末端而一个缺少5’末端。这种方法已经被例如Fitzpatrick等人(Applied Microbiology and Biotechnology 42,575–580(1994))用于消除谷氨酸棒杆菌的recA基因。

在基因置换法中，在体外于目标基因内建立突变，例如缺失、插入或碱基交换。制备的等位基因转而在对于谷氨酸棒杆菌而言并非复制型的载体内克隆，然后通过转化或偶联将这转移到所需的谷氨酸棒杆菌宿主中。借助于实现整合的“交叉”事件和在靶基因或靶序列内实现切除的合适的第二“交叉”事件同源重组后，实现了等位基因突变的并入。例如Peters-Wendisch(Microbiology 144,915-927(1998))利用这种方法以通过缺失消除谷氨酸棒杆菌的pyc基因。

本文描述的启动子可与本领域众所周知的其它方法组合使用，以提高(增强)微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性，例如通过增加所述一个或多个基因的拷贝数，使用强启动子，或使用编码具有高活性的相应酶的基因，及任选组合这些措施。

为了实现过表达，可增加相应基因的拷贝数，或可选地使位于结构基因上游的启动子和调控区或核糖体结合位点突变。并入结构基因上游的表达盒以相同方式作用。借助于诱导型启动子，另外可能增加在酶促氨基酸生成过程中的表达。类似地通过旨在延长m-RNA寿命的措施提高表达。此外，还通过防止酶蛋白降解来增强酶活性。基因或基因构建体可存在于具有不同拷贝数的质粒中，或者可在染色体中整合并扩增。可选地，此外可通过改变培养基的组成和培养条件来实现相关基因的过表达。

本领域的技术人员可以找到关于上述内容的详情，尤其是在Martin等人(Bio/Technology 5,137-146(1987))中，在Guerrero等人(Gene 138,35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))中，在Eikmanns等人(Gene 102,93-98(1991))中，在European Patent Specification 0 472 869中，在美国专利第4,601,893号中，在Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9,84-87(1991)中，在Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60,126-132(1994))中，在LaBarre等人(Journal of Bacteriology 175,1001-1007(1993))中，在专利申请WO 96/15246中，在Malumbres等人(Gene 134,15-24(1993))中，在日本公开说明JP-A-10-229891中，在Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))中，在Makrides(Microbiological Reviews 60:512-538(1996))中及在已知的遗传学和分子生物学教科书中。

基因可例如借助于附加体质粒过表达。合适的质粒是在棒状细菌中复制的那些。许多已知的质粒载体，例如pZ1(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology(1989)64:549-554)、pEKEx1(Eikmanns等人，Gene 102:93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等人，Gene 107:69-74(1991))是基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。其它质粒载体，例如基于pCG4(美国专利第4,489,160号)或pNG2(Serwold-Davis等人，FEMS MicrobiologyLetters 66,119-124(1990))或AG1(美国专利第5,158,891号)的那些，可以类似方式使用。

此外，在其帮助下可以采用通过在染色体内整合而进行基因扩增的方法的质粒载体也合适，例如Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60,126-132(1994))已经描述用于复制和扩增hom-thrB操纵子。在这种方法中将完整基因克隆到可以在宿主(通常为大肠杆菌)中而不是在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体中。合适的载体是例如pSUP301(Simon等人，Bio/Technology 1,784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(等人，Gene 145,69-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation,Madison,Wis.,USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman(1994).Journal of Biological Chemistry 269:32678-84；美国专利第5,487,993号)、Blunt(Invitrogen,Groningen,Netherlands；Bernard等人，Journal of Molecular Biology,234:534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等人，1991,Journal of Bacteriology 173:4510-4516)或pBGS8(Spratt等人，1986,Gene 41:337-342)。然后通过偶联或转化将含有要扩增的基因的质粒载体转移到所需谷氨酸棒杆菌菌株中。例如等人描述了偶联法(Applied and Environmental Microbiology 60,756–759(1994))。例如，Thierbach 等人(Applied Microbiology and Biotechnology 29,356–362(1988))，Dunican和Shivnan(Bio/Technology 7,1067–1070(1989))及Tauch等人(FEMSMicrobiological Letters 123,343–347(1994))描述了转化法。借助于交叉事件同源重组后，所得菌株含有相关基因的至少两个拷贝。

调控，即增加或减少基因表达的方法包括使用体外提供的DNA分子产生微生物的重组法。此类DNA分子包含，例如，启动子、表达盒、基因、等位基因、编码区等。通过转化、偶联、转导方法或类似方法将它们引入所需微生物中。

在本发明的情况下，启动子优选为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸，并且表达盒优选为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸，其经由在其3’末端的核苷酸，与确保RNA翻译的接头多核苷酸功能性连接。

基于引起过表达的措施之前菌株内所述多肽的活性或浓度，使用根据本发明的启动子或根据本发明的表达单元的过表达措施使相应多肽的活性或浓度增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，优选不超过1,000％、2,000％、4,000％、10,000％或20,000％。

可通过测量由基因转录的mRNA的量，通过测定多肽的量和通过测定酶活性来确定表达或过表达的程度。

尤其可通过使用“RNA印迹法”和定量RT-PCR法测定mRNA的量。定量RT-PCR涉及先于聚合酶链反应的逆转录。为此，可以使用来自Roche Diagnostics的LightCycler^TM系统(Boehringer Mannheim GmbH,Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany)，例如Jungwirth等人(FEMS Microbiology Letters 281,190-197(2008))中所述。可以通过1-维和2-维蛋白质凝胶分离和使用适当的评价软件在凝胶中进行蛋白质浓度的后续光学鉴定来测定蛋白质的浓度。为棒状细菌制备蛋白质凝胶和鉴定所述蛋白的习用方法是Hermann等人描述的程序(Electrophoresis,22:1712-23(2001))。同样可以使用对要检测的蛋白质有特异性的抗体通过蛋白质印迹杂交(Sambrook等人，Molecular cloning:a laboratorymanual.第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)和使用用于浓度测定的适当软件进行后续光学评价(Lohaus和Meyer(1998)Biospektrum5:32-39；Lottspeich,Angewandte Chemie 321:2630-2647(1999))来测定蛋白质浓度。借助于T检验(Gosset,Biometrika 6(1):1-25(1908))来测定收集的数据的统计显著性。

使用根据本发明的启动子过表达靶基因的措施可以合适的方式与另外的过表达措施组合。过表达通过多种现有技术中可用的方法实现。除修饰指导或控制基因表达的核苷酸序列外，这些还包括增加拷贝数。可借助于在微生物细胞质中复制的质粒来增加拷贝数。为此，在现有技术中对于非常不同的微生物类描述了大量的质粒，所述质粒可用于设定基因拷贝数的所需增量。例如，在Tauch等人(Journal of Biotechnology 104(1-3),27-40,(2003))中和在Stansen等人(Applied and Environmental Microbiology 71,5920-5928(2005))中描述了适于棒杆菌属的质粒。

此外可通过向微生物染色体中引入另外的拷贝使拷贝数增加至少一个(1)拷贝。例如在专利WO 03/014330、WO 03/040373和WO 04/069996中描述了适于棒杆菌属的方法。

此外可通过以下方式增加基因表达：使多个启动子置于靶基因上游或使其与待表达的基因功能性连接并且以这种方式实现增加的表达。在专利WO 2006/069711中描述了这种方式的实例。

在适当情况下，基因的转录受抑制(阻遏蛋白)或促进(活化蛋白)转录的蛋白质控制。因此，同样可通过增加活化蛋白的表达或降低或切断阻遏蛋白的表达或消除阻遏蛋白的结合位点来实现过表达。延伸率受密码子使用的影响，可能通过利用在原始菌株中常见的的转运RNA(tRNA)的密码子而增强翻译。而且，用许多微生物中最常见的ATG密码子(在大肠杆菌中为77％)置换起始密码子可大大提高翻译，因为在RNA水平上，例如AUG密码子比密码子GUG和UUG有效两倍或三倍(Khudyakov等人，FEBS Letters 232(2):369-71(1988)；Reddy等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60(1985))。也可能优化起始密码子周围的序列，因为已经描述了起始密码子和侧翼区之间的协同效应(等人，Gene 273(2):259-65(2001)；Hui等人，EMBO Journal3(3):623-9(1984))。

尤其在Sambrook等人的已知手册“Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中可以找到处理DNA、DNA消化和连接、转化株的转化和选择的说明。

本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸的载体。

Kirchner和Tauch(Journal of Biotechnology 104:287-299(2003))描述了要用于谷氨酸棒杆菌中的精选载体。

使用根据本发明的载体的同源重组允许染色体上的DNA片段被由载体转运到细胞内的根据本发明的多核苷酸置换。为了载体的环状DNA分子与染色体上的靶DNA之间的有效重组，在具有与靶位点同源的核苷酸序列的末端处提供了要用根据本发明的多核苷酸置换的DNA区域，所述靶位点决定了载体整合和DNA置换的位点。

因此根据本发明的启动子多核苷酸可以：1)在染色体内靶基因的天然基因座处经天然启动子置换；或2)随靶基因一起整合在后者的天然基因座处或另一基因座处。

“靶基因天然基因座处的天然启动子的置换”意指置换在相应野生型或相应原始生物的基因座处呈其核苷酸序列的形式以单拷贝的方式自然存在的基因的自然存在的启动子。

“另一基因座”意指核苷酸序列不同于靶基因序列的基因座。所述另一基因座或所述另一基因座处的核苷酸序列优选位于染色体内并且通常不是生长和所需化学化合物生成所必需的。此可能使用染色体内的基因间区，即无编码功能的核苷酸序列。

优选在棒杆菌属的微生物中进行表达或过表达。在棒杆菌属中，优选基于以下种类的菌株：有效棒杆菌，保存的模式菌株为DSM44549；谷氨酸棒杆菌，保存的模式菌株为ATCC13032；和产氨棒杆菌，保存的模式菌株为ATCC6871。特别优选谷氨酸棒杆菌类。

棒杆菌属，尤其是谷氨酸棒杆菌类的合适菌株，尤其是已知的野生型菌株：谷氨酸棒杆菌ATCC13032、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965、热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869和叉开短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)ATCC14020；及由其制备的产L-氨基酸的突变体或菌株，例如产L-赖氨酸的菌株：谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709、黄色短杆菌FERM-P 1708、乳糖发酵短杆菌FERM-P 1712、谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463、谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464、谷氨酸棒杆菌DM58-1、谷氨酸棒杆菌DG52-5、谷氨酸棒杆菌DSM5714和谷氨酸棒杆菌DSM12866。

术语“产谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)”也已用于谷氨酸棒杆菌。有效棒杆菌类的一些代表在现有技术中也已被称为热产氨棒杆菌，例如菌株FERM BP-1539。

用于根据本发明的表达或过表达措施的微生物或菌株(原始菌株)已经优选具有向周围营养营养培养基中分泌所需精细化学品并在那里积聚的能力。表达“产生”也用于下文。更具体地，用于过表达措施的菌株具有在不超过120小时、不超过96小时、不超过48小时、不超过36小时、不超过24小时或不超过12小时内在细胞或营养培养基中积聚浓度为至少0.10g/L、至少0.25g/L、至少0.5g/L、至少1.0g/L、至少1.5g/L、至少2.0g/L、至少4.0g/L或至少10.0g/L的所需精细化学品的能力。原始菌株优选为通过诱变和选择，通过重组DNA技术或通过两种方法的组合制备的菌株。

本领域的技术人员理解，适于本发明措施的微生物也可通过以下方式获得：首先采用根据本发明的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的启动子在野生菌株例如谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032或菌株ATCC 14067中过表达靶基因，然后借助于现有技术中描述的其它遗传措施，使微生物产生所需精细化学品。

术语“生物分子”关于本发明的措施意指氨基酸、有机酸、维生素、核苷和核苷酸。特别优选蛋白氨基酸、非蛋白氨基酸、大分子和有机酸。

“蛋白氨基酸”意指出现在天然蛋白，即微生物、植物、动物和人类蛋白中的氨基酸。它们用作蛋白质的结构单元，在其中它们通过肽键相互连接。

下文提到L-氨基酸或氨基酸时，应将其理解为意指选自下组的一种或多种氨基酸(包括其盐)：L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。尤其优选L-赖氨酸。L-氨基酸，尤其是赖氨酸，用于人类医学及制药业、食品业且特别是动物营养中。因此对提供新改进的方法用于制备氨基酸，尤其是L-赖氨酸普遍感兴趣。

术语蛋白质和多肽可互换。

本发明提供了产生精细化学品的微生物，通过使用根据本发明的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQID NO:8的启动子，所述微生物相比于特定原始菌株有一个或多个基因的表达增加。

发酵制备

此外本发明提供了发酵制备精细化学品的方法，其包括以下步骤：

a)在合适的培养基中培养上述根据本发明的微生物，产生发酵液；并且

b)浓缩a)的发酵液和/或微生物细胞内的精细化学品。

这里优选由含精细化学品的发酵液获得精细化学品或含精细化学品的液体或固体产物。产生的微生物可连续培养—例如，WO 05/021772中所述—或在分批法(分批培养)中或在分批补料或重复分批补料法中间断培养以生成所需的有机化学化合物。关于已知培养方法的一般特性的汇总在Chmiel编著的教科书(Bioprozeβtechnik.1:Einführung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas编著的教科书(Bioreaktoren and periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中可用。

要使用的培养基或发酵培养基必须以合适方式满足各菌株的需要。在“Manual ofMethods for General Bacteriology”of the American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)中存在对各种微生物培养基的描述。术语培养基和发酵培养基可互换。

可能使用以下物质作为碳源：糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜或甘蔗加工的含蔗糖的溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子脂；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，例如丙三醇、甲醇和乙醇；及有机酸，例如乙酸或乳酸。

可能使用以下物质作为氮源：含氮有机化合物例如蛋白胨、酵母膏、肉膏、麦芽膏、玉米浆、大豆粉和尿素；或无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独地或作为混合物使用。

可能使用以下物质作为磷源：磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。

培养基可另外包含生长所必需的盐，例如呈金属(例如钠、钾、镁、钙和铁)氯化物或硫酸盐的形式，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除以上提到的物质外，还可采用必需生长因子如氨基酸(例如高丝氨酸)和维生素(例如硫胺、生物素或泛酸)。

所述原材料可以呈单批形式添加到培养物中或在培养期间以合适方式加料。

可通过采用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水；或酸性化合物如磷酸或硫酸以合适方式控制培养物的pH。通常将pH调节到6.0至8.5，优选6.5至8的值。为控制起泡，可能采用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为维持质粒的稳定性，可能向培养基中添加合适的选择性物质，例如抗生素。优选在需氧条件下进行发酵。为了维持这些条件，向培养物中引入氧气或含氧气体混合物，例如空气。同样可能使用富含过氧化氢的液体。在适当的情况下，在高压下，例如0.03至0.2MPa的高压下进行发酵。培养物的温度一般为20℃至45℃并且优选为25℃至40℃，特别优选为30℃至37℃。在分批或分批补料法中，优选连续培养直至形成足够回收的所需有机化学化合物的量。这一目的通常在10小时至160小时内实现。在连续法中，培养时间可能更长。微生物的活性在发酵培养基中和/或在所述微生物细胞中产生一定浓度(积聚)的有机化学化合物。

合适的发酵培养基的实例尤其可在专利US 5,770,409、US 5,990,350、US 5,275,940、WO 2007/012078、US 5,827,698、WO 2009/043803、US 5,756,345和US 7,138,266中找到。

分析L-氨基酸以在发酵期间一次或多次测定浓度可以通过以下方式进行：借助于离子交换色谱法，优选阳离子交换色谱法分离L-氨基酸，如Spackman等人(AnalyticalChemistry 30:1190-1206(1958))所述，随后使用茚三酮进行柱后衍生化。也可能采用邻-酞二醛而不是茚三酮进行柱后衍生化。可以在Pickering(LC-GC Magazine ofChromatographic Science)7(6),484-487(1989))中找到关于离子交换色谱法的概述性文章。

同样可能例如使用邻-酞二醛或异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化，并且通过反相(RP)色谱法，优选呈高效液相色谱法(HPLC)的形式分离所得氨基酸衍生物。这种类型的方法，例如在Lindroth等人(Analytical Chemistry 51:1167-1174(1979))中有描述。

用光度计进行检测(吸收、荧光)。

尤其在来自Lottspeich和Zorbas的教科书“Bioanalytik”(SpektrumAkademischer Verlag,Heidelberg,Germany 1998)中可以找到关于氨基酸分析的评论。

在发酵过程中一次或多次测定α-酮酸的浓度可以通过以下方式进行：在呈H+形式的磺化苯乙烯-二乙烯基苯聚合物上，借助于离子交换色谱法，优选阳离子交换色谱法，例如借助于0.025M硫酸分离酮酸和其它分泌产物，随后在215nm(可选地也可在230或275nm下)进行UV检测。优选地，可采用REZEK RFQ-Fast Fruit H+柱(Phenomenex)，但用于分离相的其它供应商(例如来自BioRad的Aminex)也是可行的。供应商在申请实例中描述了类似分离。

含有根据本发明的启动子变体的过程或发酵过程的性能，在选自下组的一个或多个参数方面：浓度(每单位体积形成的化合物)、产量(消耗的每单位碳源形成的化合物)、形成量(每单位体积和时间形成的化合物)和比形成量(每单位细胞干物质或干生物质和时间形成的化合物或每单位细胞蛋白和时间形成的化合物)或其它过程参数及其组合，按使用不含根据本发明的启动子变体的微生物的过程或发酵过程计，增加至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。这就大规模工业过程而言被视为非常值得做的。

所述发酵措施产生含所需精细化学品，优选氨基酸、有机酸、维生素、核苷或核苷酸的发酵液。

然后以液体或固体形式提供、生产或回收含精细化学品的产物。

发酵液意指其中微生物已经在某一温度下培养了一定时间的发酵培养基或营养培养基。发酵培养基或发酵期间采用的培养基包含确保生成所需化合物且通常确保繁殖和活力的所有物质或组分。

发酵完成时，所得发酵液相应地包含：

a)微生物的生物质(细胞团块)，由于所述微生物细胞的繁殖已经生成了所述生物质；

b)发酵期间形成的所需精细化学品；

c)可能在发酵期间形成的有机副产物；及

d)采用的发酵培养基或原材料的尚未在发酵中被消耗的组成部分，例如，维生素(例如生物素)或盐(例如硫酸镁)。

有机副产物包括除特定所需化合物外由发酵中采用的微生物产生并任选分泌的物质。

从培养容器或发酵罐中去除发酵液，在适当情况下收集并用于提供呈液体或固体形式的含精细化学品的产物。表达“回收含精细化学品的产物”也用于此。在最简单的情况下，已经从发酵罐中去除的含精细化学品的发酵液本身构成了回收产物。

选自由以下组成的组的一种或多种措施从发酵液中：

a)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)去除水；

b)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)去除生物质，后者任选在去除之前被灭活；

c)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％或≥99.7％)去除发酵期间形成的有机副产物；及

d)部分(>0％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％或≥99.7％)去除采用的发酵培养基或原材料的尚未在发酵中被消耗的组成部分，实现了所需有机化学化合物的浓缩或纯化。以这种方式分离具有所需含量的所述化合物的产物。

部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％至<100％)去除水(措施a))也称为干燥。

在该方法的一种变型中，完全或几乎完全去除水、生物质、有机副产物和采用的发酵培养基的未消耗组成部分产生了所需有机化学化合物的纯净(≥80重量％，≥90重量％)或高纯度(≥95重量％，≥97重量％或≥99重量％)产物形式。措施a)、b)、c)和d)的大量技术说明在现有技术中可用。

根据需要，可以通过分离方法例如离心、过滤、倾析或其组合将生物质从发酵液中完全或部分去除，或完全留在其中。在适当情况下，在合适的工艺步骤期间，例如通过热处理(加热)或通过加酸灭活生物质或含生物质的发酵液。

在一种程序中，完全或几乎完全去除生物质，使得没有(0％)或至多30％、至多20％、至多10％、至多5％、至多1％或至多0.1％的生物质留在制备的产物中。在另一程序中，生物质未去除，或仅小比例去除，使得所有(100％)或超过70％、80％、90％、95％、99％或99.9％的生物质留在制备的产物中。在根据本发明的一种方法中，相应地，去除≥0％至≤100％比例的生物质。

最后，在生物质完全或部分去除之前或之后，用无机酸例如盐酸、硫酸或磷酸；或有机酸例如丙酸，将发酵后获得的发酵液调节至酸性pH，以便改善最终产物的处理特性(GB1,439,728或EP 1 331220)。同样可能酸化具有完整含量的生物质的发酵液。最后，也可通过添加亚硫酸氢钠(NaHCO₃，GB 1,439,728)或另一种盐，例如亚硫酸的铵、碱金属或碱土金属盐，使发酵液稳定。

生物质去除期间，部分或完全去除发酵液中存在的任何有机或无机固体。溶于发酵液中的有机副产物和发酵培养基(原材料)的溶解的未消耗组成部分，至少部分(>0％)，优选达至少25％的程度，特别优选达至少50％的程度且极其优选达至少75％的程度，留在产物中。在适当情况下，它们也完全(100％)或几乎完全留在产物中，意指>95％或>98％或>99％。如果在这个意义上产物包含发酵液组成部分的至少一部分，则这也用术语“基于发酵液的产物”来描述。

随后，从发酵液中去除水，或通过已知方法，例如使用旋转式蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器，通过反渗透或通过纳米过滤来稠化或浓缩所述发酵液。然后可通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾造粒的方法或通过其它方法例如在循环流化床上，例如根据PCT/EP2004/006655所述，将这种浓缩发酵液后续处理成自由流动性产物，尤其是细粉或优选粗颗粒。在适当情况下通过筛选或除尘从所得颗粒中分离所需产物。同样可能直接干燥发酵液，即无需通过喷雾干燥或喷雾造粒预先浓缩。

“自由流动”意指来自一系列具有不同尺寸的孔的玻璃孔容器的粉末，至少从具有5mm孔的容器中畅通无阻地流出(Klein:Seifen,Fette,Wachse 94,12(1968))。

“细”意指粉末主要(>50％)具有直径为20至200μm的粒度。

“粗”意指产物主要(>50％)具有直径为200至2000μm的粒度。

粒度测定可通过激光衍射光谱测定法进行。在R.H.Müller and R.Schuhmann,Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart编著的教科书“in der Laborpraxis”(1996)中或在M.Rhodes编著，Wiley&Sons出版的教科书“Introduction to Particle Technology”(1998)中描述了相应的方法。

自由流动的细粉又可通过合适的压实或造粒方法转化为粗的、非常自由流动、耐贮存且基本上无尘的产物。

术语“无尘”意指产物仅包含小比例(<5％)的直径低于100μm粒度。

在本发明的意义上，“耐贮存”意指产物可以在干燥和阴凉环境中储存至少一(1)年或更长，优选至少1.5年或更长，特别优选两(2)年或更长，不会发生各有机化学化合物的任何重大损失。“重大损失”意思>5％的损失。

有利的是在造粒或压实期间采用通常的有机或无机助剂或载体，例如淀粉、明胶、纤维素衍生物或类似物质，正如通常在食品或饲料加工中用作粘合剂、胶凝剂或增稠剂那样，或其它物质例如二氧化硅、硅酸盐(EP0743016A)和硬脂酸盐。

更有利的是如WO04/054381中所述，用油或脂肪处理所得颗粒的表面。可以使用的油为矿物油、植物油或植物油的混合物。此类油的实例为大豆油、橄榄油、大豆油/卵磷脂混合物。同样地，硅油、聚乙二醇或羟乙基纤维素也合适。用所述油处理颗粒表面实现了产物耐磨性的增加和含尘量的降低。产物中的含油量，按饲料添加剂的总量计，为0.02至2.0重量％，优选0.02至1.0重量％，且极其优选0.2至1.0重量％。

优选的产物有≥97重量％比例的粒度为100至1800μm或≥95重量％比例的粒度为直径300至1800μm。粉尘(即粒度<100pm的粒子)的比例优选为>0至1重量％，特别优选不超过0.5重量％。

然而，可选地，产物也可吸附在饲料加工中已知且惯用的有机或无机载体上，例如二氧化硅、硅酸盐、膳食、麸皮粉、面粉、淀粉、糖等，和/或与惯用增稠剂或粘合剂混合并稳定化。因此用途和方法的实例在文献中有描述(Die Mühle+Mischfuttertechnik 132(1995)49，第817页)。

实施方案：

1.一种重组核酸分子，其包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组，与至少一个异源靶基因功能性连接的启动子多核苷酸序列。

2.根据实施方案1所述的重组核酸分子，其中所述启动子多核苷酸序列选自由SEQID NO:1、5和7组成的组。

3.根据实施方案1或2所述的重组核酸分子，其还包含接头寡核苷酸或接头多核苷酸。

4.根据实施方案1所述的重组核酸分子，其中所述至少一个异源靶基因是为产生生物分子的生物合成途径的组分的基因，所述生物分子选自由氨基酸、有机酸、蛋白质和聚合物组成的组。

5.根据实施方案4所述的重组核酸分子，其中所述至少一个异源靶基因是为氨基酸生物合成途径的组分的基因，所述氨基酸生物合成途径选自由以下组成的组：

包含条目M00020的基因的丝氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00018的基因的苏氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00021的基因的半胱氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00338的基因的半胱氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00609的基因的半胱氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00017的基因的甲硫氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00019的基因的缬氨酸/异亮氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00535的基因的异亮氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00570的基因的异亮氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00432的基因的亮氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00016的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00525的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00526的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00527的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M0030的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00433的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M0031的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00015的基因的脯氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00028的基因的鸟氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00763的基因的鸟氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00026的基因的组氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00022的基因的莽草酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00023的基因的色氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00024的基因的苯丙氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00025的基因的酪氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00040的基因的酪氨酸生物合成途径；

及其任何生物合成途径的基因的组合。

6.根据实施方案1所述的重组核酸分子，其还包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的一个或多个附加启动子多核苷酸序列，每个启动子与至少一个附加异源基因功能性连接。

7.根据实施方案1所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子是分离的。

8.一种重组载体，其包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组及其组合的启动子多核苷酸序列，每个启动子与至少一个异源靶基因功能性连接。

9.根据实施方案8所述的重组载体，其中所述启动子多核苷酸序列选自由SEQ IDNO:1、5和7组成的组。

10.根据实施方案8或9所述的重组载体，其包含两个或更多个重组核酸分子的组合，所述重组核酸分子包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组及其组合的启动子多核苷酸序列，每个启动子与至少一个异源靶基因功能性连接。

11.根据实施方案10所述的重组载体，其中每个所述启动子多核苷酸序列与不同的异源靶基因功能性连接。

12.根据实施方案11所述的重组载体，其中所述靶基因是相同代谢途径的一部分。

13.根据实施方案11所述的重组载体，其中所述靶基因不是相同代谢途径的一部分。

14.一种宿主细胞，其包含根据实施方案1-6中任一项所述的重组核酸分子，或其根据实施方案10所述的组合，或根据实施方案8-13中任一项所述的重组载体。

15.根据实施方案14所述的宿主细胞，其包含启动子多核苷酸序列的组合，其中每个所述启动子多核苷酸序列与不同的异源靶基因功能性连接。

16.根据实施方案15所述的宿主细胞，其中每个所述不同的异源靶基因是相同代谢途径的一部分。

17.根据实施方案15所述的宿主细胞，其中每个所述不同的异源靶基因不是相同代谢途径的一部分。

18.根据实施方案14至17中任一项所述的宿主细胞，其属于棒杆菌属。

19.根据实施方案18所述的宿主细胞，其为谷氨酸棒杆菌。

20.一种改变一个或多个靶基因的表达的方法，其包括培养根据实施方案12至19中任一项所述的宿主细胞，其中所述一个或多个靶基因中的每一个是与选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的多核苷酸序列功能性连接的不同异源靶基因并且其中每个异源靶基因表达的改变独立地选自：上调或下调。

21.一种改变一个或多个靶基因的表达的方法，其包括培养根据实施方案12至19中任一项所述的宿主细胞，其中所述一个或多个靶基因中的每一个是与选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的多核苷酸序列功能性连接的不同异源靶基因并且其中每个异源靶基因表达的改变独立地选自：上调或下调。

22.一种产生生物分子的方法，其包括在适于产生所述生物分子的条件下，培养根据实施方案12至19中任一项所述的宿主细胞。

23.根据实施方案20所述的方法，其中所述生物分子为L-氨基酸。

24.根据实施方案22所述的方法，其中所述L-氨基酸为L-赖氨酸。

25.根据实施方案20所述的方法，其中所述至少一个异源靶基因是编码选自由以下组成的组的蛋白质的基因：天冬氨酸-半醛脱氢酶(EC:1.2.1.11)；4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(EC:4.3.3.7)；二氢吡啶二羧酸还原酶(EC:1.17.1.8)；2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(EC:2.3.1.117)；2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(EC:2.3.1.117)；N-琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶(EC:2.6.1.17)；琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(EC:3.5.1.18)；二氨基庚二酸表异构酶(EC:5.1.1.7)；二氨基庚二酸脱羧酶(EC:4.1.1.20)；二氨基庚二酸脱氢酶(EC:1.4.1.16)；天冬氨酸激酶Lyscα和β亚基(EC:2.7.2.4)；天冬氨酸转氨酶(EC:2.6.1.1)；磷酸转移酶系统(PTS)；PTS的葡萄糖特异性酶IIBC组分(EC:2.7.1.69)；葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(EC:1.1.1.491.1.1.363)；葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC:5.3.1.9)；转酮醇酶(EC:2.2.1.1)；6-磷酸果糖激酶1(EC:2.7.1.11)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC:4.1.1.31)；丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1)；异柠檬酸脱氢酶(EC:1.1.1.42)；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(GTP)(EC:4.1.1.32)；草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)；高丝氨酸激酶(EC:2.7.1.39)；高丝氨酸脱氢酶(EC:1.1.1.3)；苏氨酸合酶(EC:4.2.3.1)，及其组合。

26.一种宿主细胞，其包含至少一个与异源靶基因功能性连接的启动子多核苷酸，其中所述启动子多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

27.根据实施方案25所述的宿主细胞，其包含两个或更多个与异源靶基因功能性连接的启动子多核苷酸序列的组合，其中每个启动子多核苷酸与不同的异源靶基因功能性连接。

28.根据实施方案26所述的宿主细胞，其中所述组合包含两个选自由以下组成的组的异源靶基因：天冬氨酸-半醛脱氢酶(EC:1.2.1.11)；4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(EC:4.3.3.7)；二氢吡啶二羧酸还原酶(EC:1.17.1.8)；2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(EC:2.3.1.117)；2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(EC:2.3.1.117)；N-琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶(EC:2.6.1.17)；琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(EC:3.5.1.18)；二氨基庚二酸表异构酶(EC:5.1.1.7)；二氨基庚二酸脱羧酶(EC:4.1.1.20)；二氨基庚二酸脱氢酶(EC:1.4.1.16)；天冬氨酸激酶Lyscα和β亚基(EC:2.7.2.4)；天冬氨酸转氨酶(EC:2.6.1.1)；磷酸转移酶系统(PTS)；PTS的葡萄糖特异性酶II BC组分(EC:2.7.1.69)；葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(EC:1.1.1.491.1.1.363)；葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC:5.3.1.9)；转酮醇酶(EC:2.2.1.1)；6-磷酸果糖激酶1(EC:2.7.1.11)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC:4.1.1.31)；丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1)；异柠檬酸脱氢酶(EC:1.1.1.42)；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(GTP)(EC:4.1.1.32)；草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)；高丝氨酸激酶(EC:2.7.1.39)；高丝氨酸脱氢酶(EC:1.1.1.3)；和苏氨酸合酶(EC:4.2.3.1)，其各自与选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的启动子功能性连接。

29.根据实施方案27所述的宿主细胞，其中所述组合包含选自由SEQ ID NO:1、5和7组成的组，并且与所述异源靶基因功能性连接的启动子。

30.根据实施方案26所述的宿主细胞，其中所述组合包含三个选自由以下组成的组的异源靶基因：天冬氨酸-半醛脱氢酶(EC:1.2.1.11)；4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(EC:4.3.3.7)；二氢吡啶二羧酸还原酶(EC:1.17.1.8)；2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(EC:2.3.1.117)；2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(EC:2.3.1.117)；N-琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶(EC:2.6.1.17)；琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(EC:3.5.1.18)；二氨基庚二酸表异构酶(EC:5.1.1.7)；二氨基庚二酸脱羧酶(EC:4.1.1.20)；二氨基庚二酸脱氢酶(EC:1.4.1.16)；天冬氨酸激酶Lyscα和β亚基(EC:2.7.2.4)；天冬氨酸转氨酶(EC:2.6.1.1)；磷酸转移酶系统(PTS)；PTS的葡萄糖特异性酶II BC组分(EC:2.7.1.69)；葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(EC:1.1.1.491.1.1.363)；葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC:5.3.1.9)；转酮醇酶(EC:2.2.1.1)；6-磷酸果糖激酶1(EC:2.7.1.11)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC:4.1.1.31)；丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1)；异柠檬酸脱氢酶(EC:1.1.1.42)；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(GTP)(EC:4.1.1.32)；草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)；高丝氨酸激酶(EC:2.7.1.39)；高丝氨酸脱氢酶(EC:1.1.1.3)；和苏氨酸合酶(EC:4.2.3.1)，其各自与选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的启动子功能性连接。

31.根据实施方案29所述的宿主细胞，其中所述组合包含选自由SEQ ID NO:1、5和7组成的组，与所述异源靶基因功能性连接的启动子。

32.根据实施方案26所述的宿主细胞，其中所述异源靶基因是相同代谢途径的一部分。

33.根据实施方案26所述的宿主细胞，其中所述异源靶基因不是相同代谢途径的一部分。

34.根据实施方案25至32中任一项所述的宿主细胞，其属于棒杆菌属。

35.根据实施方案25至33中任一项所述的宿主细胞，其为谷氨酸棒杆菌。

36.一种改变一个或多个靶基因的表达的方法，其包括培养根据实施方案25至34中任一项所述的宿主细胞，其中每个异源靶基因的改变独立地选自：上调或下调，其中所述上调或下调是相对于所述靶基因在内源性启动子控制下的表达水平。

37.一种产生生物分子的方法，其包括在适于产生所述生物分子的条件下，培养根据实施方案25至35中任一项所述的宿主细胞。

38.根据实施方案36所述的方法，其中所述生物分子为L-氨基酸。

39.根据实施方案37所述的方法，其中所述L-氨基酸为L-赖氨酸。

40.根据实施方案38所述的方法，其中所述至少一个异源靶基因选自由以下组成的组：天冬氨酸-半醛脱氢酶(EC:1.2.1.11)；4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(EC:4.3.3.7)；二氢吡啶二羧酸还原酶(EC:1.17.1.8)；2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(EC:2.3.1.117)；2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(EC:2.3.1.117)；N-琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶(EC:2.6.1.17)；琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(EC:3.5.1.18)；二氨基庚二酸表异构酶(EC:5.1.1.7)；二氨基庚二酸脱羧酶(EC:4.1.1.20)；二氨基庚二酸脱氢酶(EC:1.4.1.16)；天冬氨酸激酶Lyscα和β亚基(EC:2.7.2.4)；天冬氨酸转氨酶(EC:2.6.1.1)；磷酸转移酶系统(PTS)；PTS的葡萄糖特异性酶II BC组分(EC:2.7.1.69)；葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(EC:1.1.1.491.1.1.363)；葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC:5.3.1.9)；转酮醇酶(EC:2.2.1.1)；6-磷酸果糖激酶1(EC:2.7.1.11)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC:4.1.1.31)；丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1)；异柠檬酸脱氢酶(EC:1.1.1.42)；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(GTP)(EC:4.1.1.32)；草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)；高丝氨酸激酶(EC:2.7.1.39)；高丝氨酸脱氢酶(EC:1.1.1.3)；苏氨酸合酶(EC:4.2.3.1)，及其组合。

41.一种重组载体，其包含至少一个与异源靶基因功能性连接的启动子多核苷酸；其中所述启动子多核苷酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；其中当所述启动子多核苷酸包含选自以下的序列时：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8，所述靶基因不同于启动子多核苷酸的内源基因。

42.根据实施方案40所述的重组载体，其包含至少两个启动子多核苷酸，其中每个启动子多核苷酸与不同靶基因功能性连接。

43.根据实施方案41所述的重组载体，其中所述靶基因是相同代谢途径的一部分。

44.根据实施方案42所述的重组载体，其中所述靶基因不是相同代谢途径的一部分。

45.一种宿主细胞，其经根据实施方案40至43中任一项所述的重组载体转化。

46.根据实施方案44所述的宿主细胞，其属于棒杆菌属。

47.根据实施方案46所述的宿主细胞，其为谷氨酸棒杆菌。

48.一种改变一个或多个靶基因的表达的方法，其包括培养根据实施方案44至46中任一项所述的宿主细胞，其中每个靶基因的改变独立地选自：上调或下调。

49.一种产生生物分子的方法，其包括在适于产生所述生物分子的条件下，培养根据实施方案44至47中任一项所述的宿主细胞。

50.根据实施方案48所述的方法，其中所述生物分子为L-氨基酸。

提供以下实施例是为了说明，而非限制的目的。

实施例

实施例1：候选启动子的鉴定

使用以下程序鉴定满足以下两个条件的天然谷氨酸棒杆菌启动子：1)表示组成型启动子梯；和2)可由短DNA序列(理想地小于100个碱基对)编码。检查描述谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中的全局基因表达水平的公开数据集(Lee等人，Biotechnology Letters,2013)以鉴定在不同生长条件下组成型表达的基因。在两种生长条件下，即在添加和未添加过氧化氢的基本培养基中的恒化器生长，表达水平保持恒定(定义为介于0.33和3之间的表达比率)的基因满足第一个条件。检查描述谷氨酸棒杆菌ATCC 13032转录组的公开数据集(Pfeifer-Sancar等人，BMC Genomics 2013,14:888)以找出具有紧密启动子的基因，即由60个碱基对的核心启动子区和长度介于26和40个碱基对之间的5引发非翻译区组成的那些。所述两个数据集交叉引用以鉴定满足两个条件的启动子。参见图1。选择五个候选启动子(SEQ ID NO:2、3、4、6和8)进行进一步评价。

实施例2：候选启动子活性的评价

为评价候选启动子活性，设计了一组基于质粒的荧光报告构建体。简言之，每个启动子在穿梭载体pK18rep中的eyfp(编码黄色荧光蛋白的基因)前面克隆。将这些质粒转化到谷氨酸棒杆菌NRRL B-11474中并通过光谱测定法测量YFP蛋白的积聚量来评估启动子活性。

通过用pBL1复制起点(GenBank:AF092037.1)置换pK18mobSac B(ATCC 87087)中的sacB基因，产生能够在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌两者中增殖的载体来构建穿梭载体pK18rep。简言之，我们使用引物pK18F(TCATGACCAAAATCCCTTAACGTG(SEQ ID NO:9))和pK18R(GCGTACTCTTCGATGGTGAAAACATCTC(SEQ ID NO:10))，PCR扩增含大肠杆菌复制起点和卡那霉素(Kanamycin)抗性基因nptII的pK18mobSacB的一部分并且用引物pBL1F(GACCTAAAAT GTGTAAAGGGCAAAGTGTATACaacaacaagacccatcatagtttgc(SEQ ID NO:11))和pBL1R(CACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAcacatgcagtc atgtcgtgc(SEQ ID NO:12))，PCR扩增编码pBL1复制起点的合成D NA。在适当情况下用DpnI(New England Biolabs)处理PCR产物，用DNA Clean&Concentrate-5(Zymo Research)纯化，并使用Gibs on Assembly方法用Gibson Assembly Master Mix(NEB)根据生产商说明书组装。根据生产商说明书将GibsonAssembly反应物转化到NEB Turbo感受态细胞(New England Biolabs)内。用LB琼脂加25μg/mL卡那霉素选择转化株并通过Sanger测序检验。

报告构建体pK18rep-Psod-eyfp通过以下方式构建：限制性消化和连接pK18rep和合成DNA构建体，合成DNA构建体由以下序列组成：在eyfp基因上游，来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的编码超氧化物歧化酶(GenBank:BA000036.3)启动子的191个碱基对的DNA序列，接着是来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的侧翼是EcoRI和SalI限制位点，编码sod终止子的77个碱基对的DNA序列。用EcoRI-HF和SalI-HF(New England Biolabs)消化亲本载体和合成DNA插入片段并且使所得产物在琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶上提取DNA并根据生产商说明书使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research)纯化并用T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs)连接。根据生产商说明书将连接反应物转化到NEB Turbo感受态细胞(NewEngland Biolabs)内。用LB琼脂加25μg/mL卡那霉素选择转化株并通过Sanger测序检验。

另外的启动子报告构建体通过置换pK18rep-Psod-eyfp中的sod启动子构建。我们用引物pK18repR(gcttgcatgcctgcaggtcga(SEQ ID NO:13))和yfpF(ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC(SEQ ID NO:14))，PCR扩增不包括sod启动子的pK18rep-Psod-eyfp。用DpnI(New England Biolabs)处理PCR产物并用DNA Clean&Concentrate-5(ZymoResearch)纯化并且使用Gibson Assembly方法用Gibson Assembly Master Mix(NEB)根据生产商说明书，与编码目标启动子的合成DNA构建体加上目的载体的25个碱基对的同源序列组装。根据生产商说明书将Gibson Assembly反应物转化到NEB Turbo感受态细胞(NewEngland Biolabs)内。用LB琼脂加25μg/mL卡那霉素选择转化株并通过Sanger测序检验。

另外，选择强组成型启动子Pcg0007(SEQ ID NO:2)进行诱变。在谷氨酸棒杆菌中，认为-10元件在测定启动子活性中起关键作用(Pf eifer-Sancar等人，BMC Genomics2013,14:888)，因此Pcg0007的预测-10元件(TAAGAT)中6个位置中有4个随机化产生更强和减弱的启动子变体(SEQ ID NO 1、5和7)。通过用Pcg0007Fwd(GGAAACGTCTGTATCGGATAAGTAG(SEQ ID NO:15))和Pc0007Rev(CTACTTATCCGATACAGACGTTTCCANNNNACACGCTTAGGTCCCCACGTAGTACCA(SEQ ID NO:16))PCR扩增pK18rep-Pc0007-eyf p，用DpnI(New England Biolabs)处理并使用Gibson Assembly方法用Gibson Assembly Master Mix(NEB)根据生产商说明书组装产生该文库。根据生产商说明书将Gibson Assembly反应物转化到NEB Turbo感受态细胞(New England Biolabs)内。用LB琼脂加25μg/mL卡那霉素选择转化株并通过Sanger测序表征单独菌落。通过刮削琼脂将菌落汇合并且使用Zyppy minipred试剂盒(Zymo Research)分离纯化的质粒DNA。

通过电穿孔将纯化报告载体质粒转化到谷氨酸棒杆菌NRRL B-11474中(Haynes等人，Journal of General Microbiology,1990)。用BHI琼脂加25μg/mL卡那霉素选择转化株。对于每次转化，挑选多个单菌落并接种到含300μL BHI培养基加25μg/mL卡那霉素的96中孔板块的单独孔内。通过在30℃下以1,000rpm振荡孵育48小时，使细胞生长至饱和。孵育后，以3,500rpm离心培养物5分钟并通过抽吸回收培养基。通过重新悬浮在300μL PBS中将细胞洗涤一次并且以3,500rpm离心5分钟，接着抽吸上清液且最终重新悬浮在300μL PBS中。将20μL这种混合物的等分试样转移到含有180μL PBS的96孔全部区域黑色、底部透明的测定板中。用SpectraMax M5酶标仪测量细胞在600nm下的光学密度并用TECAN M1000酶标仪通过在514nm下激发并且测量527nm下的发射来测量荧光。对于每个孔而言通过荧光除以光学密度计算标准化荧光活性。亲本质粒pK18rep充当阴性对照。比较报告构建体之间及生物学重复之间的标准化荧光活性(图2)。下面表5中呈现了启动子活性的数值汇总。

表5：在启动子的控制下表达黄色荧光蛋白的重组谷氨酸棒杆菌

实施例3：候选启动子向L-赖氨酸生物合成途径的应用

本公开的启动子用于在宿主细胞中产生生物分子的改进方法。本公开启动子的应用和使用实例涉及氨基酸L-赖氨酸的生成。图3呈现了生成L-赖氨酸的生物合成途径并且包括基因pck、odx、icd和hom(例如，高丝氨酸/苏氨酸合酶途径)，其转移来自该途径的中间产物，导致L-赖氨酸总产量降低。下面表3中提供了谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032中的符号、基因名称、酶委员会编号(EC编号)和图谱位置。

使用酵母同源重组克隆技术将包含与表3所提供的靶基因功能性连接的SEQ IDNO:1至8的启动子的重组载体克隆到棒杆菌克隆载体中以组装其中每个载体侧接正向重复区的载体以在谷氨酸棒杆菌中的靶基因座处提供同源重组。重组后，内源性启动子被与谷氨酸棒杆菌内源基因座中的各个靶基因功能性连接的SEQ ID NO:1至8的启动子。各种包含启动子和功能性连接的靶基因的靶向载体包括一系列范围为0.5Kb、1Kb、2Kb和5Kb的同源正向重复臂长。每个DNA插入序列都是通过使用商业来源的寡核苷酸和上述宿主菌株基因组DNA作为模板PCR扩增同源区产生的。要引入基因组内的启动子在寡核苷酸尾内编码。在酵母中使用同源重组将PCR片段组装成载体骨架。

最初使用标准热休克转化技术将载体转化到大肠杆菌内并且鉴定和验证正确组装的克隆物。测试经转化的大肠杆菌细菌组装成功。培养来自每个大肠杆菌转化板的四个菌落并通过PCR测试其正确组装。载体在大肠杆菌宿主内扩增以提供用于棒杆菌转化的载体DNA。

经验证的克隆物通过电穿孔转化到谷氨酸棒杆菌宿主细胞内。对于每次转化，根据插入片段大小来确定每μg的DNA的菌落形成单位(CFU)的数量。根据同源臂长分析棒杆菌基因组整合。臂越短，效率越低。

在含有5％蔗糖的培养基上培养鉴定为插入盒成功整合的棒杆菌培养物以反选sacb选择基因的环出序列(loop out)。各个同源正向重复臂的蔗糖抗性频率不会随臂长而显著变化。这些结果表明环出效率在0.5kb至5kb的同源臂长范围内保持稳定。

为了进一步验证环出序列事件，培养表现出蔗糖抗性的菌落并通过测序分析。下面表6中汇总了插入基因组区域的测序结果。

表6：环出验证频率

测序结果显示环出效率为10-20％。不受任何特定理论限制，环出可取决于插入序列。即使正确，挑选10-20个蔗糖抗性菌落也产生高成功率。

整合后，重组载体用选自由以下组成的组的启动子置换内源性启动子序列：Pcg1860(SEQ ID NO:2)、Pcg0007(SEQ ID NO:3)、Pcg0755(SEQ ID NO:4)、Pcg0007_lib_265(SEQ ID NO:5)、Pcg3381(SEQ ID NO:6)、Pcg007_lib_119(SEQ ID NO:7)和Pcg3121(SEQ ID NO:8)。下面表7中提供了所得重组菌株的列表。

挑选多个单菌落(表7中为N)，接种并作为小规模培养生长。在设计用于评估产物滴度性能的小规模培养中测试每个包含试验启动子的新建菌株的赖氨酸产量。使用来自工业规模培养的培养基进行小规模培养。在碳耗尽时(即，代表单批产量)用标准比色测定法光学测量产物滴度。简言之，制备浓缩测定混合物并添加到发酵样品中，使得试剂的最终浓度为160mM磷酸钠缓冲液、0.2mM Amplex Red、0.2U/mL辣根过氧化物酶和0.005U/mL赖氨酸氧化酶。反应继续完成并使用Tecan M1000板分光光度计在560nm波长下测量光学密度。

如表7所示，L-赖氨酸产量比非工程改造菌株增加24％以上(例如，重组菌株7000007840)。在其它实施方案中，L-赖氨酸的产量降低近90％(例如，重组菌株700000773)。如表7所提供，置换pgi和zwf的启动子导致L-赖氨酸的生成提高高于10％。

显著地，L-赖氨酸的生成不是简单依赖于并入最具活性的启动子。如图4所示，赖氨酸产量受相对较弱的启动子(例如，相对启动子表达为1、7x或48x的pgi，或相对启动子强度为7x的dapB)最大化或受中间表达(例如，相对启动子表达为454x的lysA)最大化。在某些情况下，当相对启动子强度最大化时(例如，ppc)表达最强。如图5所例示，基因途径中基因的定位(图3)无法可靠地预测L-赖氨酸产量的增加或降低或最佳启动子强度。例如，cg0931高水平表达引起产量提高，而更高水平的dapD未引起产量提高或降低。

表7：L-赖氨酸生物合成基因的表达改变的谷氨酸棒杆菌重组菌株

实施例4：工程改造L-赖氨酸生物合成途径

通过交换如表8所提供的靶基因的启动子对来改变L-赖氨酸的产量。使用实施例3的构建体制备如表8所提供的重组生物。如所示，Pcg0007-lysA和Pcg3121-pgi的重组提供了最高的L-赖氨酸产量。

表8：L-赖氨酸生物合成途径中靶基因的配对启动子交换

本说明书参考的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物以引用的方式整体并入本文，在一定程度上没有与本说明不一致。

从前述内容将认识到，虽然本文为了说明的目的已经描述了本文描述的具体实施方案，但在不背离本文描述的精神和范围的前提下可进行各种修改。因此，除所附权利要求外，本公开不受限制。

序列表

<110> 齐默尔根公司

<120> 来自谷氨酸棒杆菌的启动子

<130> ZMG-001/PCT

<140>

<141>

<150> 62/264,232

<151> 2015-12-07

<160> 16

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 97

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> 来源

<223> /注释="Pcg0007_39"

<400> 1

tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtat tatggaaacg 60

tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97

<210> 2

<211> 93

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> 来源

<223> /注释="Pcg1860"

<400> 2

cttagctttg acctgcacaa atagttgcaa attgtcccac atacacataa agtagcttgc 60

gtatttaaaa ttatgaacct aaggggttta gca 93

<210> 3

<211> 97

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> 来源

<223> /注释="Pcg0007"

<400> 3

tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtaa gatggaaacg 60

tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97

<210> 4

<211> 98

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> 来源

<223> /注释="Pcg0755"

<400> 4

aataaattta taccacacag tctattgcaa tagaccaagc tgttcagtag ggtgcatggg 60

agaagaattt cctaataaaa actcttaagg acctccaa 98

<210> 5

<211> 97

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> 来源

<223> /注释="Pcg0007_265"

<400> 5

tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtac gctggaaacg 60

tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97

<210> 6

<211> 86

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> 来源

<223> /注释="Pcg3381"

<400> 6

cgccggataa atgaattgat tattttaggc tcccagggat taagtctagg gtggaatgca 60

gaaatatttc ctacggaagg tccgtt 86

<210> 7

<211> 97

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> 来源

<223> /注释="Pcg0007_119"

<400> 7

tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgttg catggaaacg 60

tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97

<210> 8

<211> 87

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> 来源

<223> /注释="Pcg3121"

<400> 8

gtggctaaaa cttttggaaa cttaagttac ctttaatcgg aaacttattg aattcgggtg 60

aggcaactgc aactctggac ttaaagc 87

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 9

tcatgaccaa aatcccttaa cgtg 24

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 10

gcgtactctt cgatggtgaa aacatctc 28

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 11

gacctaaaat gtgtaaaggg caaagtgtat acaacaacaa gacccatcat agtttgc 57

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 12

cacgttaagg gattttggtc atgacacatg cagtcatgtc gtgc 44

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 13

gcttgcatgc ctgcaggtcg a 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 14

atggtgagca agggcgagga gc 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 15

ggaaacgtct gtatcggata agtag 25

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<220>

<221> 经修饰的碱基

<222> (27)..(30)

<223> a、c、t、g、未知的或其它

<400> 16

ctacttatcc gatacagacg tttccannnn acacgcttag gtccccacgt agtacca 57

Claims (19)

1.一种重组核酸分子，其包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组，与至少一个异源靶基因功能性连接的启动子多核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述启动子多核苷酸序列选自由SEQ IDNO:1、5和7组成的组。

3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其还包含接头寡核苷酸或接头多核苷酸。

4.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述至少一个异源靶基因是为产生生物分子的生物合成途径的组分的基因，所述生物分子选自由氨基酸、有机酸、蛋白质和聚合物组成的组。

5.根据权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述至少一个异源靶基因是为氨基酸生物合成途径的组分的基因，所述氨基酸生物合成途径选自由以下组成的组：

包含京都基因与基因组百科全书(KEGG)条目M00016的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00525的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00526的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00527的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M0030的基因的赖氨酸生物合成途径；

包含KEGG条目M00433的基因的赖氨酸生物合成途径；和

包含KEGG条目M0031的基因的赖氨酸生物合成途径。

6.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其还包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的一个或多个附加启动子多核苷酸序列，每个启动子与至少一个附加异源基因功能性连接。

7.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子是分离的。

8.一种重组载体，其包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组，与至少一个异源靶基因功能性连接的启动子多核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的重组载体，其中所述启动子多核苷酸序列选自由SEQ ID NO:1、5和7组成的组。

10.根据权利要求8或9所述的重组载体，其中所述靶基因是相同代谢途径的一部分。

11.根据权利要求8或9所述的重组载体，其中所述靶基因不是相同代谢途径的一部分。

12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的重组核酸分子或经根据权利要求8至11所述的重组载体转化。

13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其还包含根据权利要求1至7中任一项所述的一个或多个附加重组核酸分子或经根据权利要求8至11所述的一个或多个附加重组载体转化。

14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中根据权利要求1至7中任一项所述的一个或多个附加重组核酸分子或根据权利要求8至11所述的一个或多个附加重组载体与不同的异源靶基因功能性连接。

15.根据权利要求12所述的宿主细胞，其包含启动子多核苷酸序列的组合，其中每个所述启动子多核苷酸序列与不同的异源靶基因功能性连接。

16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中每个所述不同的异源靶基因是相同代谢途径的一部分。

17.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中每个所述不同的异源靶基因不是相同代谢途径的一部分。

18.根据权利要求12至17中任一项所述的宿主细胞，其属于棒杆菌属。

19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其为谷氨酸棒杆菌。