JP2001190290A - 遺伝子ｓｕｃＣおよびｓｕｃＤをコードする新規のヌクレオチド配列 - Google Patents
遺伝子ｓｕｃＣおよびｓｕｃＤをコードする新規のヌクレオチド配列Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 アミノ酸、特にＬ−リジン及びＬ−グルタメ
ートの発酵的製造改善のための新規措置の提供。 【解決手段】 ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の特定のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、 ｂ）上記アミノ酸配列に少なくとも７０％の同一性を有
するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌ
クレオチド、及び ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチド配列の少な
くとも１５個の連続したヌクレオチドを有するポリヌク
レオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを
有し、その際、有利には該ポリペプチドがスクシニル−
ＣｏＡシンセターゼの活性を示す、単離されたポリヌク
レオチド。
ートの発酵的製造改善のための新規措置の提供。 【解決手段】 ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の特定のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、 ｂ）上記アミノ酸配列に少なくとも７０％の同一性を有
するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌ
クレオチド、及び ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチド配列の少な
くとも１５個の連続したヌクレオチドを有するポリヌク
レオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを
有し、その際、有利には該ポリペプチドがスクシニル−
ＣｏＡシンセターゼの活性を示す、単離されたポリヌク
レオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の対象は、コリネ型細
菌からの遺伝子ｓｕｃＣおよびｓｕｃＤをコードするヌ
クレオチド配列およびｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓ
ｕｃＤ遺伝子を弱めた細菌の使用下でのアミノ酸、特に
Ｌ−リジンおよびＬ−グルタメートの発酵的使用であ
る。
菌からの遺伝子ｓｕｃＣおよびｓｕｃＤをコードするヌ
クレオチド配列およびｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓ
ｕｃＤ遺伝子を弱めた細菌の使用下でのアミノ酸、特に
Ｌ−リジンおよびＬ−グルタメートの発酵的使用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンおよびＬ
−グルタメートはヒトの医学および製薬工業において、
飼料工業、特に動物の栄養において使用される。
−グルタメートはヒトの医学および製薬工業において、
飼料工業、特に動物の栄養において使用される。
【０００３】アミノ酸はコリネ型細菌の株、特にコリネ
バクテリウム グルタミクム（Ｃ．グルタミクム）の発
酵によって製造できる。アミノ酸のその重大な重要性の
ために、製造プロセスの改善に絶えず努力が注がれてい
る。製造の改善は発酵技術的措置、例えば撹拌および酸
素の供給または栄養培地の組成、例えば発酵中の糖類濃
度または、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる
製品形への後処理、または微生物それ自体の固有の生産
量特性を含むことがある。
バクテリウム グルタミクム（Ｃ．グルタミクム）の発
酵によって製造できる。アミノ酸のその重大な重要性の
ために、製造プロセスの改善に絶えず努力が注がれてい
る。製造の改善は発酵技術的措置、例えば撹拌および酸
素の供給または栄養培地の組成、例えば発酵中の糖類濃
度または、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる
製品形への後処理、または微生物それ自体の固有の生産
量特性を含むことがある。
【０００４】突然変異誘発、選択および変異体の選択を
含む方法を使用して生産量特性を改善する。こうして代
謝拮抗物質に耐性であり、かつ調節に重要な代謝物質に
関して栄養要求性であり、かつアミノ酸を産生する菌株
が得られる。
含む方法を使用して生産量特性を改善する。こうして代
謝拮抗物質に耐性であり、かつ調節に重要な代謝物質に
関して栄養要求性であり、かつアミノ酸を産生する菌株
が得られる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題はアミノ
酸、特にＬ−リジンおよびＬ−グルタメートの発酵的製
造を改善するための新規の措置を提供することである。
酸、特にＬ−リジンおよびＬ−グルタメートの発酵的製
造を改善するための新規の措置を提供することである。
【０００６】以下にＬ−アミノ酸またはアミノ酸を挙げ
ているが、これらの用語は、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ト
レオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシ
ン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−
メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−
リジン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−アルギニンから
なる群から選択される１種以上のその塩を含むアミノ酸
を示すと解される。Ｌ−リジンおよびＬ−グルタメート
が特に有利である。
ているが、これらの用語は、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ト
レオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシ
ン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−
メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−
リジン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−アルギニンから
なる群から選択される１種以上のその塩を含むアミノ酸
を示すと解される。Ｌ−リジンおよびＬ−グルタメート
が特に有利である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％の同一
性を有するポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％の同一
性を有するポリヌクレオチド、 ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも７０％の同
一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｄ）配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも７０％の同
一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のポリヌクレオチドに
相補的なポリヌクレオチド、および ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）のポリヌクレオ
チド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを
有するポリヌクレオチド からなる群から選択されるポリヌクレオチドを有し、そ
の際、有利には該ポリペプチドがスクシニル−ＣｏＡシ
ンセターゼの活性を示す、単離されたポリヌクレオチド
を提供する。
コードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％の同一
性を有するポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％の同一
性を有するポリヌクレオチド、 ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも７０％の同
一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｄ）配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも７０％の同
一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のポリヌクレオチドに
相補的なポリヌクレオチド、および ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）のポリヌクレオ
チド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを
有するポリヌクレオチド からなる群から選択されるポリヌクレオチドを有し、そ
の際、有利には該ポリペプチドがスクシニル−ＣｏＡシ
ンセターゼの活性を示す、単離されたポリヌクレオチド
を提供する。
【０００８】また本発明は（ｉ）配列番号１に示される
ヌクレオチド配列、または（ｉｉ）遺伝コードの縮重の
範囲内で配列（ｉ）に相応する少なくとも１つの配列、
または（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な
配列とハイブリダイズする少なくとも１つの配列、およ
び場合により、（ｉｖ）（ｉ）中での機能的中立なセン
ス突然変異を有する、有利には複製可能なＤＮＡである
請求項１記載のポリヌクレオチドを提供する。
ヌクレオチド配列、または（ｉｉ）遺伝コードの縮重の
範囲内で配列（ｉ）に相応する少なくとも１つの配列、
または（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な
配列とハイブリダイズする少なくとも１つの配列、およ
び場合により、（ｉｖ）（ｉ）中での機能的中立なセン
ス突然変異を有する、有利には複製可能なＤＮＡである
請求項１記載のポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】更に本発明は配列番号１に示されるような
ヌクレオチド配列を有する請求項４記載のポリヌクレオ
チド、コリネ型細菌中で複製可能な、有利には組み換え
ＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド、本発
明によるポリヌクレオチドの部分を有するが、請求され
た配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有
するベクター、およびｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓ
ｕｃＤ遺伝子が、特に挿入または欠失によって減衰され
ているコリネ型細菌を提供する。
ヌクレオチド配列を有する請求項４記載のポリヌクレオ
チド、コリネ型細菌中で複製可能な、有利には組み換え
ＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド、本発
明によるポリヌクレオチドの部分を有するが、請求され
た配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有
するベクター、およびｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓ
ｕｃＤ遺伝子が、特に挿入または欠失によって減衰され
ているコリネ型細菌を提供する。
【００１０】更に本発明は、配列番号１に相当するポリ
ヌクレオチド配列を有する完全なｓｕｃＣ遺伝子および
／またはｓｕｃＤ遺伝子を有する相応の遺伝子ライブラ
リーを配列番号１による前記のポリヌクレオチドの配列
またはその断片を有するプローブとのハイブリダイゼー
ションによってスクリーニングすることによって得られ
るポリヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオ
チドを提供し、かつ前記のＤＮＡ配列の単離を提供す
る。
ヌクレオチド配列を有する完全なｓｕｃＣ遺伝子および
／またはｓｕｃＤ遺伝子を有する相応の遺伝子ライブラ
リーを配列番号１による前記のポリヌクレオチドの配列
またはその断片を有するプローブとのハイブリダイゼー
ションによってスクリーニングすることによって得られ
るポリヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオ
チドを提供し、かつ前記のＤＮＡ配列の単離を提供す
る。
【００１１】本発明による配列を有するポリヌクレオチ
ドはＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダ
イゼーションプローブとしてｃＤＮＡ、核酸および／ま
たはポリヌクレオチドまたはスクシニル−ＣｏＡシンセ
ターゼをコードするその全長の遺伝子ならびにスクシニ
ル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の配列に高い類似性を有
するｃＤＮＡまたは遺伝子の配列を単離するために適当
である。
ドはＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダ
イゼーションプローブとしてｃＤＮＡ、核酸および／ま
たはポリヌクレオチドまたはスクシニル−ＣｏＡシンセ
ターゼをコードするその全長の遺伝子ならびにスクシニ
ル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の配列に高い類似性を有
するｃＤＮＡまたは遺伝子の配列を単離するために適当
である。
【００１２】本発明による配列を有するポリヌクレオチ
ドは更にプライマーとしても適当であり、それを使用し
てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってスクシニル
−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子からＤＮＡを
製造できる。
ドは更にプライマーとしても適当であり、それを使用し
てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってスクシニル
−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子からＤＮＡを
製造できる。
【００１３】プローブまたはプライマーとして役に立つ
このようなオリゴヌクレオチドは少なくとも３０個、有
利には少なくとも２０個、より特に有利には少なくとも
１５個の連続したヌクレオチドを有する。少なくとも４
０または５０のヌクレオチド長を有するヌクレオチドも
適当である。
このようなオリゴヌクレオチドは少なくとも３０個、有
利には少なくとも２０個、より特に有利には少なくとも
１５個の連続したヌクレオチドを有する。少なくとも４
０または５０のヌクレオチド長を有するヌクレオチドも
適当である。
【００１４】“単離された”とはその自然環境から分離
されたことを意味する。
されたことを意味する。
【００１５】“ポリヌクレオチド”は一般にポリリボヌ
クレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドを示
し、本明細書においてはこれらの用語は非修飾ＲＮＡも
しくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡを示して
よい。
クレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドを示
し、本明細書においてはこれらの用語は非修飾ＲＮＡも
しくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡを示して
よい。
【００１６】用語“ポリペプチド”とはペプチド結合を
介して結合した２個以上のアミノ酸を有するペプチドま
たはタンパク質であると解される。
介して結合した２個以上のアミノ酸を有するペプチドま
たはタンパク質であると解される。
【００１７】本発明によるポリペプチドは配列番号２お
よび配列番号３によるポリペプチド、特にスクシニル−
ＣｏＡシンセターゼの生物学的活性を有するポリペプチ
ドならびに配列番号２または配列番号３によるポリペプ
チドに少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、
特に有利には少なくとも９０〜９５％の同一性を有する
前記の活性を有するポリペプチドを含む。
よび配列番号３によるポリペプチド、特にスクシニル−
ＣｏＡシンセターゼの生物学的活性を有するポリペプチ
ドならびに配列番号２または配列番号３によるポリペプ
チドに少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、
特に有利には少なくとも９０〜９５％の同一性を有する
前記の活性を有するポリペプチドを含む。
【００１８】更に本発明は、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ト
レオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシ
ン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−
メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−
リジン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−アルギニン、特
にＬ−リジンおよびＬ−グルタメートからなる群から選
択されるアミノ酸を、特に既にアミノ酸、特にＬ−リジ
ンおよび／またはＬ−グルタメートを生産し、かつｓｕ
ｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺伝子が減衰、特に
低いレベルで発現するコリネ型細菌を使用して発酵的に
製造するための方法に関する。
レオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシ
ン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−
メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−
リジン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−アルギニン、特
にＬ−リジンおよびＬ−グルタメートからなる群から選
択されるアミノ酸を、特に既にアミノ酸、特にＬ−リジ
ンおよび／またはＬ−グルタメートを生産し、かつｓｕ
ｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺伝子が減衰、特に
低いレベルで発現するコリネ型細菌を使用して発酵的に
製造するための方法に関する。
【００１９】用語“減衰”は本明細書においては相応の
ＤＮＡによってコードされうる微生物の１種以上の酵素
（タンパク質）の細胞内活性を、例えば弱いプロモータ
ーまたは低い活性を有する相応の酵素をコードし、かつ
／または相応の遺伝子または酵素（タンパク質）を不活
性化する遺伝子および／または対立遺伝子および場合に
よりこれらの機能を組み合わせることによって低下また
はスイッチオフすることを記載している。
ＤＮＡによってコードされうる微生物の１種以上の酵素
（タンパク質）の細胞内活性を、例えば弱いプロモータ
ーまたは低い活性を有する相応の酵素をコードし、かつ
／または相応の遺伝子または酵素（タンパク質）を不活
性化する遺伝子および／または対立遺伝子および場合に
よりこれらの機能を組み合わせることによって低下また
はスイッチオフすることを記載している。
【００２０】本発明の対象の微生物はアミノ酸、特にＬ
−リジンをグルコース、スクロース、ラクトース、フル
クトース、マルトース、蜜ろう、デンプン、セルロース
からか、またはグリセロールおよびエタノールから産生
できる。該微生物はコリネ型細菌の種類、特にコリネバ
クテリウム属の種類であってよい。コリネバクテリウム
属において、特にコリネバクテリウム グルタミクムの
種類が挙げられるべきであり、これはそのＬ−アミノ酸
産生能に関して当業者に知られている。
−リジンをグルコース、スクロース、ラクトース、フル
クトース、マルトース、蜜ろう、デンプン、セルロース
からか、またはグリセロールおよびエタノールから産生
できる。該微生物はコリネ型細菌の種類、特にコリネバ
クテリウム属の種類であってよい。コリネバクテリウム
属において、特にコリネバクテリウム グルタミクムの
種類が挙げられるべきであり、これはそのＬ−アミノ酸
産生能に関して当業者に知られている。
【００２１】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム グルタミクムの種類の適当な株は、特に以下の
公知の野生型の菌株： コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５
８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム メラッセコラＡＴＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム サーモアミノゲネスＦＥＲＭ ＢＰ
−１５３９ ブレビバクテリウム フラブムＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム ディヴァリカツムＡＴＣＣ１４０
２０ であり、これらから得られるＬ−アミノ酸を生産する突
然変異体および／または株、例えばＬ−リジン産生株： コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ１７０
９ ブレビバクテリウム フラブムＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＦＥＲＭ−
Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ６４６
３ コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ６４６
４ コリネバクテリウム グルタミクムＤＳＭ−Ｐ５７１４ である。
リウム グルタミクムの種類の適当な株は、特に以下の
公知の野生型の菌株： コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５
８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム メラッセコラＡＴＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム サーモアミノゲネスＦＥＲＭ ＢＰ
−１５３９ ブレビバクテリウム フラブムＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム ディヴァリカツムＡＴＣＣ１４０
２０ であり、これらから得られるＬ−アミノ酸を生産する突
然変異体および／または株、例えばＬ−リジン産生株： コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ１７０
９ ブレビバクテリウム フラブムＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＦＥＲＭ−
Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ６４６
３ コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ６４６
４ コリネバクテリウム グルタミクムＤＳＭ−Ｐ５７１４ である。
【００２２】酵素スクシニル−ＣｏＡシンセターゼ（Ｅ
Ｃ６．２．１．５）をコードする新規の遺伝子ｓｕｃＣ
およびｓｕｃＤはＣ．グルタミクムから単離されてい
る。
Ｃ６．２．１．５）をコードする新規の遺伝子ｓｕｃＣ
およびｓｕｃＤはＣ．グルタミクムから単離されてい
る。
【００２３】ｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺
伝子またはＣ．グルタミクムからの他の遺伝子を単離す
るために該微生物の遺伝子ライブラリーをまずＥ．コリ
中で培養する。遺伝子ライブラリーの培養は一般に公知
のテキストブックおよびハンドブックに記載されてい
る。例としては、ヴィナッカー：遺伝子およびクロー
ン、遺伝子技術における導入（Winnacker: Gene und Kl
one, Eine Einfuehrung indie Gentechnologie）（ヒェ
ミー出版（Verlag Chemie）、ヴァインハイム、ドイ
ツ、１９９０）によるテキストブックまたはサンブロー
ク他：モレキュラークローニング、研究室のマニュアル
（Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual）（コールドスプリングハーバー研究室プレス
（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８
９）によるハンドブックが挙げられる。非常によく知ら
れた遺伝子ライブラリーは、λ−ベクターにおいてコハ
ラ他（細胞５０（Cell 50），４９５−５０８（１９８
７））によって培養されているＥ．コリ Ｋ−１２株Ｗ
３１１０のライブラリーである。バーゼ他（Bathe et a
l）（分子遺伝学および一般遺伝学（Molecular and Gen
eral Genetics）、２５２：２５５−２６５）はＥ．コ
リ Ｋ−１２株ＮＭ５５４（ラライヒ他（Raleigh et a
l）、１９８８、核酸リサーチ１６（Nucleic Acids Res
earch 16）：１５６３−１５７５）においてコスミドベ
クターＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（ヴァール他（Wahl eta
l）、１９８７，国立科学アカデミーＵＳＡの処置（Pro
ceedings of the National Academy of Sciences US
A）、８４：２１６０−２１６４）を使用して培養され
ているＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２からの遺伝
子ライブラリーを記載している。
伝子またはＣ．グルタミクムからの他の遺伝子を単離す
るために該微生物の遺伝子ライブラリーをまずＥ．コリ
中で培養する。遺伝子ライブラリーの培養は一般に公知
のテキストブックおよびハンドブックに記載されてい
る。例としては、ヴィナッカー：遺伝子およびクロー
ン、遺伝子技術における導入（Winnacker: Gene und Kl
one, Eine Einfuehrung indie Gentechnologie）（ヒェ
ミー出版（Verlag Chemie）、ヴァインハイム、ドイ
ツ、１９９０）によるテキストブックまたはサンブロー
ク他：モレキュラークローニング、研究室のマニュアル
（Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual）（コールドスプリングハーバー研究室プレス
（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８
９）によるハンドブックが挙げられる。非常によく知ら
れた遺伝子ライブラリーは、λ−ベクターにおいてコハ
ラ他（細胞５０（Cell 50），４９５−５０８（１９８
７））によって培養されているＥ．コリ Ｋ−１２株Ｗ
３１１０のライブラリーである。バーゼ他（Bathe et a
l）（分子遺伝学および一般遺伝学（Molecular and Gen
eral Genetics）、２５２：２５５−２６５）はＥ．コ
リ Ｋ−１２株ＮＭ５５４（ラライヒ他（Raleigh et a
l）、１９８８、核酸リサーチ１６（Nucleic Acids Res
earch 16）：１５６３−１５７５）においてコスミドベ
クターＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（ヴァール他（Wahl eta
l）、１９８７，国立科学アカデミーＵＳＡの処置（Pro
ceedings of the National Academy of Sciences US
A）、８４：２１６０−２１６４）を使用して培養され
ているＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２からの遺伝
子ライブラリーを記載している。
【００２４】またベルマン他（Boermann et al）（分子
微生物学（Molecular Microbiology）６（３）、３１７
−３２６（１９９２））は、コスミドｐＨＣ７９（ホー
ンおよびコリンズ（Hohn and Collins）、遺伝子１１
（Gene 11）、２９１−２９８（１９８０））を使用し
てＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２から得られた遺
伝子ライブラリーを記載している。オードノヒュー（O'
Donohue）（コリネバクテリウム グルタミクムからの４
つの共通の芳香族アミノ酸生合成遺伝子のクローニング
および分子分析（The Cloning and Molecular Analysis
of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic G
enes from Corynebacterium glutamicum）、ｐｈ．Ｄ．
セシス、アイルランド国立大学、ガルウェイ（ph. D. T
hesis, National University of Ireland, Galway）、
１９９７）は、ショート他（Shortet al）（核酸リサー
チ、１６：７５８３）によって記載されているλ Ｚａ
ｐ発現システム（λ Zap Expression system）を使用す
るＣ．グルタミクム遺伝子のクローニングを記載してい
る。
微生物学（Molecular Microbiology）６（３）、３１７
−３２６（１９９２））は、コスミドｐＨＣ７９（ホー
ンおよびコリンズ（Hohn and Collins）、遺伝子１１
（Gene 11）、２９１−２９８（１９８０））を使用し
てＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２から得られた遺
伝子ライブラリーを記載している。オードノヒュー（O'
Donohue）（コリネバクテリウム グルタミクムからの４
つの共通の芳香族アミノ酸生合成遺伝子のクローニング
および分子分析（The Cloning and Molecular Analysis
of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic G
enes from Corynebacterium glutamicum）、ｐｈ．Ｄ．
セシス、アイルランド国立大学、ガルウェイ（ph. D. T
hesis, National University of Ireland, Galway）、
１９９７）は、ショート他（Shortet al）（核酸リサー
チ、１６：７５８３）によって記載されているλ Ｚａ
ｐ発現システム（λ Zap Expression system）を使用す
るＣ．グルタミクム遺伝子のクローニングを記載してい
る。
【００２５】Ｅ．コリにおいてＣ．グルタミクムからの
遺伝子ライブラリーを作成するために、プラスミド、例
えばｐＢＲ３２２（ボリヴァー他、ライフサイエンス
（Bolivar, Life Sciences）、２５，８０７−８１８
（１９７９））またはｐＵＣ９（ヴィエイラ他（Vieira
et al）、１９８２，遺伝子、１９：２５９−２６８）
を使用してもよい。制限性および組み換え系が欠如した
Ｅ．コリ株、例えば株ＤＨ５α（ジェフリー Ｈ．ミラ
ー：“細菌遺伝学のショートコース、大腸菌および関連
の細菌のための研究室のマニュアルおよびハンドブッ
ク”、コールドスプリングハーバー研究室プレス、１９
９２（Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacter
ial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for
Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spri
ng Harbour Laboratory Press））が宿主として特に適
当である。
遺伝子ライブラリーを作成するために、プラスミド、例
えばｐＢＲ３２２（ボリヴァー他、ライフサイエンス
（Bolivar, Life Sciences）、２５，８０７−８１８
（１９７９））またはｐＵＣ９（ヴィエイラ他（Vieira
et al）、１９８２，遺伝子、１９：２５９−２６８）
を使用してもよい。制限性および組み換え系が欠如した
Ｅ．コリ株、例えば株ＤＨ５α（ジェフリー Ｈ．ミラ
ー：“細菌遺伝学のショートコース、大腸菌および関連
の細菌のための研究室のマニュアルおよびハンドブッ
ク”、コールドスプリングハーバー研究室プレス、１９
９２（Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacter
ial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for
Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spri
ng Harbour Laboratory Press））が宿主として特に適
当である。
【００２６】プラスミドまたは他のλ−ベクターを使用
してクローニングされた長いＤＮＡ断片をＤＮＡ配列決
定のために適当な利用しやすいベクター中にサブクロー
ニングしてよい。
してクローニングされた長いＤＮＡ断片をＤＮＡ配列決
定のために適当な利用しやすいベクター中にサブクロー
ニングしてよい。
【００２７】ＤＮＡ配列決定のための方法は就中、サン
ガー他（アメリカ合衆国の国立科学アカデミーの処置、
７４：５４６３−５４６７，１９７７）によって記載さ
れている。
ガー他（アメリカ合衆国の国立科学アカデミーの処置、
７４：５４６３−５４６７，１９７７）によって記載さ
れている。
【００２８】得られたＤＮＡ配列を公知のアルゴリズム
および／または配列分析プログラム、例えばスタデン
（Staden）のプログラム（核酸リサーチ１４，２１７−
２３２（１９８６））、ブトラー（Butler）のＧＣＧ−
プログラム（生化学分析の方法３９（Methods of Bioch
emical Analysis 39），７４−９７（１９９８））、ピ
アーソンおよびリップマン（Pearson and Lipman）のＦ
ＡＳＴＡアルゴリズム（アメリカ合衆国の国立科学アカ
デミーの処置、８５，２４４４−２４４８（１９８
８））またはアルチュル他（Altschul et al）のＢＬＡ
ＳＴアルゴリズム（ネイチャージェネティクス６（Natu
re Genetics 6），１１９−１２９（１９９４））によ
って調査してよく、公的にアクセス可能なデータバンク
に列記される配列エントリーと比較してもよい。ヌクレ
オチド配列のための公共にアクセス可能なデータバンク
は、例えば欧州分子生物学研究所（European Molecular
Biologies Laboratories）（ＥＭＢＬ、ハイデルベル
ク、ドイツ）または生物学的情報のための国立センター
（National Center for Biotechnology Information）
（ＮＣＢＩ、ベテスダ、ＭＤ、ＵＳＡ）のデータバンク
である。
および／または配列分析プログラム、例えばスタデン
（Staden）のプログラム（核酸リサーチ１４，２１７−
２３２（１９８６））、ブトラー（Butler）のＧＣＧ−
プログラム（生化学分析の方法３９（Methods of Bioch
emical Analysis 39），７４−９７（１９９８））、ピ
アーソンおよびリップマン（Pearson and Lipman）のＦ
ＡＳＴＡアルゴリズム（アメリカ合衆国の国立科学アカ
デミーの処置、８５，２４４４−２４４８（１９８
８））またはアルチュル他（Altschul et al）のＢＬＡ
ＳＴアルゴリズム（ネイチャージェネティクス６（Natu
re Genetics 6），１１９−１２９（１９９４））によ
って調査してよく、公的にアクセス可能なデータバンク
に列記される配列エントリーと比較してもよい。ヌクレ
オチド配列のための公共にアクセス可能なデータバンク
は、例えば欧州分子生物学研究所（European Molecular
Biologies Laboratories）（ＥＭＢＬ、ハイデルベル
ク、ドイツ）または生物学的情報のための国立センター
（National Center for Biotechnology Information）
（ＮＣＢＩ、ベテスダ、ＭＤ、ＵＳＡ）のデータバンク
である。
【００２９】ｓｕｃＣ遺伝子およびｓｕｃＤ遺伝子をコ
ードするＣ．グルタミクムの新規のＤＮＡ配列が見いだ
され、かつ本発明の部分である配列番号１として見いだ
された。更に相応のタンパク質のアミノ酸配列は現存の
ＤＮＡ配列から前記の方法を使用して得られる。得られ
たｓｕｃＣ遺伝子およびｓｕｃＤ遺伝子の生成物のアミ
ノ酸配列を配列番号２および配列番号３に示す。
ードするＣ．グルタミクムの新規のＤＮＡ配列が見いだ
され、かつ本発明の部分である配列番号１として見いだ
された。更に相応のタンパク質のアミノ酸配列は現存の
ＤＮＡ配列から前記の方法を使用して得られる。得られ
たｓｕｃＣ遺伝子およびｓｕｃＤ遺伝子の生成物のアミ
ノ酸配列を配列番号２および配列番号３に示す。
【００３０】遺伝コードの縮重のために配列番号１に由
来するコーディングＤＮＡ配列も本発明の対象である。
同様に配列番号１または配列番号１の部分とハイブリダ
イズするＤＮＡ配列は本発明の対象である。最後に、配
列番号１から得られるプライマーを使用するポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作成されるＤＮＡ配列も
本発明の対象である。
来するコーディングＤＮＡ配列も本発明の対象である。
同様に配列番号１または配列番号１の部分とハイブリダ
イズするＤＮＡ配列は本発明の対象である。最後に、配
列番号１から得られるプライマーを使用するポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作成されるＤＮＡ配列も
本発明の対象である。
【００３１】当業者は、就中ベーリンガーマンハイムＧ
ｍｂＨ（マンハイム、ドイツ、１９９３）によって発行
されたハンドブック“フィルターハイブリダイゼーショ
ンのためのＤＩＧシステムユーザーズガイド（The DIG
System User's Guide for Filter Hybridization）”お
よびリーブル他（Liebl et al）（系統細菌学の国際ジ
ャーナル（International Journal of Systematic Bact
eriology）（１９９１）４１：２５５−２６０）におい
てハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の同定にお
ける情報を見いだしうる。ハイブリダイゼーションは、
ストリンジェントな条件で実施する、換言するとプロー
ブと標的配列、すなわちプローブで処理されるポリヌク
レオチドとが少なくとも７０％の同一性を有するハイブ
リッドだけが形成する。洗浄工程を含む完全なハイブリ
ダイゼーションを実施するか、またはバッファー組成、
温度および塩濃度を変化させることによって決定するこ
とさえも公知である。有利にはハイブリダイゼーション
反応は洗浄工程と比較して比較的低い程度の完全性で実
施する（ハイバイド ハイブリダイゼーションガイド（H
ybaid Hybridisation Guide）、ハイバイド リミテッ
ド、テディントン（Hybaid Limited, Teddington）、Ｕ
Ｋ、１９９６）。
ｍｂＨ（マンハイム、ドイツ、１９９３）によって発行
されたハンドブック“フィルターハイブリダイゼーショ
ンのためのＤＩＧシステムユーザーズガイド（The DIG
System User's Guide for Filter Hybridization）”お
よびリーブル他（Liebl et al）（系統細菌学の国際ジ
ャーナル（International Journal of Systematic Bact
eriology）（１９９１）４１：２５５−２６０）におい
てハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の同定にお
ける情報を見いだしうる。ハイブリダイゼーションは、
ストリンジェントな条件で実施する、換言するとプロー
ブと標的配列、すなわちプローブで処理されるポリヌク
レオチドとが少なくとも７０％の同一性を有するハイブ
リッドだけが形成する。洗浄工程を含む完全なハイブリ
ダイゼーションを実施するか、またはバッファー組成、
温度および塩濃度を変化させることによって決定するこ
とさえも公知である。有利にはハイブリダイゼーション
反応は洗浄工程と比較して比較的低い程度の完全性で実
施する（ハイバイド ハイブリダイゼーションガイド（H
ybaid Hybridisation Guide）、ハイバイド リミテッ
ド、テディントン（Hybaid Limited, Teddington）、Ｕ
Ｋ、１９９６）。
【００３２】例えば５×ＳＳＣ−バッファーをハイブリ
ダイゼーション反応のために約５０〜６８℃の温度で使
用してよい。本明細書においてはプローブはプローブの
配列に７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドと
ハイブリダイズされてよい。かかるハイブリッドは殆ど
安定でなく、ストリンジェントな条件下に洗浄によって
除去される。これは、例えば塩濃度を２×ＳＳＣおよび
場合により０．５×ＳＳＣに低減することによって実施
し（フィルターハイブリダイゼーションのためのＤＩＧ
システムユーザーズガイド、ベーリンガーマンハイム、
マンハイム、ドイツ、１９９５）、その際、約５０〜６
８℃の温度を維持する。また場合により塩濃度を０．１
×ＳＳＣに低減することもできる。５０℃から６８℃に
約１〜２℃ずつハイブリダイゼーション温度を徐々に上
昇させることによって、例えば使用されるプローブの配
列に少なくとも７０％または少なくとも８０％または少
なくとも９０〜９５％の同一性を有するポリヌクレオチ
ド断片を分離することができる。ハイブリダイゼーショ
ンのための更なる指示は、いわゆるキットの形で市販さ
れている（例えばロッヒェディアグノスティックスＧｍ
ｂＨ、マンハイム、ドイツのＤＩＧイージーＨｙｂ（DI
G Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, M
annheim, Germany）、カタログ番号１６０３５５８）。
ダイゼーション反応のために約５０〜６８℃の温度で使
用してよい。本明細書においてはプローブはプローブの
配列に７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドと
ハイブリダイズされてよい。かかるハイブリッドは殆ど
安定でなく、ストリンジェントな条件下に洗浄によって
除去される。これは、例えば塩濃度を２×ＳＳＣおよび
場合により０．５×ＳＳＣに低減することによって実施
し（フィルターハイブリダイゼーションのためのＤＩＧ
システムユーザーズガイド、ベーリンガーマンハイム、
マンハイム、ドイツ、１９９５）、その際、約５０〜６
８℃の温度を維持する。また場合により塩濃度を０．１
×ＳＳＣに低減することもできる。５０℃から６８℃に
約１〜２℃ずつハイブリダイゼーション温度を徐々に上
昇させることによって、例えば使用されるプローブの配
列に少なくとも７０％または少なくとも８０％または少
なくとも９０〜９５％の同一性を有するポリヌクレオチ
ド断片を分離することができる。ハイブリダイゼーショ
ンのための更なる指示は、いわゆるキットの形で市販さ
れている（例えばロッヒェディアグノスティックスＧｍ
ｂＨ、マンハイム、ドイツのＤＩＧイージーＨｙｂ（DI
G Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, M
annheim, Germany）、カタログ番号１６０３５５８）。
【００３３】当業者はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
によるＤＮＡ配列の増幅の詳細は、就中ガイト（Gait）
によるハンドブック：オリゴヌクレオチド合成：実践的
アプローチ（Oligonucleotide synthesis: A Practical
Approach）（ＩＲＬプレス、オックスフォード、Ｕ
Ｋ、１９８４）およびニュートンおよびグラハム（Newt
on and Graham）：ＰＣＲ（スペクトラム アカデミッシ
ュ出版（Spektrum Akademischer Verlag）、ハイデルベ
ルク、ドイツ、１９９４）において見いだすことができ
る。
によるＤＮＡ配列の増幅の詳細は、就中ガイト（Gait）
によるハンドブック：オリゴヌクレオチド合成：実践的
アプローチ（Oligonucleotide synthesis: A Practical
Approach）（ＩＲＬプレス、オックスフォード、Ｕ
Ｋ、１９８４）およびニュートンおよびグラハム（Newt
on and Graham）：ＰＣＲ（スペクトラム アカデミッシ
ュ出版（Spektrum Akademischer Verlag）、ハイデルベ
ルク、ドイツ、１９９４）において見いだすことができ
る。
【００３４】本明細書においてはコリネ型細菌がアミノ
酸、特にＬ−リジンをｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓ
ｕｃＤ遺伝子の減衰後に改善されて産生することが見い
だされた。
酸、特にＬ−リジンをｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓ
ｕｃＤ遺伝子の減衰後に改善されて産生することが見い
だされた。
【００３５】かかる減衰を達成するために、ｓｕｃＣ遺
伝子および／またはｓｕｃＤ遺伝子の発現または酵素タ
ンパク質の触媒特性のいずれかを低減させるか、または
スイッチオフしてよい。両者の措置を場合により組み合
わせてよい。
伝子および／またはｓｕｃＤ遺伝子の発現または酵素タ
ンパク質の触媒特性のいずれかを低減させるか、または
スイッチオフしてよい。両者の措置を場合により組み合
わせてよい。
【００３６】遺伝子発現の低下は適当な培地条件または
遺伝子発現のシグナル構造の遺伝子的変化（突然変異）
によって達成してよい。遺伝子発現のシグナル構造は、
例えば抑制遺伝子、アクチベーター遺伝子、オペレータ
ー、プロモーター、アテニュエーター、リボソーム結合
部位、開始コドンおよびターミネーターである。当業者
は、例えば特許出願ＷＯ９６／１５２４６号、ボイドお
よびマーフィー（Boydand Murphy）（ジャーナルオブバ
クテリオロジー１７０（Journal of Bacteriology）：
５９４９（１９８８））、ヴォスキルおよびカンブリス
（Voskuil andChambliss）（核酸リサーチ２６：３５４
８（１９９８））、ヤンセンおよびハンマー（Jensen a
nd Hammer）（バイオテクノロジーおよびバイオエンジ
ニアリング（Biotechnology and Bioengineering）５
８：１９１（１９９８））、パテック他（Patek et a
l）（微生物学（Microbiology）１４２：１２９７（１
９９６））ならびに遺伝学および分子生物学における公
知のテキストブック、例えばニッパーズ（Knippers）に
よるテキストブック（“分子遺伝学”、第６版、ゲオル
グ出版、シュトゥットガルト、ドイツ、１９９５）また
はヴィナッカーによるテキストブック（“遺伝子および
クローン”、ＶＣＨ出版会社、ヴァインハイム、ドイ
ツ、１９９０）において前記の情報を見いだすことがで
きる。
遺伝子発現のシグナル構造の遺伝子的変化（突然変異）
によって達成してよい。遺伝子発現のシグナル構造は、
例えば抑制遺伝子、アクチベーター遺伝子、オペレータ
ー、プロモーター、アテニュエーター、リボソーム結合
部位、開始コドンおよびターミネーターである。当業者
は、例えば特許出願ＷＯ９６／１５２４６号、ボイドお
よびマーフィー（Boydand Murphy）（ジャーナルオブバ
クテリオロジー１７０（Journal of Bacteriology）：
５９４９（１９８８））、ヴォスキルおよびカンブリス
（Voskuil andChambliss）（核酸リサーチ２６：３５４
８（１９９８））、ヤンセンおよびハンマー（Jensen a
nd Hammer）（バイオテクノロジーおよびバイオエンジ
ニアリング（Biotechnology and Bioengineering）５
８：１９１（１９９８））、パテック他（Patek et a
l）（微生物学（Microbiology）１４２：１２９７（１
９９６））ならびに遺伝学および分子生物学における公
知のテキストブック、例えばニッパーズ（Knippers）に
よるテキストブック（“分子遺伝学”、第６版、ゲオル
グ出版、シュトゥットガルト、ドイツ、１９９５）また
はヴィナッカーによるテキストブック（“遺伝子および
クローン”、ＶＣＨ出版会社、ヴァインハイム、ドイ
ツ、１９９０）において前記の情報を見いだすことがで
きる。
【００３７】酵素タンパク質の触媒特性の変更および／
または低減をもたらす突然変異は先行技術から公知であ
る；例としてはクイおよびグッドマン（Qui and Goodme
n）によって実施された研究（ジャーナルオブバイオロ
ジカルケミストリー（Journal of Biological Chemistr
y）２７２：８６１１−８６１７（１９９７））、スギ
モト他（生物科学 生物工学および生物化学（Bioscien
ce Biotechnology andBiochemistry）６１：１７６０−
１７６２（１９９７））およびメッケル（Moeckel）
（“コリネバクテリウム グルタミクムからのトレオニ
ンデヒドラターゼ：アロステリック調節の停止ならびに
酵素の構造（Die Threonin Dehydratase aus Corynebac
terium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Re
gulation und Struktur des Enzyms）”）、ユーリクス
リサーチセンター（Juelichs Research Centre）、Ｊ
ｕｅｌ−２９０６，ＩＳＳＮ０９４４２９５２、ユーリ
ッヒ、ドイツ、１９９４）が挙げられる。概要は遺伝学
および分子生物学における公知のテキストブック、例え
ばハーゲマン（Hagemann）（“一般遺伝学”グスタフフ
ィッシャー出版（Gustav Fischer Verlag）、シュトゥ
ットガルト、１９８６）によるテキストブックから得ら
れる。
または低減をもたらす突然変異は先行技術から公知であ
る；例としてはクイおよびグッドマン（Qui and Goodme
n）によって実施された研究（ジャーナルオブバイオロ
ジカルケミストリー（Journal of Biological Chemistr
y）２７２：８６１１−８６１７（１９９７））、スギ
モト他（生物科学 生物工学および生物化学（Bioscien
ce Biotechnology andBiochemistry）６１：１７６０−
１７６２（１９９７））およびメッケル（Moeckel）
（“コリネバクテリウム グルタミクムからのトレオニ
ンデヒドラターゼ：アロステリック調節の停止ならびに
酵素の構造（Die Threonin Dehydratase aus Corynebac
terium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Re
gulation und Struktur des Enzyms）”）、ユーリクス
リサーチセンター（Juelichs Research Centre）、Ｊ
ｕｅｌ−２９０６，ＩＳＳＮ０９４４２９５２、ユーリ
ッヒ、ドイツ、１９９４）が挙げられる。概要は遺伝学
および分子生物学における公知のテキストブック、例え
ばハーゲマン（Hagemann）（“一般遺伝学”グスタフフ
ィッシャー出版（Gustav Fischer Verlag）、シュトゥ
ットガルト、１９８６）によるテキストブックから得ら
れる。
【００３８】突然変異はトランジション、トランスバー
ジョン、挿入および欠失として現象に及んでいる。アミ
ノ酸交換の酵素活性における効果に依存して、ミスセン
ス突然変異またはナンセンス突然変異と呼ばれる。遺伝
子における少なくとも１個の塩基対の挿入または欠失は
フレームシフト突然変異をもたらし、その結果として誤
ったアミノ酸が導入されるか、または翻訳が早期に阻止
される。幾つかのコドンの欠失は典型的に酵素活性の完
全な抑制をもたらす。このような突然変異誘発の詳細は
従来の技術部分であり、かつ遺伝学および分子生物学に
おける公知のテキストブック、例えばニッパーによるテ
キストブック（“分子生物学”、第６版、ゲオルグ出
版、シュトゥットガルト、ドイツ、１９９５）、ヴィナ
ッカーによるテキストブック（“遺伝子およびクロー
ン”、ＶＣＨ出版会社、ヴァインハイム、ドイツ、１９
９０）またはハーゲマンによるテキストブック（“一般
遺伝学”、グスタフ フィッシャー出版、シュトゥット
ガルト、１９８６）から得ることができる。
ジョン、挿入および欠失として現象に及んでいる。アミ
ノ酸交換の酵素活性における効果に依存して、ミスセン
ス突然変異またはナンセンス突然変異と呼ばれる。遺伝
子における少なくとも１個の塩基対の挿入または欠失は
フレームシフト突然変異をもたらし、その結果として誤
ったアミノ酸が導入されるか、または翻訳が早期に阻止
される。幾つかのコドンの欠失は典型的に酵素活性の完
全な抑制をもたらす。このような突然変異誘発の詳細は
従来の技術部分であり、かつ遺伝学および分子生物学に
おける公知のテキストブック、例えばニッパーによるテ
キストブック（“分子生物学”、第６版、ゲオルグ出
版、シュトゥットガルト、ドイツ、１９９５）、ヴィナ
ッカーによるテキストブック（“遺伝子およびクロー
ン”、ＶＣＨ出版会社、ヴァインハイム、ドイツ、１９
９０）またはハーゲマンによるテキストブック（“一般
遺伝学”、グスタフ フィッシャー出版、シュトゥット
ガルト、１９８６）から得ることができる。
【００３９】Ｃ．グルタミクムの遺伝子の突然変異の慣
用の方法はシュヴァルツァーおよびピューラー（Schwar
zer and Puehler）（バイオ／テクノロジー９，８４−
８７（１９９１））によって記載される遺伝子破壊およ
び遺伝子置換の方法である。
用の方法はシュヴァルツァーおよびピューラー（Schwar
zer and Puehler）（バイオ／テクノロジー９，８４−
８７（１９９１））によって記載される遺伝子破壊およ
び遺伝子置換の方法である。
【００４０】遺伝子破壊の方法において、関連の遺伝子
のコーディング領域の中心部分を、宿主（典型的にＥ．
コリ）中で複製できるが、Ｃ．グルタミクム中ではでき
ないプラスミドベクター中にクローニングする。使用で
きるベクターは、例えばｐＳＵＰ３０１（サイモン他
（Simon et al）、バイオ／テクノロジー１，７８４−
７９１（１９８３））、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９
ｍｏｂ（シャファー他（Schaefer et al）、遺伝子１４
５、６９−７３（１９９４））、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃ
ＢまたはｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（ジェガー他（Jaeger
et al）、ジャーナルオブバクテリオロジー１７４：５
４６２−６５（１９９２））、ｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ
コーポレーション、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）、ｐＣＲ
２．１−ＴＯＰＯ（シューマン（１９９４）．ジャーナ
ルオブバイオロジカルケミストリー２６９：３２６７８
−８４；ＵＳ−特許５４８７９９３号）、ｐＣＲ（Ｒ）
Ｂｌｕｎｔ（インビトロゲン社、グロニンゲン、オラン
ダ；バーナード他、ジャーナルオブモレキュラーバイオ
ロジー、２３４：５３４−５４１（１９９３））または
ｐＥＭ１（シュルンプフ他、１９９１、ジャーナルオブ
バクテリオロジー１７３：４５１０−４５１６）を含
む。遺伝子のコーディング領域の中心部分を有するプラ
スミドベクターを次いで接合または形質転換によって所
望のＣ．グルタミクム中に転換する。
のコーディング領域の中心部分を、宿主（典型的にＥ．
コリ）中で複製できるが、Ｃ．グルタミクム中ではでき
ないプラスミドベクター中にクローニングする。使用で
きるベクターは、例えばｐＳＵＰ３０１（サイモン他
（Simon et al）、バイオ／テクノロジー１，７８４−
７９１（１９８３））、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９
ｍｏｂ（シャファー他（Schaefer et al）、遺伝子１４
５、６９−７３（１９９４））、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃ
ＢまたはｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（ジェガー他（Jaeger
et al）、ジャーナルオブバクテリオロジー１７４：５
４６２−６５（１９９２））、ｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ
コーポレーション、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）、ｐＣＲ
２．１−ＴＯＰＯ（シューマン（１９９４）．ジャーナ
ルオブバイオロジカルケミストリー２６９：３２６７８
−８４；ＵＳ−特許５４８７９９３号）、ｐＣＲ（Ｒ）
Ｂｌｕｎｔ（インビトロゲン社、グロニンゲン、オラン
ダ；バーナード他、ジャーナルオブモレキュラーバイオ
ロジー、２３４：５３４−５４１（１９９３））または
ｐＥＭ１（シュルンプフ他、１９９１、ジャーナルオブ
バクテリオロジー１７３：４５１０−４５１６）を含
む。遺伝子のコーディング領域の中心部分を有するプラ
スミドベクターを次いで接合または形質転換によって所
望のＣ．グルタミクム中に転換する。
【００４１】接合の方法は、例えばシェファー他（応用
および環境微生物学（Applied andEnvironmental Micro
biology）６０、７５６−７５９（１９９４））におい
て記載されている。形質転換のための方法は、例えばチ
ールバッハ他（Thierbach etal）（応用および環境微生
物学２９，３５６−３６２（１９８８））、デュニカン
およびシヴナン（Dunican and Shivnan）（バイオ／テ
クノロジー７，１０６７−１０７０（１９８９））およ
びタウチ他（Tauch et al）（ＦＥＭＳ ミクロバイオロ
ジカル レター（FEMS Microbiological Letters）１２
３、３４３−３４７（１９９４））に記載されている。
交差による相同組み換え後に、作用した遺伝子のコーデ
ィング領域はベクター配列によって破壊され、かつそれ
ぞれが３′−末端および５′−末端を欠損する２つの不
完全な対立遺伝子が得られる。この方法を、例えばフィ
ッツパトリック他（Fitzpatrick et al）（応用および
環境微生物学４２、５７５−５８０（１９９４））によ
って使用し、Ｃ．グルタミクムのｒｅｃＡ遺伝子がスイ
ッチオフされた。ｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃ
Ｄ遺伝子は前記の方法においてスイッチオフされてよ
い。
および環境微生物学（Applied andEnvironmental Micro
biology）６０、７５６−７５９（１９９４））におい
て記載されている。形質転換のための方法は、例えばチ
ールバッハ他（Thierbach etal）（応用および環境微生
物学２９，３５６−３６２（１９８８））、デュニカン
およびシヴナン（Dunican and Shivnan）（バイオ／テ
クノロジー７，１０６７−１０７０（１９８９））およ
びタウチ他（Tauch et al）（ＦＥＭＳ ミクロバイオロ
ジカル レター（FEMS Microbiological Letters）１２
３、３４３−３４７（１９９４））に記載されている。
交差による相同組み換え後に、作用した遺伝子のコーデ
ィング領域はベクター配列によって破壊され、かつそれ
ぞれが３′−末端および５′−末端を欠損する２つの不
完全な対立遺伝子が得られる。この方法を、例えばフィ
ッツパトリック他（Fitzpatrick et al）（応用および
環境微生物学４２、５７５−５８０（１９９４））によ
って使用し、Ｃ．グルタミクムのｒｅｃＡ遺伝子がスイ
ッチオフされた。ｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃ
Ｄ遺伝子は前記の方法においてスイッチオフされてよ
い。
【００４２】遺伝子置換の方法において、突然変異、例
えば欠失、挿入または塩基交換をインビトロで関連の遺
伝子において生成する。生成した対立遺伝子をＣ．グル
タミクムで複製できないベクター中にクローニングし、
かつ次いでベクターを形質転換または接合によってＣ．
グルタミクムのための所望の宿主中に転換する。標的遺
伝子および／または標的配列への突然変異および／また
は対立遺伝子の導入は相同組み換え後に、第１の交差に
より組み込まれ、かつ適当な第２の交差によって切り出
されることで達成される。この方法は、ピータース−ヴ
ェンディッシュ（Peters-Wendisch）（微生物学１４
４、９１５−９２７（１９９８））によって欠失による
Ｃ．グルタミクムのｐｙｃ−遺伝子のスイッチオフのた
めに使用されている。欠失、挿入または塩基交換は前記
のようにしてｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺
伝子に導入できる。
えば欠失、挿入または塩基交換をインビトロで関連の遺
伝子において生成する。生成した対立遺伝子をＣ．グル
タミクムで複製できないベクター中にクローニングし、
かつ次いでベクターを形質転換または接合によってＣ．
グルタミクムのための所望の宿主中に転換する。標的遺
伝子および／または標的配列への突然変異および／また
は対立遺伝子の導入は相同組み換え後に、第１の交差に
より組み込まれ、かつ適当な第２の交差によって切り出
されることで達成される。この方法は、ピータース−ヴ
ェンディッシュ（Peters-Wendisch）（微生物学１４
４、９１５−９２７（１９９８））によって欠失による
Ｃ．グルタミクムのｐｙｃ−遺伝子のスイッチオフのた
めに使用されている。欠失、挿入または塩基交換は前記
のようにしてｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺
伝子に導入できる。
【００４３】欠失、挿入または塩基交換は前記のように
してｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺伝子に導
入できる。
してｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺伝子に導
入できる。
【００４４】更に、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンの製
造のために関連の生合成経路、解糖、アナプレロティッ
ク経路、クエン酸回路またはアミノ酸輸送の１種以上の
酵素を強化、特に過剰発現する以外に、ｓｕｃＣ遺伝子
および／またはｓｕｃＤ遺伝子を減衰させるために有利
であってよい。
造のために関連の生合成経路、解糖、アナプレロティッ
ク経路、クエン酸回路またはアミノ酸輸送の１種以上の
酵素を強化、特に過剰発現する以外に、ｓｕｃＣ遺伝子
および／またはｓｕｃＤ遺伝子を減衰させるために有利
であってよい。
【００４５】このように、Ｌ−リジンおよび／またはＬ
−グルタミンの製造において、ｓｕｃＣ遺伝子および／
またはｓｕｃＤ遺伝子の減衰の他に、以下の群から選択
される１種以上の遺伝子を強化、特に過剰発現してよ
い：・ジヒドロジピコリン酸−シンターゼをコードする
ｄａｐＡ遺伝子（ＥＰ−Ｂ０１９７３３５号）、 ・グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを
コードするｇａｐ遺伝子（エイクマン（Eikmanns）（１
９９２）、ジャーナルオブバクテリオロジー１７４：６
０７６−６０８６）、 ・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｔ
ｐｉ（エイクマン（１９９２）、ジャーナルオブバクテ
リオロジー１７４：６０７６−６０８６）、 ・３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子
ｐｇｋ（エイクマン（１９９２）、ジャーナルオブバク
テリオロジー１７４：６０７６−６０８６）、 ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝
子（エイクマン（１９９２）、ジャーナルオブバクテリ
オロジー１７４：６０７６−６０８６）、 ・マレイン酸：キノンオキシドレダクターゼをコードす
るｍｑｏ遺伝子（モレナール他、欧州ジャーナルオブバ
イオケミストリー２５４（Molenaar et al., European
Journal of Biochemistry 254），３９５−４０３（１
９９８））、 ・フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼをコード
する遺伝子ｌｙｓＣ（アクセッション番号Ｐ２６５１
２）、 ・Ｌ−リジン輸送（lysine-export）をコードするｌｙ
ｓＥ遺伝子（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２号）、 ・Ｚｗａ１タンパク質をコードする遺伝子ｚｗａ１（Ｄ
Ｅ：１９９５９３２８．０、ＤＳＭ１３１１５）。
−グルタミンの製造において、ｓｕｃＣ遺伝子および／
またはｓｕｃＤ遺伝子の減衰の他に、以下の群から選択
される１種以上の遺伝子を強化、特に過剰発現してよ
い：・ジヒドロジピコリン酸−シンターゼをコードする
ｄａｐＡ遺伝子（ＥＰ−Ｂ０１９７３３５号）、 ・グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを
コードするｇａｐ遺伝子（エイクマン（Eikmanns）（１
９９２）、ジャーナルオブバクテリオロジー１７４：６
０７６−６０８６）、 ・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｔ
ｐｉ（エイクマン（１９９２）、ジャーナルオブバクテ
リオロジー１７４：６０７６−６０８６）、 ・３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子
ｐｇｋ（エイクマン（１９９２）、ジャーナルオブバク
テリオロジー１７４：６０７６−６０８６）、 ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝
子（エイクマン（１９９２）、ジャーナルオブバクテリ
オロジー１７４：６０７６−６０８６）、 ・マレイン酸：キノンオキシドレダクターゼをコードす
るｍｑｏ遺伝子（モレナール他、欧州ジャーナルオブバ
イオケミストリー２５４（Molenaar et al., European
Journal of Biochemistry 254），３９５−４０３（１
９９８））、 ・フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼをコード
する遺伝子ｌｙｓＣ（アクセッション番号Ｐ２６５１
２）、 ・Ｌ−リジン輸送（lysine-export）をコードするｌｙ
ｓＥ遺伝子（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２号）、 ・Ｚｗａ１タンパク質をコードする遺伝子ｚｗａ１（Ｄ
Ｅ：１９９５９３２８．０、ＤＳＭ１３１１５）。
【００４６】更にＬ−リジンおよび／またはＬ−グルタ
メートの製造のために、ｓｕｃＣ遺伝子および／または
ｓｕｃＤ遺伝子の減衰の他に同時に以下の群から選択さ
れる１種以上の遺伝子の発現を減衰、特に低減させるこ
とが有利である： ・ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコー
ドする遺伝子ｐｃｋ（ＤＥ１９９５０４０９．１，ＤＳ
Ｍ１３０４７）、 ・グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺
伝子ｐｇｉ（ＵＳ０９／３９６，４７８，ＤＳＭ１２９
６９）、 ・ピルビン酸−オキシダーゼをコードする遺伝子ｐｏｘ
Ｂ（ＤＥ：１９９５ １９７５．７，ＤＳＭ１３１１
４）、 ・ｚｗａ２タンパク質をコードする遺伝子ｚｗａ２（Ｄ
Ｅ：９９５９３２７．２、ＤＳＭ１３１１３）。
メートの製造のために、ｓｕｃＣ遺伝子および／または
ｓｕｃＤ遺伝子の減衰の他に同時に以下の群から選択さ
れる１種以上の遺伝子の発現を減衰、特に低減させるこ
とが有利である： ・ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコー
ドする遺伝子ｐｃｋ（ＤＥ１９９５０４０９．１，ＤＳ
Ｍ１３０４７）、 ・グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺
伝子ｐｇｉ（ＵＳ０９／３９６，４７８，ＤＳＭ１２９
６９）、 ・ピルビン酸−オキシダーゼをコードする遺伝子ｐｏｘ
Ｂ（ＤＥ：１９９５ １９７５．７，ＤＳＭ１３１１
４）、 ・ｚｗａ２タンパク質をコードする遺伝子ｚｗａ２（Ｄ
Ｅ：９９５９３２７．２、ＤＳＭ１３１１３）。
【００４７】更にアミノ酸、特にＬ−リジンおよび／ま
たはＬ−グルタメートの製造のために、ｓｕｃＣ遺伝子
および／またはｓｕｃＤ遺伝子の減衰の他に望ましくな
い二次反応をスイッチオフすることが有利でありうる
（ナカヤマ：“アミノ酸酸性微生物の交配”、ｉｎ：微
生物産物の過剰生産、クルムファンツル、ジキータ、ヴ
ァネック（出版）、アカデミックプレス、ロンドン、Ｕ
Ｋ、１９８２（Nakayama: "Breeding of Amino Acid Pr
oducing Microorganisms", in: Overproductionof Micr
obial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), A
cademic Press,London, UK, 1982））。
たはＬ−グルタメートの製造のために、ｓｕｃＣ遺伝子
および／またはｓｕｃＤ遺伝子の減衰の他に望ましくな
い二次反応をスイッチオフすることが有利でありうる
（ナカヤマ：“アミノ酸酸性微生物の交配”、ｉｎ：微
生物産物の過剰生産、クルムファンツル、ジキータ、ヴ
ァネック（出版）、アカデミックプレス、ロンドン、Ｕ
Ｋ、１９８２（Nakayama: "Breeding of Amino Acid Pr
oducing Microorganisms", in: Overproductionof Micr
obial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), A
cademic Press,London, UK, 1982））。
【００４８】請求項１記載のポリヌクレオチドを有する
微生物も本発明の対象であり、かつ連続的またはバッチ
法においてバッチ式（回分培養）にか、または流加式ま
たは反復流加法で培養して、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リ
ジンを製造してもよい。公知の培養法の概要はクミール
によるテキストブック（バイオプロセス技術１．生物学
的工学への導入（Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung i
n die Bioverfahrenstechnik））（グスタフ フィッシ
ャー出版、シュトゥットガルト、１９９１）またはスト
ーハス（Storhas）によるテキストブック（バイオリア
クターおよび周辺装置（Bioreaktoren und periphere E
inrichtungen））（フィーヴェク出版（Vieweg Verla
g）、ブラウンシュバイク／ヴィースバーデン、１９９
４）において挙げられている。
微生物も本発明の対象であり、かつ連続的またはバッチ
法においてバッチ式（回分培養）にか、または流加式ま
たは反復流加法で培養して、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リ
ジンを製造してもよい。公知の培養法の概要はクミール
によるテキストブック（バイオプロセス技術１．生物学
的工学への導入（Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung i
n die Bioverfahrenstechnik））（グスタフ フィッシ
ャー出版、シュトゥットガルト、１９９１）またはスト
ーハス（Storhas）によるテキストブック（バイオリア
クターおよび周辺装置（Bioreaktoren und periphere E
inrichtungen））（フィーヴェク出版（Vieweg Verla
g）、ブラウンシュバイク／ヴィースバーデン、１９９
４）において挙げられている。
【００４９】使用されるべき培養培地は適宜に関連の株
の要求を満たさなければならない。種々の微生物のため
の培養培地の記載はハンドブックであるアメリカの微生
物協会（American Society for Bacteriology）（ワシ
ントンＤ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）の“一般細菌学の
ための方法のマニュアル（Manual of Methods for Gene
ral Bacteriology）”に挙げられる。
の要求を満たさなければならない。種々の微生物のため
の培養培地の記載はハンドブックであるアメリカの微生
物協会（American Society for Bacteriology）（ワシ
ントンＤ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）の“一般細菌学の
ための方法のマニュアル（Manual of Methods for Gene
ral Bacteriology）”に挙げられる。
【００５０】炭素源として、糖および炭化水素、例えば
グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、
マルトース、蜜ろう、デンプンおよびセルロース、油お
よび脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油および
ココナツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン
酸およびリノール酸、アルコール、例えばグリセロール
およびエタノール、および有機酸、例えば酢酸が使用で
きる。これらの物質は個々にか、または混合物として使
用してよい。
グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、
マルトース、蜜ろう、デンプンおよびセルロース、油お
よび脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油および
ココナツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン
酸およびリノール酸、アルコール、例えばグリセロール
およびエタノール、および有機酸、例えば酢酸が使用で
きる。これらの物質は個々にか、または混合物として使
用してよい。
【００５１】窒素源として、窒素含有の有機化合物、例
えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コ
ーンスチープリカー、大豆粉および尿素、または無機化
合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモ
ニウムが使用できる。窒素源は個々にか、または混合物
として使用してよい。
えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コ
ーンスチープリカー、大豆粉および尿素、または無機化
合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモ
ニウムが使用できる。窒素源は個々にか、または混合物
として使用してよい。
【００５２】リン源として、リン酸、リン酸二水素カリ
ウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応のナトリ
ウム含有塩が使用できる。更に培養培地は増殖のために
必要な金属の塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄
を含有せねばならない。最終的に、必須の増殖物質、例
えばアミノ酸およびビタミンは、前記の物質の他に使用
してよい。これとは別に適当な前駆物質を培養培地に添
加してよい。前記の供給原料物質を培地に一回限りの培
地として添加するか、または適当な方法で実際の培養の
間に計量供給してよい。
ウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応のナトリ
ウム含有塩が使用できる。更に培養培地は増殖のために
必要な金属の塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄
を含有せねばならない。最終的に、必須の増殖物質、例
えばアミノ酸およびビタミンは、前記の物質の他に使用
してよい。これとは別に適当な前駆物質を培養培地に添
加してよい。前記の供給原料物質を培地に一回限りの培
地として添加するか、または適当な方法で実際の培養の
間に計量供給してよい。
【００５３】アルカリ性化合物、例えば水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水ま
たは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸を適当な方法
で、培養のｐＨを調整するために使用してよい。抑泡
剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを泡の形成を
妨げるために使用してよい。適当な選択的に作用する物
質、例えば抗生物質を培地に添加して、プラスミドの安
定性を保持してよい。酸素または酸素含有気体混合物、
例えば空気を培養中に導入して、有気性条件を保持して
よい。培養の温度は通常、２０〜４５℃、有利には２５
〜４０℃である。培養は所望の生成物の最大収率が形成
されるまで持続する。通常この目標は１０〜１６０時間
以内で達成される。
ム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水ま
たは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸を適当な方法
で、培養のｐＨを調整するために使用してよい。抑泡
剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを泡の形成を
妨げるために使用してよい。適当な選択的に作用する物
質、例えば抗生物質を培地に添加して、プラスミドの安
定性を保持してよい。酸素または酸素含有気体混合物、
例えば空気を培養中に導入して、有気性条件を保持して
よい。培養の温度は通常、２０〜４５℃、有利には２５
〜４０℃である。培養は所望の生成物の最大収率が形成
されるまで持続する。通常この目標は１０〜１６０時間
以内で達成される。
【００５４】Ｌ−アミノ酸を測定するための方法は先行
技術から公知である。分析は、例えばスペックマン他
（Spackman et al）（分析化学、３０、（１９５８）、
１１９０）によって記載されるようにアニオン交換クロ
マトグラフィー、引き続きニンヒドリン誘導体化による
か、またはリンドロス他（Lindroth et al）（分析化学
（１９７９）５１：１１６７−１１７４）によって記載
されるように逆相ＨＰＬＣによって実施してよい。
技術から公知である。分析は、例えばスペックマン他
（Spackman et al）（分析化学、３０、（１９５８）、
１１９０）によって記載されるようにアニオン交換クロ
マトグラフィー、引き続きニンヒドリン誘導体化による
か、またはリンドロス他（Lindroth et al）（分析化学
（１９７９）５１：１１６７−１１７４）によって記載
されるように逆相ＨＰＬＣによって実施してよい。
【００５５】本発明を以下に実施態様によってより詳細
に記載する。
に記載する。
【００５６】
【実施例】例１ コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からのゲノムのコスミド遺伝子ライブラリーの作成 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡをタウチ他（１９９５、プラスミド
３３：１６８−１７９）によって記載されるように単離
し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（アマシャムフ
ァルマシア、フライブルク、ドイツ、製品銘柄Ｓａｕ３
ＡＩ、コード番号２７−０９１３−０２）で分解した。
ＤＮＡ断片をエビのアルカリホスファターゼ（ロッヒェ
モレキュラー バイオケミカルズ、マンハイム、ドイ
ツ、製品銘柄ＳＡＰ、コード番号１７５８２５０）で脱
リン酸化した。ストラタジーン（ラ ヨラ、ＵＳＡ、製
品銘柄ＳｕｐｅｒＣｏｓ１コスミドベクターキット、コ
ード番号２５１３０１）から得られるコスミドベクター
ＳｕｐｅｒＣｏｓ１（ヴァール他（１９８７）国立科学
アカデミーの処置、ＵＳＡ ８４：２１６０−２１６
４）を制限酵素ＸｂａＩ（アマシャムファルマシア、フ
ライブルク、ドイツ、製品銘柄ＸｂａＩ、コード番号２
７−０９４８−０２）で分解し、かつ同様にエビのアル
カリホスファターゼを使用して脱リン酸化した。次いで
コスミド−ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（アマシャムフ
ァルマシア、フライブルク、ドイツ、製品銘柄ＢａｍＨ
Ｉ、コード番号２７−０８６８−０４）で分解した。前
記のように処理したコスミド−ＤＮＡを処理したＡＴＣ
Ｃ１３０３２−ＤＮＡと混合し、かつバッチをＴ４−Ｄ
ＮＡ−リガーゼ（アマシャムファルマシア、フライブル
ク、ドイツ、製品銘柄Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ、コード
番号２７−０８７０−０４）で処理した。次いでライゲ
ーション混合物をギガパックＩＩ ＸＬパッキングエキ
ストラクト（Gigapack II XL Packing Extracts）（ス
トラタジーン、ラ ヨラ（Stratagene, La Jolla）、Ｕ
ＳＡ、製品銘柄ギガパックＩＩ ＸＬパッキングエキス
トラクト、コード番号２００２１７）を使用してファー
ジにパッケージングした。Ｅ．コリ株ＮＭ５５４（ララ
イト他、１９８８、核酸リサーチ、１６：１５６３−１
５７５）に感染させるために、細胞を１０ｍＭのＭｇＳ
Ｏ４中にとり、かつファージ懸濁液のアリコートと混合
した。コスミドバンクの感染および力価測定はサンブロ
ーク他（１９８９、モレキュラークローニング：研究所
マニュアル、コールドスプリングハーバー）によって記
載されるように実施し、その際細胞は１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを有するＬＢアガー（レノクッス（Lenn
ox）、１９９５，ウイルス学、１：１９０）上にプレー
ティングした。個々の組み換えクローンを３７℃での一
晩のインキュベーション後に選択した。
からのゲノムのコスミド遺伝子ライブラリーの作成 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡをタウチ他（１９９５、プラスミド
３３：１６８−１７９）によって記載されるように単離
し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（アマシャムフ
ァルマシア、フライブルク、ドイツ、製品銘柄Ｓａｕ３
ＡＩ、コード番号２７−０９１３−０２）で分解した。
ＤＮＡ断片をエビのアルカリホスファターゼ（ロッヒェ
モレキュラー バイオケミカルズ、マンハイム、ドイ
ツ、製品銘柄ＳＡＰ、コード番号１７５８２５０）で脱
リン酸化した。ストラタジーン（ラ ヨラ、ＵＳＡ、製
品銘柄ＳｕｐｅｒＣｏｓ１コスミドベクターキット、コ
ード番号２５１３０１）から得られるコスミドベクター
ＳｕｐｅｒＣｏｓ１（ヴァール他（１９８７）国立科学
アカデミーの処置、ＵＳＡ ８４：２１６０−２１６
４）を制限酵素ＸｂａＩ（アマシャムファルマシア、フ
ライブルク、ドイツ、製品銘柄ＸｂａＩ、コード番号２
７−０９４８−０２）で分解し、かつ同様にエビのアル
カリホスファターゼを使用して脱リン酸化した。次いで
コスミド−ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（アマシャムフ
ァルマシア、フライブルク、ドイツ、製品銘柄ＢａｍＨ
Ｉ、コード番号２７−０８６８−０４）で分解した。前
記のように処理したコスミド−ＤＮＡを処理したＡＴＣ
Ｃ１３０３２−ＤＮＡと混合し、かつバッチをＴ４−Ｄ
ＮＡ−リガーゼ（アマシャムファルマシア、フライブル
ク、ドイツ、製品銘柄Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ、コード
番号２７−０８７０−０４）で処理した。次いでライゲ
ーション混合物をギガパックＩＩ ＸＬパッキングエキ
ストラクト（Gigapack II XL Packing Extracts）（ス
トラタジーン、ラ ヨラ（Stratagene, La Jolla）、Ｕ
ＳＡ、製品銘柄ギガパックＩＩ ＸＬパッキングエキス
トラクト、コード番号２００２１７）を使用してファー
ジにパッケージングした。Ｅ．コリ株ＮＭ５５４（ララ
イト他、１９８８、核酸リサーチ、１６：１５６３−１
５７５）に感染させるために、細胞を１０ｍＭのＭｇＳ
Ｏ４中にとり、かつファージ懸濁液のアリコートと混合
した。コスミドバンクの感染および力価測定はサンブロ
ーク他（１９８９、モレキュラークローニング：研究所
マニュアル、コールドスプリングハーバー）によって記
載されるように実施し、その際細胞は１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを有するＬＢアガー（レノクッス（Lenn
ox）、１９９５，ウイルス学、１：１９０）上にプレー
ティングした。個々の組み換えクローンを３７℃での一
晩のインキュベーション後に選択した。
【００５７】例２ 遺伝子ｓｕｃＣおよびｓｕｃＤの単離および配列決定 個々のコロニーのコスミド−ＤＮＡをキアプレップ ス
ピン ミニプレップ キット（Qiaprep Spin Miniprep Ki
t）（製品番号２７１０６，キアゲン、ヒルデン、ドイ
ツ）を使用して製造元の指示に従って単離し、かつ制限
酵素Ｓａｕ３ＡＩ（アマシャムファルマシア、フライブ
ルク、ドイツ、製品銘柄Ｓａｕ３ＡＩ、製品番号２７−
０９１３−０２）を使用して部分的に分解した。ＤＮＡ
断片をエビのアルカリホスファターゼ（ロッヒェ モレ
キュラー バイオケミカルズ、マンハイム、ドイツ、製
品銘柄ＳＡＰ、製品番号１７５８２５０）を使用して脱
リン酸化した。
ピン ミニプレップ キット（Qiaprep Spin Miniprep Ki
t）（製品番号２７１０６，キアゲン、ヒルデン、ドイ
ツ）を使用して製造元の指示に従って単離し、かつ制限
酵素Ｓａｕ３ＡＩ（アマシャムファルマシア、フライブ
ルク、ドイツ、製品銘柄Ｓａｕ３ＡＩ、製品番号２７−
０９１３−０２）を使用して部分的に分解した。ＤＮＡ
断片をエビのアルカリホスファターゼ（ロッヒェ モレ
キュラー バイオケミカルズ、マンハイム、ドイツ、製
品銘柄ＳＡＰ、製品番号１７５８２５０）を使用して脱
リン酸化した。
【００５８】ゲル電気泳動分離の後に、コスミド断片を
１５００〜２０００ｂｐの大きな領域でキアエクスＩＩ
ゲル エクストラクション キット（QiaExII Gel Extrac
tionKit）（製品番号２００２１，キアゲン、ヒルデ
ン、ドイツ）を使用して単離した。インビトロゲンから
得られる配列決定ベクターｐＺｅｒｏ−１（グロニンゲ
ン、オランダ、製品銘柄ゼロ バックグラウンド クロー
ニング キット（Zero Background Cloning Kit）、製品
番号Ｋ２５００−０１）のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
（アマシャムファルマシア、フライブルク、ドイツ、製
品銘柄ＢａｍＨＩ、製品番号２７−０８６８−０４）で
分解した。配列決定ベクターｐＺｅｒｏ−１中へのコス
ミド断片のライゲーションをサンブローク他（１９８
９，モレキュラークローニング：研究所マニュアル、コ
ールドスプリングハーバー）によって記載されるように
実施し、その際、ＤＮＡ混合物はＴ４−リガーゼ（ファ
ルマシアバイオテック、フライブルク、ドイツ）と一緒
に一晩インキュベートした。このライゲーション混合物
をＥ．コリ株ＤＨ５αＭＣＲ（グラント、１９９０、国
立科学アカデミーＵＳＡの処置、８７：４６４５−４６
４９）（タウチ他、１９９４，ＦＥＭＳミクロバイオロ
ジーレター、１２２３：３４３−７）中にエレクトロポ
レーションし、かつ５０μｇ／ｍｌのゼオシンを有する
ＬＢ−アガー（レノックス、１９５５，ウイルス学、
１：１９０）上にプレーティングした。組み換えクロー
ンのプラスミド調製をバイオロボット９６００（Biorob
ot 9600）（製品番号９００２００，キアゲン、ヒルデ
ン、ドイツ）を使用して実施した。配列決定をサンガー
他（１９７７，国立科学アカデミーＵＳＡの処置、７
４：５４６３−５４６７）のジデオキシチェーンターミ
ネーション法に従ってツィマーマン他（１９９０，核酸
リサーチ、１８：１０６７）によって改良されたように
実施した。ＰＥアプライドバイオシステムズ（PE Appli
ed Biosystems）からのＲＲ ｄローダミン ターミネー
ター サイクル シークエンシング キット（RR dRhodami
n Terminator Cycle Sequencing Kit）（製品番号４０
３０４４，ヴァイターシュタット、ドイツ）を使用し
た。ゲル電気泳動分離および配列決定反応の分析はロー
ティフォレシスＮＦアクリルアミド（rothiphoresis NF
acrylamide）／ビスアクリルアミドゲル（２９：１）
（製品番号Ａ１２４．１、ロト、カールスルーエ、ドイ
ツ）中で一緒にＰＥアプライドバイオシステムズ（ヴァ
イターシュタット、ドイツ）からの“ＡＢＩプリズム３
７７（ABI Prism 377）”配列決定装置を使用して実施
した。
１５００〜２０００ｂｐの大きな領域でキアエクスＩＩ
ゲル エクストラクション キット（QiaExII Gel Extrac
tionKit）（製品番号２００２１，キアゲン、ヒルデ
ン、ドイツ）を使用して単離した。インビトロゲンから
得られる配列決定ベクターｐＺｅｒｏ−１（グロニンゲ
ン、オランダ、製品銘柄ゼロ バックグラウンド クロー
ニング キット（Zero Background Cloning Kit）、製品
番号Ｋ２５００−０１）のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
（アマシャムファルマシア、フライブルク、ドイツ、製
品銘柄ＢａｍＨＩ、製品番号２７−０８６８−０４）で
分解した。配列決定ベクターｐＺｅｒｏ−１中へのコス
ミド断片のライゲーションをサンブローク他（１９８
９，モレキュラークローニング：研究所マニュアル、コ
ールドスプリングハーバー）によって記載されるように
実施し、その際、ＤＮＡ混合物はＴ４−リガーゼ（ファ
ルマシアバイオテック、フライブルク、ドイツ）と一緒
に一晩インキュベートした。このライゲーション混合物
をＥ．コリ株ＤＨ５αＭＣＲ（グラント、１９９０、国
立科学アカデミーＵＳＡの処置、８７：４６４５−４６
４９）（タウチ他、１９９４，ＦＥＭＳミクロバイオロ
ジーレター、１２２３：３４３−７）中にエレクトロポ
レーションし、かつ５０μｇ／ｍｌのゼオシンを有する
ＬＢ−アガー（レノックス、１９５５，ウイルス学、
１：１９０）上にプレーティングした。組み換えクロー
ンのプラスミド調製をバイオロボット９６００（Biorob
ot 9600）（製品番号９００２００，キアゲン、ヒルデ
ン、ドイツ）を使用して実施した。配列決定をサンガー
他（１９７７，国立科学アカデミーＵＳＡの処置、７
４：５４６３−５４６７）のジデオキシチェーンターミ
ネーション法に従ってツィマーマン他（１９９０，核酸
リサーチ、１８：１０６７）によって改良されたように
実施した。ＰＥアプライドバイオシステムズ（PE Appli
ed Biosystems）からのＲＲ ｄローダミン ターミネー
ター サイクル シークエンシング キット（RR dRhodami
n Terminator Cycle Sequencing Kit）（製品番号４０
３０４４，ヴァイターシュタット、ドイツ）を使用し
た。ゲル電気泳動分離および配列決定反応の分析はロー
ティフォレシスＮＦアクリルアミド（rothiphoresis NF
acrylamide）／ビスアクリルアミドゲル（２９：１）
（製品番号Ａ１２４．１、ロト、カールスルーエ、ドイ
ツ）中で一緒にＰＥアプライドバイオシステムズ（ヴァ
イターシュタット、ドイツ）からの“ＡＢＩプリズム３
７７（ABI Prism 377）”配列決定装置を使用して実施
した。
【００５９】得られた配列生データをＳｔａｄｅｎプロ
グラムパッケージ（１９８６，核酸リサーチ、１４：２
１７−２３１）バージョン９７−０を使用して加工し
た。ｐＺｅｒｏ１誘導体の個々の配列を一貫のコンティ
グにアセンブルした。コーディング領域のコンピュータ
支援分析はプログラムＸＮＩＰ（スタデン、１９８６，
核酸リサーチ、１４：２１７−２３１）を使用して実施
した。更なる分析をＢＬＡＳＴサーチプログラム（アル
チュル他、１９９７，核酸リサーチ、２５：３３８９−
３４０２）を使用して、国立バイオテクノロジー情報セ
ンター（ＮＣＢＩ、ベテスダ、ＭＤ、ＵＳＡ）の非重複
データバンク（non-redundant data bank）に対して実
施した。
グラムパッケージ（１９８６，核酸リサーチ、１４：２
１７−２３１）バージョン９７−０を使用して加工し
た。ｐＺｅｒｏ１誘導体の個々の配列を一貫のコンティ
グにアセンブルした。コーディング領域のコンピュータ
支援分析はプログラムＸＮＩＰ（スタデン、１９８６，
核酸リサーチ、１４：２１７−２３１）を使用して実施
した。更なる分析をＢＬＡＳＴサーチプログラム（アル
チュル他、１９９７，核酸リサーチ、２５：３３８９−
３４０２）を使用して、国立バイオテクノロジー情報セ
ンター（ＮＣＢＩ、ベテスダ、ＭＤ、ＵＳＡ）の非重複
データバンク（non-redundant data bank）に対して実
施した。
【００６０】得られたヌクレオチド配列を配列番号１に
記載する。ヌクレオチド配列の分析によってｓｕｃＣ遺
伝子として同定された１２０６塩基対のオープンリーデ
ィングフレームならびにｓｕｃＤとして同定された８８
２塩基対のオープンリーディングフレームが示された。
ｓｕｃＣ遺伝子は配列番号２に示される４０２アミノ酸
のポリペプチドをコードする。ｓｕｃＤ遺伝子は配列番
号３に示される２９４アミノ酸のポリペプチドをコード
している。
記載する。ヌクレオチド配列の分析によってｓｕｃＣ遺
伝子として同定された１２０６塩基対のオープンリーデ
ィングフレームならびにｓｕｃＤとして同定された８８
２塩基対のオープンリーディングフレームが示された。
ｓｕｃＣ遺伝子は配列番号２に示される４０２アミノ酸
のポリペプチドをコードする。ｓｕｃＤ遺伝子は配列番
号３に示される２９４アミノ酸のポリペプチドをコード
している。
【００６１】例３ ３．１ ｓｕｃＣ遺伝子の組み込み突然変異誘発のため
の組み込みベクターの製造 染色体ＤＮＡをエイクマン他（微生物学１４０：１８１
７−１８２８（１９９４））の方法に従って株ＡＴＣＣ
１３０３２から単離した。例１から公知のＣ．グルタミ
クムに関するｓｕｃＣ遺伝子の配列に基づき、以下のオ
リゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応のために選択
した： ｓｕｃＣ−ｉｎ１： ５’ＣＧＣＧＣＧＡＡＴＣＧＴＴＣＧＴＡＴ３’ ｓｕｃＣ−ｉｎ２： ５’ＣＧＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＴＡＧＧＡ３’ 示したプライマーはＭＷＧバイオテック（エベルスベル
ク、ドイツ）によって合成され、かつＰＣＲ反応をベー
リンガーマンハイムからのＰｗｏポリメラーゼ（ドイ
ツ、製品銘柄Ｐｗｏ ＤＮＡ ポリメラーゼ、製品番号１
６４４９４７）を使用してイニス他の標準ＰＣＲ法（Ｐ
ＣＲプロトコール、方法および応用へのガイド（A Guid
e to Methods and Applications）、１９９０，アカデ
ミックプレス）に従って実施した。ポリメラーゼ連鎖反
応を使用して、ｓｕｃＣ遺伝子の約０．５５ｋｂの大き
な内部断片を増幅できた。前記のように増幅した生成物
を０．８％アガロースゲル中での電気泳動によって確認
した。
の組み込みベクターの製造 染色体ＤＮＡをエイクマン他（微生物学１４０：１８１
７−１８２８（１９９４））の方法に従って株ＡＴＣＣ
１３０３２から単離した。例１から公知のＣ．グルタミ
クムに関するｓｕｃＣ遺伝子の配列に基づき、以下のオ
リゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応のために選択
した： ｓｕｃＣ−ｉｎ１： ５’ＣＧＣＧＣＧＡＡＴＣＧＴＴＣＧＴＡＴ３’ ｓｕｃＣ−ｉｎ２： ５’ＣＧＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＴＡＧＧＡ３’ 示したプライマーはＭＷＧバイオテック（エベルスベル
ク、ドイツ）によって合成され、かつＰＣＲ反応をベー
リンガーマンハイムからのＰｗｏポリメラーゼ（ドイ
ツ、製品銘柄Ｐｗｏ ＤＮＡ ポリメラーゼ、製品番号１
６４４９４７）を使用してイニス他の標準ＰＣＲ法（Ｐ
ＣＲプロトコール、方法および応用へのガイド（A Guid
e to Methods and Applications）、１９９０，アカデ
ミックプレス）に従って実施した。ポリメラーゼ連鎖反
応を使用して、ｓｕｃＣ遺伝子の約０．５５ｋｂの大き
な内部断片を増幅できた。前記のように増幅した生成物
を０．８％アガロースゲル中での電気泳動によって確認
した。
【００６２】増幅したＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ
（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ ＩＩ（バーナード他、ジャーナルオ
ブモレキュラーバイオロジー、２３４：５３４−５４１
（１９９３））中にインビトロゲンコーポレーション
（カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ；カタログ番号Ｋ２７
００−２０）からのＺｅｒｏ ＢｌｕｎｔＴＭキットを
使用してライゲーションした。
（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ ＩＩ（バーナード他、ジャーナルオ
ブモレキュラーバイオロジー、２３４：５３４−５４１
（１９９３））中にインビトロゲンコーポレーション
（カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ；カタログ番号Ｋ２７
００−２０）からのＺｅｒｏ ＢｌｕｎｔＴＭキットを
使用してライゲーションした。
【００６３】次いでＥ．コリ株ＴＯＰ１０をライゲーシ
ョンバッチ中にエレクトロポレーションした（ハナハ
ン、Ｉｎ：ＤＮＡクローニング．実践的アプローチ（A
Practical Approach）、Ｖｏｌ．Ｉ、ＩＲＬ−プレス、
オックスフォード、ワシントンＤＣ、ＵＳＡ、１９８
５）。プラスミドを有する細胞の選択を、形質転換バッ
チの２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢアガー
（サンブローク他、モレキュラークローニング：研究室
マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、
Ｎ．Ｙ．１９８９）上へのプレーティングによって実施
した。プラスミドＤＮＡをキアゲンからのキアプレップ
スピン ミニプレップ キット（QIAprep Spin Miniprep
Kit）を使用して形質転換体から単離し、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩによる制限に引き続き、アガロースゲル電気泳動
（０．８％）を実施した。プラスミドはｐＣＲＢｌｕｎ
ｔｓｕｃＣｉｎｔと名付け、図１に示した。
ョンバッチ中にエレクトロポレーションした（ハナハ
ン、Ｉｎ：ＤＮＡクローニング．実践的アプローチ（A
Practical Approach）、Ｖｏｌ．Ｉ、ＩＲＬ−プレス、
オックスフォード、ワシントンＤＣ、ＵＳＡ、１９８
５）。プラスミドを有する細胞の選択を、形質転換バッ
チの２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢアガー
（サンブローク他、モレキュラークローニング：研究室
マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、
Ｎ．Ｙ．１９８９）上へのプレーティングによって実施
した。プラスミドＤＮＡをキアゲンからのキアプレップ
スピン ミニプレップ キット（QIAprep Spin Miniprep
Kit）を使用して形質転換体から単離し、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩによる制限に引き続き、アガロースゲル電気泳動
（０．８％）を実施した。プラスミドはｐＣＲＢｌｕｎ
ｔｓｕｃＣｉｎｔと名付け、図１に示した。
【００６４】３．２ ｓｕｃＤ遺伝子の欠失 この目的のために、染色体ＤＮＡを株ＡＴＣＣ１３０３
２から、タウチ他（１９９５，プラスミド３３：１６８
−１７９）の方法によって単離した。例２から公知の
Ｃ．グルタミクムに関するｓｕｃＤ遺伝子の配列に基づ
いて、以下に記載するオリゴヌクレオチドをｓｕｃＤ欠
失対立遺伝子の作成のために選択した。
２から、タウチ他（１９９５，プラスミド３３：１６８
−１７９）の方法によって単離した。例２から公知の
Ｃ．グルタミクムに関するｓｕｃＤ遺伝子の配列に基づ
いて、以下に記載するオリゴヌクレオチドをｓｕｃＤ欠
失対立遺伝子の作成のために選択した。
【００６５】ｓｕｃＤ−ｄ１： ５’−ＣＧＡＴＧＴＧＡＴＴＧＣＧＣＴＴＧＡＴＧ−
３’ ｓｕｃＤ−ｄ２： ５’−ＡＣＣＴＣＡＣＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＣＡＴ
ＧＣＴＣＴＧＡＡＣＣＴＴＣＣＧＡＡＣ−３’ ｓｕｃＤ−ｄ３： ５’−ＧＴＴＣＧＧＡＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧＣ
ＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＧＴＧＡＧＧＴ−３’ ｓｕｃＤ−ｄ４： ５’−ＡＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡ−
３’ 関連のプライマーはＭＷＧバイオテック（エベルスベル
ク、ドイツ）によって合成され、ＰＣＲ反応をＰｆｕポ
リメラーゼ（ストラタジーン、製品番号６００１３５，
ラ ヨラ、ＵＳＡ）およびＰＴＣ １００−サーモサイク
ラー（PTC 100-Thermocyclers）（ＭＪリサーチＩｎ
ｃ、ウォールサム、ＵＳＡ）を使用して実施した。ポリ
メラーゼ連鎖反応を使用してプライマーは内部欠失を有
するｓｕｃＤ対立遺伝子の増幅を可能にした。前記のよ
うに増幅させた生成物を０．８％アガロースゲル中での
電気泳動によって試験し、かつサンガー他（国立科学ア
カデミーＵＳＡの処置、７４：５４６３−５４６７，１
９７７）によって記載されるように配列決定した。
３’ ｓｕｃＤ−ｄ２： ５’−ＡＣＣＴＣＡＣＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＣＡＴ
ＧＣＴＣＴＧＡＡＣＣＴＴＣＣＧＡＡＣ−３’ ｓｕｃＤ−ｄ３： ５’−ＧＴＴＣＧＧＡＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧＣ
ＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＧＴＧＡＧＧＴ−３’ ｓｕｃＤ−ｄ４： ５’−ＡＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡ−
３’ 関連のプライマーはＭＷＧバイオテック（エベルスベル
ク、ドイツ）によって合成され、ＰＣＲ反応をＰｆｕポ
リメラーゼ（ストラタジーン、製品番号６００１３５，
ラ ヨラ、ＵＳＡ）およびＰＴＣ １００−サーモサイク
ラー（PTC 100-Thermocyclers）（ＭＪリサーチＩｎ
ｃ、ウォールサム、ＵＳＡ）を使用して実施した。ポリ
メラーゼ連鎖反応を使用してプライマーは内部欠失を有
するｓｕｃＤ対立遺伝子の増幅を可能にした。前記のよ
うに増幅させた生成物を０．８％アガロースゲル中での
電気泳動によって試験し、かつサンガー他（国立科学ア
カデミーＵＳＡの処置、７４：５４６３−５４６７，１
９７７）によって記載されるように配列決定した。
【００６６】例４ ４．１ ＤＳＭ５７１５株中のｓｕｃＣ遺伝子の組み込
み突然変異誘発 例３．１に挙げたベクターｐＣＲＢｌｕｎｔｓｃｕＣｉ
ｎｔをＣ．グルタミクムＤＳＭ５７１５中にタウチ他
（ＦＥＭＳミクロバイオロジカルレター、１２３：３４
３−３４７（１９９４））のエレクトロポレーション法
によってエレクトロポレーションした。株ＤＳＭ５７１
５はＡＥＣ耐性のＬ−リジン生産菌である。ベクターｐ
ＣＲＢｌｕｎｔ−ｓｕｃＣｉｎｔはＤＳＭ５７１５中で
独立に複製できず、従ってＤＳＭ５７１５の染色体中に
組み込まれた場合、細胞中に残留するだけである。染色
体中に組み込まれたｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣｉｎｔを
有するクローンの選択を、エレクトロポレーションバッ
チの１５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢアガー
（サンブローク他、モレキュラークローニング：研究室
マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボ
ラトリープレス、コールドスプリングハーバー、、Ｎ．
Ｙ．）上へのプレーティングによって実施した。
み突然変異誘発 例３．１に挙げたベクターｐＣＲＢｌｕｎｔｓｃｕＣｉ
ｎｔをＣ．グルタミクムＤＳＭ５７１５中にタウチ他
（ＦＥＭＳミクロバイオロジカルレター、１２３：３４
３−３４７（１９９４））のエレクトロポレーション法
によってエレクトロポレーションした。株ＤＳＭ５７１
５はＡＥＣ耐性のＬ−リジン生産菌である。ベクターｐ
ＣＲＢｌｕｎｔ−ｓｕｃＣｉｎｔはＤＳＭ５７１５中で
独立に複製できず、従ってＤＳＭ５７１５の染色体中に
組み込まれた場合、細胞中に残留するだけである。染色
体中に組み込まれたｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣｉｎｔを
有するクローンの選択を、エレクトロポレーションバッ
チの１５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢアガー
（サンブローク他、モレキュラークローニング：研究室
マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボ
ラトリープレス、コールドスプリングハーバー、、Ｎ．
Ｙ．）上へのプレーティングによって実施した。
【００６７】ｓｕｃＣｉｎｔ断片の組み込みを検出する
ために、ｓｕｃＣｉｎｔ断片をベーリンガーマンハイム
ＧｍｂＨ（マンハイム、ドイツ、１９９３）の“フィル
ターハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステムユ
ーザーズガイド”に記載される方法に従ってベーリンガ
ーからのＤｉｇ−ハイブリダイゼーションキット（Dig-
Hybridization Kit）を使用して標識した。潜在的組み
込み体の染色体ＤＮＡをエイクマン他（ミクロバイオロ
ジー１４０：１８１７−１８２８（１９９４））の方法
によって単離し、それぞれの場合に制限酵素ＳｐｈＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られた断片をアガロ
ースゲル電気泳動によって分離し、かつベーリンガーか
らのＤｉｇ−ハイブリダイゼーションキットを使用して
６８℃でハイブリダイズさせた。例３．１で名付けたプ
ラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣｉｎｔはＤＳＭ５７
１５の染色体中で染色体のｓｕｃＣ遺伝子内にそれ自体
を挿入した。該株をＤＳＭ５７１５：：ｐＣＲＢｌｕｎ
ｔｓｕｃＣｉｎｔとして同定した。
ために、ｓｕｃＣｉｎｔ断片をベーリンガーマンハイム
ＧｍｂＨ（マンハイム、ドイツ、１９９３）の“フィル
ターハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステムユ
ーザーズガイド”に記載される方法に従ってベーリンガ
ーからのＤｉｇ−ハイブリダイゼーションキット（Dig-
Hybridization Kit）を使用して標識した。潜在的組み
込み体の染色体ＤＮＡをエイクマン他（ミクロバイオロ
ジー１４０：１８１７−１８２８（１９９４））の方法
によって単離し、それぞれの場合に制限酵素ＳｐｈＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られた断片をアガロ
ースゲル電気泳動によって分離し、かつベーリンガーか
らのＤｉｇ−ハイブリダイゼーションキットを使用して
６８℃でハイブリダイズさせた。例３．１で名付けたプ
ラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣｉｎｔはＤＳＭ５７
１５の染色体中で染色体のｓｕｃＣ遺伝子内にそれ自体
を挿入した。該株をＤＳＭ５７１５：：ｐＣＲＢｌｕｎ
ｔｓｕｃＣｉｎｔとして同定した。
【００６８】４．２ 交換ベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａ
ｃＢｓｕｃＤｄｅｌの構築 例３．２で得られるｓｕｃＤ欠失誘導体を、キアゲンク
イック ゲル エクストラクション キット（キアゲン、
ヒルデン、ドイツ）を使用するアガロースゲル（０．８
％）での分離後にアガロースゲルから単離し、次いでラ
イゲーションのために可動性のクローニングベクターｐ
Ｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ（シャファー他（１９９４）、遺
伝子１４：６９−７３）と一緒に使用した。これは事前
に制限酵素ＸｍａＩおよびＸｂａＩで処理され、ｓｕｃ
Ｄ−欠失対立遺伝子と混合し、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ
（アマシャムファルマシア、フライブルク、ドイツ）で
処理した。
ｃＢｓｕｃＤｄｅｌの構築 例３．２で得られるｓｕｃＤ欠失誘導体を、キアゲンク
イック ゲル エクストラクション キット（キアゲン、
ヒルデン、ドイツ）を使用するアガロースゲル（０．８
％）での分離後にアガロースゲルから単離し、次いでラ
イゲーションのために可動性のクローニングベクターｐ
Ｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ（シャファー他（１９９４）、遺
伝子１４：６９−７３）と一緒に使用した。これは事前
に制限酵素ＸｍａＩおよびＸｂａＩで処理され、ｓｕｃ
Ｄ−欠失対立遺伝子と混合し、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ
（アマシャムファルマシア、フライブルク、ドイツ）で
処理した。
【００６９】次いでＥ．コリ株ＤＨ５αｍｃｒ（グラン
ト、１９９０、国立科学アカデミーＵＳＡの処置、８
７：４６４５−４６４９）にライゲーションバッチをエ
レクトロポレーションした（ハナハン、Ｉｎ．ＤＮＡク
ローニング、実践的アプローチ、Ｖｏｌ．１、ＩＬＲ−
プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、
１９８９）。プラスミドを有する細胞を、形質転換バッ
チの２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢアガー
（サンブローク他、モレキュラークローニング：研究室
マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、
Ｎ．Ｙ．１９８９）上へのプレーティングによって実施
した。
ト、１９９０、国立科学アカデミーＵＳＡの処置、８
７：４６４５−４６４９）にライゲーションバッチをエ
レクトロポレーションした（ハナハン、Ｉｎ．ＤＮＡク
ローニング、実践的アプローチ、Ｖｏｌ．１、ＩＬＲ−
プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、
１９８９）。プラスミドを有する細胞を、形質転換バッ
チの２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢアガー
（サンブローク他、モレキュラークローニング：研究室
マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、
Ｎ．Ｙ．１９８９）上へのプレーティングによって実施
した。
【００７０】プラスミドＤＮＡを形質転換体からキアゲ
ンからのキアプレップ スピン ミニプレップ キットに
よって単離し、かつクローニングしたｓｕｃＤ欠失対立
遺伝子をＭＷＧバイオテック社（エベルスベルク、ドイ
ツ）による配列決定によって確認した。プラスミドをｐ
Ｋ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅｌと名付けた。該株
をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αｍｃｒ／ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃ
ＢｓｕｃＤｄｅｌとして同定した。
ンからのキアプレップ スピン ミニプレップ キットに
よって単離し、かつクローニングしたｓｕｃＤ欠失対立
遺伝子をＭＷＧバイオテック社（エベルスベルク、ドイ
ツ）による配列決定によって確認した。プラスミドをｐ
Ｋ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅｌと名付けた。該株
をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αｍｃｒ／ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃ
ＢｓｕｃＤｄｅｌとして同定した。
【００７１】４．３ Ｃ．グルタミクム株ＤＳＭ５７１
５中のｓｕｃＤ遺伝子の欠失突然変異誘発 例４．２で挙げられるベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ
ｓｕｃＤｄｅｌをタウチ他（１９８９ＦＥＭＳミクロバ
イオロジーレター１２３：３４３−３４７）のエレクト
ロポレーション方法によってエレクトロポレーションし
た。該ベクターはＤＳＭ５７１５中で独立に複製できな
い、従って染色体中に組み込まれた場合には細胞中に残
留するだけである。組み込まれたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃ
ＢｓｕｃＤｄｅｌを有するクローンの選択をエレクトロ
ポレーションバッチの１５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補
ったＬＢアガー（サンブローク他、モレキュラークロー
ニング：研究室マニュアル、第２版、コールドスプリン
グハーバー、Ｎ．Ｙ．１９８９）上へのプレーティング
によって実施した。培養したクローンを２５ｍｇ／ｌの
カナマイシンを含有するＬＢ−アガープレート上にスト
リークし、かつ３３℃で１６時間インキュベートした。
５中のｓｕｃＤ遺伝子の欠失突然変異誘発 例４．２で挙げられるベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ
ｓｕｃＤｄｅｌをタウチ他（１９８９ＦＥＭＳミクロバ
イオロジーレター１２３：３４３−３４７）のエレクト
ロポレーション方法によってエレクトロポレーションし
た。該ベクターはＤＳＭ５７１５中で独立に複製できな
い、従って染色体中に組み込まれた場合には細胞中に残
留するだけである。組み込まれたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃ
ＢｓｕｃＤｄｅｌを有するクローンの選択をエレクトロ
ポレーションバッチの１５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補
ったＬＢアガー（サンブローク他、モレキュラークロー
ニング：研究室マニュアル、第２版、コールドスプリン
グハーバー、Ｎ．Ｙ．１９８９）上へのプレーティング
によって実施した。培養したクローンを２５ｍｇ／ｌの
カナマイシンを含有するＬＢ−アガープレート上にスト
リークし、かつ３３℃で１６時間インキュベートした。
【００７２】ｓｕｃＤ遺伝子の完全な染色体コピーと一
緒にプラスミドを切り出すために、次いでクローンを１
０％のスクロースを含有するＬＢ−アガー上で増殖させ
た。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢはｓａｃＢ遺伝
子のコピーを有し、これはスクロースをＣ．グルタミク
ムに対して毒性でないレバンスクラーゼに変換する。従
って組み込まれたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅ
ｌも切り出されたクローンだけがスクロースを含有する
ＬＢ−アガー上で増殖可能である。切り出しにおいてｓ
ｕｃＤ遺伝子の完全な染色体コピーまたは内部欠失を有
する不完全なコピーがプラスミドと一緒に切り出される
ことがある。
緒にプラスミドを切り出すために、次いでクローンを１
０％のスクロースを含有するＬＢ−アガー上で増殖させ
た。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢはｓａｃＢ遺伝
子のコピーを有し、これはスクロースをＣ．グルタミク
ムに対して毒性でないレバンスクラーゼに変換する。従
って組み込まれたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅ
ｌも切り出されたクローンだけがスクロースを含有する
ＬＢ−アガー上で増殖可能である。切り出しにおいてｓ
ｕｃＤ遺伝子の完全な染色体コピーまたは内部欠失を有
する不完全なコピーがプラスミドと一緒に切り出される
ことがある。
【００７３】ｓｕｃＤの不完全なコピーが染色体中に残
留しているかどうかを検出するために、プラスミドｐＫ
１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅｌ断片をベーリンガー
マンハイムによって発行された“フィルターハイブリダ
イゼーションのためのＤＩＧシステムユーザーズガイ
ド”に記載される方法によってベーリンガーからのＤｉ
ｇハイブリダイゼーション キットを使用して標識し
た。潜在的な欠失変異体をエイクマン他（ミクロバイオ
ロジー１４０：１８１７−１８２８（１９９４））の方
法によって単離し、それぞれの場合において制限酵素Ｓ
ｐｈＩおよびＰｓｔＩを使用して別々の切片に切断し
た。得られた断片をアガロースゲル電気泳動によって分
離し、ベーリンガーからのＤｉｇハイブリダイゼーショ
ン キットを使用して６８℃でハイブリダイズさせた。
得られた断片に基づいて株ＤＳＭ５７１７がｓｕｃＤ遺
伝子のその完全なコピーを失い、かつその代わりに欠失
したコピーだけがなお利用可能であると示された。
留しているかどうかを検出するために、プラスミドｐＫ
１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅｌ断片をベーリンガー
マンハイムによって発行された“フィルターハイブリダ
イゼーションのためのＤＩＧシステムユーザーズガイ
ド”に記載される方法によってベーリンガーからのＤｉ
ｇハイブリダイゼーション キットを使用して標識し
た。潜在的な欠失変異体をエイクマン他（ミクロバイオ
ロジー１４０：１８１７−１８２８（１９９４））の方
法によって単離し、それぞれの場合において制限酵素Ｓ
ｐｈＩおよびＰｓｔＩを使用して別々の切片に切断し
た。得られた断片をアガロースゲル電気泳動によって分
離し、ベーリンガーからのＤｉｇハイブリダイゼーショ
ン キットを使用して６８℃でハイブリダイズさせた。
得られた断片に基づいて株ＤＳＭ５７１７がｓｕｃＤ遺
伝子のその完全なコピーを失い、かつその代わりに欠失
したコピーだけがなお利用可能であると示された。
【００７４】該株はＣ．グルタミクムＤＳＭ５７１５Δ
ｓｕｃＤとして同定された。
ｓｕｃＤとして同定された。
【００７５】例５ ５．１ ＤＳＭ５７１５：：ｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣ
ｉｎｔ株を使用するＬ−グルタメートの製造 例４．１で得られたＣ．グルタミクム株ＤＳＭ５７１
５：：ｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣｉｎｔを適当な栄養培
地中でＬ−グルタメートの製造のために培養し、かつ培
養上清中のグルタメート含有率を決定した。
ｉｎｔ株を使用するＬ−グルタメートの製造 例４．１で得られたＣ．グルタミクム株ＤＳＭ５７１
５：：ｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣｉｎｔを適当な栄養培
地中でＬ−グルタメートの製造のために培養し、かつ培
養上清中のグルタメート含有率を決定した。
【００７６】この目的のために、該株をまず相応の抗生
物質を含有するアガープレート（カナマイシン（２５ｍ
ｇ／ｌ）を有する脳−心臓アガー（brain-heart aga
r））上で３３℃で２４時間インキュベートした。前培
養を前記のアガープレート培養を使用して接種した（１
００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に１０ｍｌ）。
完全培地ＣｇＩＩＩを前培養のための培地として使用し
た。
物質を含有するアガープレート（カナマイシン（２５ｍ
ｇ／ｌ）を有する脳−心臓アガー（brain-heart aga
r））上で３３℃で２４時間インキュベートした。前培
養を前記のアガープレート培養を使用して接種した（１
００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に１０ｍｌ）。
完全培地ＣｇＩＩＩを前培養のための培地として使用し
た。
【００７７】 培地ＣｇＩＩＩ ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ バクト−ペプトン １０ｇ／ｌ バクト−酵母エキス １０ｇ／ｌ グルコース（別にオートクレーブする） ２％（ｗ／ｖ） ｐＨをｐＨ７．４に調整した。
【００７８】この培地にカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）
を添加した。前培養を振盪器において３３℃で２４０ｒ
ｐｍで１６時間インキュベートした。主培養は前記の前
培養から、主培養の初期光学密度（６６０ｎｍ）が０．
１ＯＤになるように接種した。培地ＭＭを主培養のため
に使用した。
を添加した。前培養を振盪器において３３℃で２４０ｒ
ｐｍで１６時間インキュベートした。主培養は前記の前
培養から、主培養の初期光学密度（６６０ｎｍ）が０．
１ＯＤになるように接種した。培地ＭＭを主培養のため
に使用した。
【００７９】 培地ＭＭ ＣＳＬ（コーンスチープリカー） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸） ２０ｇ／ｌ グルコース（別にオートクレーブする） ５０ｇ／ｌ 塩： （ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ５．０ｍｇ／ｌ ビオチン（滅菌濾過） ０．３ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ（滅菌濾過） ０．２ｍｇ／ｌ フマレート（滅菌濾過） ５．８１ｇ／ｌ ロイシン（滅菌濾過） ０．１ｇ／ｌ ＣａＣＯ３ ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水でｐＨ７
に調整し、かつオートクレーブした。滅菌基体およびビ
タミン溶液ならびにオートクレーブした乾燥ＣａＣＯ３
を次いで添加した。
に調整し、かつオートクレーブした。滅菌基体およびビ
タミン溶液ならびにオートクレーブした乾燥ＣａＣＯ３
を次いで添加した。
【００８０】培養はバッフルを有する１００ｍｌのエル
レンマイヤーフラスコ中で１０ｍｌの容量において実施
する。カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養
は３３℃および８０％大気湿気において実施した。
レンマイヤーフラスコ中で１０ｍｌの容量において実施
する。カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養
は３３℃および８０％大気湿気において実施した。
【００８１】２４時間後にＯＤを測定波長６６０ｎｍで
ビオメック１０００装置（Biomek 1000 instrument）
（ベックマン インストルメントＧｍｂＨ、ミュンヘ
ン）を使用して測定した。形成したグルタメートの量を
エッペンドルフ−バイオトロニック（ハンブルク、ドイ
ツ）からのアミノ酸アナライザーにおいてイオン交換ク
ロマトグラフィーおよびニンヒドリン検出による後カラ
ム誘導体化によって測定した。
ビオメック１０００装置（Biomek 1000 instrument）
（ベックマン インストルメントＧｍｂＨ、ミュンヘ
ン）を使用して測定した。形成したグルタメートの量を
エッペンドルフ−バイオトロニック（ハンブルク、ドイ
ツ）からのアミノ酸アナライザーにおいてイオン交換ク
ロマトグラフィーおよびニンヒドリン検出による後カラ
ム誘導体化によって測定した。
【００８２】試験の結果を第１表に示す。
【００８３】
【表１】
【００８４】５．２ 株ＤＳＭ５７１５ΔｓｕｃＤを使
用するＬ−グルタメートの製造 例４．３で得られたＣ．グルタミクム株ＤＳＭ５７１５
／ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅｌをＬ−グルタ
メートの製造のために適当な栄養培地中で培養し、かつ
培養上清中のグルタメート含有率を測定した。
用するＬ−グルタメートの製造 例４．３で得られたＣ．グルタミクム株ＤＳＭ５７１５
／ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅｌをＬ−グルタ
メートの製造のために適当な栄養培地中で培養し、かつ
培養上清中のグルタメート含有率を測定した。
【００８５】この目的のために、該株をまずアガープレ
ート上で３３℃で２４時間インキュベートした。前培養
を該アガープレート培養（１００ｍｌのエルレンマイヤ
ーフラスコ中で１０ｍｌの培地）を使用して接種した。
完全培地ＣｇＩＩＩを前培養のために使用した。この培
地にカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。前培養
を振盪器において３３℃で２４０ｒｐｍで１６時間イン
キュベートした。主培養は前記の前培養から主培養の初
期ＯＤ（６６０ｎｍ）が０．１ＯＤになるように接種し
た。主培養のために培地ＭＭを使用した。
ート上で３３℃で２４時間インキュベートした。前培養
を該アガープレート培養（１００ｍｌのエルレンマイヤ
ーフラスコ中で１０ｍｌの培地）を使用して接種した。
完全培地ＣｇＩＩＩを前培養のために使用した。この培
地にカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。前培養
を振盪器において３３℃で２４０ｒｐｍで１６時間イン
キュベートした。主培養は前記の前培養から主培養の初
期ＯＤ（６６０ｎｍ）が０．１ＯＤになるように接種し
た。主培養のために培地ＭＭを使用した。
【００８６】培養は、バッフルを備えた１００ｍｌエル
レンマイヤーフラスコ中で１０ｍｌの容量において実施
した。培養は、３３℃および８０％大気湿気において実
施した。
レンマイヤーフラスコ中で１０ｍｌの容量において実施
した。培養は、３３℃および８０％大気湿気において実
施した。
【００８７】７２時間後に、ＯＤを６６０ｎｍの測定波
長でビオメック１０００装置（Biomek 1000 instrumen
t）（ベックマン インストルメントＧｍｂＨ、ミュンヘ
ン）を使用して測定した。形成したグルタメートの量を
エッペンドルフ−バイオトロニック（ハンブルク、ドイ
ツ）からのアミノ酸アナライザーにおいてイオン交換ク
ロマトグラフィーおよびニンヒドリン検出による後カラ
ム誘導体化によって測定した。
長でビオメック１０００装置（Biomek 1000 instrumen
t）（ベックマン インストルメントＧｍｂＨ、ミュンヘ
ン）を使用して測定した。形成したグルタメートの量を
エッペンドルフ−バイオトロニック（ハンブルク、ドイ
ツ）からのアミノ酸アナライザーにおいてイオン交換ク
ロマトグラフィーおよびニンヒドリン検出による後カラ
ム誘導体化によって測定した。
【００８８】試験の結果を第２表に示す。
【００８９】
【表２】
【００９０】以下の図面を同封する： 図１：プラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣｉｎｔのマ
ップ 使用される頭字語および略語は以下の意味を有する。
ップ 使用される頭字語および略語は以下の意味を有する。
【００９１】ＫｍＲ：カナマイシン耐性遺伝子 Ｚｅｏｃｉｎ：ゼオシン耐性遺伝子 ＨｉｎｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 ＳｐｈＩ：制限酵素ＳｐｈＩの切断部位 ＥｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ｓｕｃＣｉｎｔ：ｓｕｃＣ遺伝子の内部断片 ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ：プラスミドＣｏｌＥ１の複製起点 図２：プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕｃＤｄｅ
ｌのマップ 使用される頭字語および略語は以下の意味を有する。
ｌのマップ 使用される頭字語および略語は以下の意味を有する。
【００９２】ｏｒｉＶ：ｐＭＢ１のＣｏｌＥ１様開始点 ｓａｃＢ：タンパク質レバンスクラーゼをコードするｓ
ａｃＢ遺伝子 ＲＰ４ｍｏｂ：ＲＰ４可動化部位 Ｋａｎ：カナマイシンのための耐性遺伝子 ｓｕｃＤｄｅｌ：Ｃ．グルタミクムのｓｕｃＤ遺伝子の
欠失した対立遺伝子 ＳｐｈＩ：制限酵素ＳｐｈＩの切断部位 ＰｓｔＩ：制限酵素ＰｓｔＩの切断部位 ＸｍａＩ：制限酵素ＸｍａＩの切断部位 ＸｂａＩ：制限酵素ＸｂａＩの切断部位
ａｃＢ遺伝子 ＲＰ４ｍｏｂ：ＲＰ４可動化部位 Ｋａｎ：カナマイシンのための耐性遺伝子 ｓｕｃＤｄｅｌ：Ｃ．グルタミクムのｓｕｃＤ遺伝子の
欠失した対立遺伝子 ＳｐｈＩ：制限酵素ＳｐｈＩの切断部位 ＰｓｔＩ：制限酵素ＰｓｔＩの切断部位 ＸｍａＩ：制限酵素ＸｍａＩの切断部位 ＸｂａＩ：制限酵素ＸｂａＩの切断部位
【００９３】
【００９４】
【外１】
【００９５】
【外２】
【００９６】
【外３】
【００９７】
【外４】
【００９８】
【外５】
【００９９】
【外６】
【０１００】
【外７】
【図１】図１はプラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔｓｕｃＣｉ
ｎｔのマップを示す。
ｎｔのマップを示す。
【図２】図２はプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｕ
ｃＤｄｅｌのマップを示す。
ｃＤｄｅｌのマップを示す。
ＫｍＲ カナマイシン耐性遺伝子、 Ｚｅｏｃｉｎ ゼ
オシン耐性遺伝子、ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩの切断部位、 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切
断部位、 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部
位、 ｓｕｃＣｉｎｔ ｓｕｃＣ遺伝子の内部断片、
ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ プラスミドＣｏｌＥ１の複製起
点、 ｏｒｉＶ ｐＭＢ１のＣｏｌＥ１様開始点、 ｓ
ａｃＢ タンパク質レバンスクラーゼをコードするｓａ
ｃＢ遺伝子、 ＲＰ４ｍｏｂ ＲＰ４可動化部位、 Ｋ
ａｎ カナマイシンのための耐性遺伝子、 ｓｕｃＤｄ
ｅｌＣ．グルタミクムのｓｕｃＤ遺伝子の欠失した対立
遺伝子、 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切断部位、
ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩの切断部位、 ＸｍａＩ
制限酵素ＸｍａＩの切断部位、 ＸｂａＩ 制限酵素Ｘ
ｂａＩの切断部位
オシン耐性遺伝子、ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩの切断部位、 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切
断部位、 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部
位、 ｓｕｃＣｉｎｔ ｓｕｃＣ遺伝子の内部断片、
ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ プラスミドＣｏｌＥ１の複製起
点、 ｏｒｉＶ ｐＭＢ１のＣｏｌＥ１様開始点、 ｓ
ａｃＢ タンパク質レバンスクラーゼをコードするｓａ
ｃＢ遺伝子、 ＲＰ４ｍｏｂ ＲＰ４可動化部位、 Ｋ
ａｎ カナマイシンのための耐性遺伝子、 ｓｕｃＤｄ
ｅｌＣ．グルタミクムのｓｕｃＤ遺伝子の欠失した対立
遺伝子、 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切断部位、
ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩの切断部位、 ＸｍａＩ
制限酵素ＸｍａＩの切断部位、 ＸｂａＩ 制限酵素Ｘ
ｂａＩの切断部位
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月２７日（２０００．１２．
２７）
２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１００】
【外７】
【外８】
【外９】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ヴァルター プフェッフェルレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33 (72)発明者 アーヒム マルクス ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アル テンブレーデ ４ベー
Claims (18)
- 【請求項１】 ｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ
遺伝子をコードし、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％まで同
一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％まで同
一であるポリヌクレオチド、 ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、 ｄ）配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも７０％まで
同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、 ｅ）ポリヌクレオチドａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）に相
補的であるポリヌクレオチド、および ｆ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）また
はｅ）の少なくとも１５個の連続的なヌクレオチドを有
するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌ
クレオチド配列を有し、その際、有利には前記ポリペプ
チドがスクシニル−ＣｏＡシンセターゼ活性を有する単
離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがコリネ型細菌中で複
製可能な、有利には組み換えＤＮＡである、請求項１記
載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示されるような核酸配列を
有する、請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 複製可能であり、（ｉ）配列番号１に示
されるヌクレオチド配列、または（ｉｉ）遺伝コードの
縮重の範囲内で配列（ｉ）に相応する少なくとも１つの
配列、または（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相
補的な配列とハイブリダイズする少なくとも１つの配
列、および場合により（ｉｖ）（ｉ）における機能的中
立なセンス突然変異を有する請求項２記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 ハイブリダイゼーションを２×ＳＳＣ以
下に相当するストリンジェントな条件下で実施する、請
求項５記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項７】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードする、請求項１記載のポリヌ
クレオチド配列。 - 【請求項８】 ｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ
遺伝子が減衰された、コリネ型細菌。 - 【請求項９】 Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンおよび／
またはＬ−グルタメートを製造するための方法におい
て、 ａ）まずｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺伝子
またはそれをコードするヌクレオチド配列が減衰、特に
スイッチオフされた、所望のＬ−アミノ酸を産生する細
菌の発酵工程； ｂ）培地または細菌細胞におけるＬ−アミノ酸の富化工
程、および ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離工程を実施することを特徴とす
る、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンおよび／またはＬ−
グルタメートの製造方法。 - 【請求項１０】 所望のＬ−アミノ酸の生合成経路の他
の遺伝子を更に強化する、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 所望のＬ−アミノ酸の形成を低下させ
る代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされてい
る細菌を使用する、請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】 ｓｕｃＣ遺伝子もしくはｓｕｃＤ遺伝
子をコードするポリヌクレオチドの発現を減衰、特にス
イッチオフする、請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】 ポリヌクレオチドｓｕｃＣおよびｓｕ
ｃＤがコードするポリペプチド（酵素タンパク質）の触
媒特性を低下させる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１４】 Ｌ−アミノ酸の製造のために、同時に
以下の群： １４．１ ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードす
るｄａｐＡ遺伝子、 １４．２ ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐ
ｙｃ遺伝子、 １４．３ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼをコードするｇａｐ遺伝子 １４．４ トリオースリン酸イソメラーゼをコードする
遺伝子ｔｐｉ、 １４．５ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードす
る遺伝子ｐｇｋ、 １４．６ マレイン酸：キノンオキシドレダクターゼを
コードするｍｑｏ遺伝子、 １４．７ Ｌ−リジン輸送をコードするｌｙｓＥ遺伝
子、 １４．８ フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ
をコードする遺伝子ｌｙｓＣ、 １４．９ Ｚｗａ１−タンパク質をコードする遺伝子ｚ
ｗａ１ から選択される１種以上の遺伝子が強化もしくは過剰発
現されている微生物を発酵させる、請求項９記載の方
法。 - 【請求項１５】 Ｌ−アミノ酸の製造のために、同時に
以下の群：１５．１ ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシキナーゼをコードする遺伝子ｐｃｋ、 １５．２ グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコー
ドする遺伝子ｐｇｉ、 １５．３ ピルビン酸−オキシダーゼをコードする遺伝
子ｐｏｘＢ、 １５．４ Ｚｗａ２−タンパク質をコードする遺伝子ｚ
ｗａ２ から選択される１種以上の遺伝子が減衰されているコリ
ネ型微生物を発酵させる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項１記載のポリヌクレオチドの部
分を有するが、請求された配列の少なくとも１５個の連
続的なヌクレオチドを有する、ベクターを有するコリネ
型細菌。 - 【請求項１７】 コリネバクテリウム グルタミクムの
種類の微生物を使用する、請求項９から１６までのいず
れか１項記載の方法。 - 【請求項１８】 核酸もしくはポリヌクレオチドまたは
スクシニル−ＣｏＡシンターゼをコードするか、または
ｓｕｃＣ遺伝子および／またはｓｕｃＤ遺伝子の配列に
高い類似性を有する遺伝子を単離するために、ＲＮＡ、
ｃＤＮＡおよびＤＮＡを検出する方法において、請求項
１、２、３または４記載のポリヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブ
として使用することを特徴とする、ＲＮＡ、ｃＤＮＡお
よびＤＮＡの検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19956686A DE19956686A1 (de) | 1999-11-25 | 1999-11-25 | Neue für die Gene sucC und sucD codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19956686.0 | 1999-11-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001190290A true JP2001190290A (ja) | 2001-07-17 |
Family
ID=7930268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000358256A Pending JP2001190290A (ja) | 1999-11-25 | 2000-11-24 | 遺伝子ｓｕｃＣおよびｓｕｃＤをコードする新規のヌクレオチド配列 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6623946B1 (ja) |
| EP (1) | EP1103611A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001190290A (ja) |
| KR (1) | KR20010051915A (ja) |
| CN (1) | CN1298019A (ja) |
| AU (1) | AU7183700A (ja) |
| BR (1) | BR0005608A (ja) |
| CA (1) | CA2324496A1 (ja) |
| DE (1) | DE19956686A1 (ja) |
| HU (1) | HUP0004715A2 (ja) |
| ID (1) | ID28476A (ja) |
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