SK17352000A3 - Nukleotidov sekvencie kdujce gn succ a sucd - Google Patents

Nukleotidov sekvencie kdujce gn succ a sucd Download PDF

Info

Publication number
SK17352000A3
SK17352000A3 SK1735-2000A SK17352000A SK17352000A3 SK 17352000 A3 SK17352000 A3 SK 17352000A3 SK 17352000 A SK17352000 A SK 17352000A SK 17352000 A3 SK17352000 A3 SK 17352000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ala
polynucleotide
gene
gly
sequence
Prior art date
Application number
SK1735-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Bettina M�Ckel
Walter Pfefferle
Achim Marx
Original Assignee
Degussa-h�ls aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa-h�ls aktiengesellschaft filed Critical Degussa-h�ls aktiengesellschaft
Publication of SK17352000A3 publication Critical patent/SK17352000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predmetom vynálezu sú nukleotidové sekvencie z koryneformných baktérii kódujúce gén sucC a gén sucD a spôsob fermentačnej výroby aminokyselín, najmä L-lyzínu a L-glutamátu, použitím baktérií, v ktorých sa zoslabuje gén sucC a/alebo gén sucD.
Doterajší stav techniky
L-Aminokyseliny, najmä L-lyzín a L-glutamát, sa používajú v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, v potravinárskom priemysle a celkom obzvlášť vo výžive zvi erat.
Je známe, že aminokyseliny sa vyrábajú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum). Kvôli veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení spôsobov výroby. Zlepšenia spôsobov sa môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných úžitkových vlastností samotného mikroorganizmu.
Na zlepšenie úžitkových vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získajú kmene, ktoré sú rezistentné • · ·· · ·· ·· ·· · · · · * · • · ···· ·· • · · · · ···· · · · • 9 9 9 9 · · voči antimetabolitom alebo auxotrofné vzhladom na regulačné významné metabolity a produkujú aminokyseliny.
Už niekoľko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňov Corynebacterium produkujúcich L-aminokyseliny.
Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové opatrenia na zlepšenú fermentačnú výrobu aminokyselín, najmä L-lyzínu a L-glutamátu.
Keď sa v nasledovnom texte uvedie pojem L-aminokyseliny alebo aminokyseliny, mieni sa tým jedna alebo viac aminokyselín vrátane ich solí, zvolených zo skupiny zahŕňajúcej L-asparagín, L-treonín, L-serín, L-glutamát, L-glycín, L-alanín, L-cysteín, L-valín, L-metionín, L-izoleucín, L-leucín, L-tyrozín, L-fenylalanín, L-histidín, L-lyzín, L-tryptofán a L-arginín. Obzvlášť prednostný je L-lyzín a L-glutamát.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je izolovaný polynukleotid obsahujúci polynukJeotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahŕňajúcej
a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID No. 2,
b) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú .sekvenciu SEQ ID No. 3, • · • · · · ·· ······« · • · · · · • ·· · ·· ·
c) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No. 2,
d) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No. 3,
e) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom a), b), c) alebo d), a
f) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov polynukleotidovej sekvencie a), b), c), d) alebo e) , pričom polypeptid prednostne vykazuje aktivitu sukcinyl-CoAsyntetázy.
Predmetom vynálezu je aj polynukleotid podía nároku 1, pričom sa prednostne jedná o replikovatelnú DNA obsahujúcu:
(i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1 alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencií (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá sa hybridizuje so sekvenciou komplementárnou k sekvencií (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).
• ·
44 • · • 4 4 • 4
444 ··· ·· 4 44 • · · 4 4 4
4 4 4 4 4 • · ···· · · 4 • 4 4 4 4
4 44 4
Ďalšími predmetmi sú polynukleotid podlá nároku 4 obsahujúci nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1, polynukleotid podlá nároku 1, pričom týmto polynukleotidom je prednostne rekombinantné DNA replikovatelná v koryneformných baktériách, vektor obsahujúci časti polynukleotidu podlá vynálezu, najmenej však 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov nárokovanej sekvencie, a koryneformné baktérie, v ktorých je najmä inzerciou alebo deléciou zoslabený gén sucC a/alebo gén sucD.
Predmetom vynálezu sú aj polynukleotidy, ktoré sa skladajú v podstate z polynukleotidovej sekvencie, ktoré možno získať skríningom prostredníctvom hybridizácie príslušnej génovej banky, ktorá obsahuje úplný gén sucC a/alebo gén sucD s poiynukleotidovou sekvenciou zodpovedajúcou SEQ ID No. 1, pomocou sondy, ktorá obsahuje sekvenciu uvedeného polynukleotidu podľa SEQ ID No. 1 alebo jej fragment, a izoláciou uvedenej sekvencie DNA.
Polynukleotidy, ktoré obsahujú sekvencie podlá vynálezu, sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA, aby sa izolovali nukleové kyseliny, poprípade polynukleotidy alebo gény s celou dĺžkou, ktoré kódujú sukcinyl-CoA-syntetázu, a aby sa izolovali také cDNA alebo gény, ktoré vykazujú veľkú podobnosť sekvencie so sekvenciou génov pre sukcinyl-CoA-syntetázu.
·· · ·· • · · · · · • · · · · ·
9 9 9999 9 9 9
9999 ·· ·· 9
Polynukleotidy, ktoré obsahujú sekvencie podľa vynálezu, sú ďalej vhodné ako priméry, pomocou ktorých sa môže pripraviť polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) DNA génov, ktoré kódujú sukcinyl-CoA-syntetázu.
Také oligonukleotidy slúžiace ako sondy alebo priméry obsahujú aspoň 30, prednostne aspoň 20, celkom obzvlášť prednostne aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov. Vhodné sú taktiež oligonukleotidy s dĺžkou aspoň 40 alebo 50 nukleotidov.
„Izolovaný znamená oddelený zo svojho prirodzeného prostredia.
„Polynukleotid sa vzťahuje všeobecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom sa môže jednať o nemodifikované RNA alebo DNA alebo modifikované RNA alebo DNA.
Pod pojmom „polypeptidy” sa rozumejú peptidy alebo proteíny, ktoré obsahujú dve alebo viac aminokyselín viazaných peptidovými väzbami.
Polypeptidy podlá vynálezu zahŕňajú polypeptidy podľa SEQ ID No. 2 a SEQ ID No. 3, najmä také, ktoré majú biologickú aktivitu sukcinyl-CoA-syntetázy a aj také, ktoré sú aspoň na 70 % identické s polypeptidom podlá SEQ ID No. 2 alebo SEQ ID No. 3, prednostne aspoň na 80 % a obzvlášť také, ktoré vykazujú aspoň 90% až 95% identitu s polypeptidom podľa SEQ ID No. 2 alebo SEQ ID No. 3 a prejavujú uvedenú aktivitu.
Vynález sa ďalej týka spôsobu fermentačnej výroby β · · · · · · ·· ·· · · · · · · • · ···· e · w · · · · ···· · · * • « · · · · · ······ ·· · ·· 9 aminokyselín zvolených zo skupiny zahŕňajúcej L-asparagín, L-treonin, L-serín, L-glutamát, L-glycín, L-alanín, L-cysteín, L-valin, L-metionín, L-izoleucín, L-leucin, L-tyrozín, L-fenylalanin, L-histidín, L-lyzín, L-tryptofán a L-arginín, najmä L-lyzín a L-glutamát, použitím koryneformných baktérií, ktoré najmä už produkujú aminokyseliny, najmä L-lyzín a/alebo L-glutamát, a v ktorých sa zoslabujú, najmä na nízkej úrovni exprimujú nukleotidové sekvencie kódujúce gén sucC a/alebo gén sucD.
Pojem „zoslabenie opisuje v tejto súvislosti zníženie alebo elimináciu intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov (proteínov) v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA, tým, že sa napríklad použije sa slabý promótor alebo sa použije gén, poprípade alela, ktorá kóduje príslušný enzým s nízkou aktivitou, poprípade sa príslušný gén alebo enzým (proteín) inaktivuje a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.
Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať aminokyseliny, najmä L-lyzín, z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Môže sa jednať o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.
Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú najmä známe kmene divého typu
Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ÄTCC15806,
Ί • · · · · ·· «· ·· · · · · · · • · ···· · · « · · · ······· · • · · · · · * ······ ·· · · · ·
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium melassecola ATCC17965,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a Brevibacterium divariča t um ATCC1402O a z nich vytvorené mutanty, poprípade kmene, produkujúce L-aminokyseliny, ako napríklad kmene produkujúce L-lyzín
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708,
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a Corynebacterium glutamicum DSM5714.
Izoloval sa nový gén sucC a gén sucD z C. glutamicum kódujúci enzým sukcinyl-CoA-syntetázu (E.C. 6.2.1.5).
Na izoláciu génu sucC a/alebo sucD alebo aj iných génov z C. glutamicum sa najskôr založí génová banka tohto mikroorganizmu v E. coli. Založenie génových bánk je opísané vo všeobecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesc učebnicu od Winnackera: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku od Sambrooka et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Velmi známou génovou bankou je génová banka kmeňa W3110 E. coli K-12, ktorú založili Kohara et al. (Celí 50, 495 - 508 (1987)) v λ-vektoroch. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032, ktorá bola založená pomocou • « ·· · «· · ·· ·· · · · · · ·· • · · · · · » · · • 9 9 9 9 9999 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
999999 99 9 99 ··· kozmidového vektora SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) v kmeni NM554 E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575).
Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) zasa opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032 s použitím kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). O'Donohue (The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph. D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997) opisuje klonovanie génov C. glutamicum použitím systému expresie λ Zap opísaného v Short et al. (Nucleic Acids Research, 16: 7583).
Na vytvorenie génovej banky C. glutamicum v E. coli sa môžu použiť aj plazmidy, ako napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979) alebo pUC9 (Vieira et al.,
1982, Gene, 19:259-268). Ako hostitelia sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne defektné, napríklad kmeň DH5a (Jeffrey H. Miller: „A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1992).
Dlhé fragmenty DNA klonované pomocou kozmidov alebo λ-vektorov sa potom zasa môžu subklonovat do bežných vektorov vhodných na sekvenovanie DNA.
Metódy sekvenovania DNA sa opisujú medzi iným v Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74:5463-5467, (1977)).
• · · ·· «· · · · · · · • · · · · · 9 ·· ······· <· • 9 9 9 9 9
Získané sekvencie DNA sa potom môžu skúmať známymi algoritmami, poprípade programami na sekvenčnú analýzu, napríklad pomocou Staden (Nucleic Acids Research 14, 217232(1986)), pomocou programu GCG od Butlera (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)), pomocou algoritmu FASTA od Pearsona a Lipmana (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85,2444-2448 (1988)) alebo pomocou algoritmu BLAST od Altschul et al. (Náture Genetics 6, 119129 (1994)) a porovnať so zápismi sekvencii vo verejne prístupných databankách. Verejne prístupnými databankami pre nukleotioové sekvencie sú napríklad European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Nemecko) alebo databanka National Center for Biotechnology Information (NCBI, BeĽhesda, MD, USA).
Našli sa nové sekvencie DNA z C. glutamicum kódujúce gén sucC a gén sucD, ktoré sú ako SEQ ID No. 1 súčasťou predloženého vynálezu. Ďalej sa z týchto sekvencii DNA odvodila aminokyselinová sekvencia príslušných proteínov pomocou vyššie opísaných metód. V SEQ ID No. 2 a SEQ ID No.
sú znázornené vyplývajúce aminokyselinové sekvencie génového produktu sucC a sucD.
Kódujúce sekvencie DNA, ktoré vyplývajú z SEQ ID No. 1 v dôsledku degenerovateľnosti genetického kódu, sú taktiež súčasťou vynálezu. Súčasťou vynálezu sú rovnako aj sekvencie DNA, ktoré sa hybridizujú s SEQ ID No. 1 alebo časťami SEQ ID No. 1. Napokon sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa pripravujú polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) použitím primérov, ktoré vyplývajú z SEQ ID No. 1.
Návody na identifikáciu sekvencii DNA pomocou hybridizácie nájde odborník medzi iným v príručke „The DIG System • · · · · · · ·· ·· · · · · · · • · ···· · · • · · · ······· · ······ · ··
Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a v Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Hybridizácia sa uskutočňuje za stringentných podmienok, to znamená, že sa vytvárajú len hybridy, pri ktorých je sonda a aspoň na 70 % identická s cieľovou sekvenciou, to znamená s polynukleotidmi spracovanými sondou. Je známe, že stringencia hybridizácie vrátane krokov premývania sa ovplyvňuje, poprípade určuje pomocou zmeny zloženia tlmivých roztokov, teploty a koncentrácie solí. Hybridizačná reakcia sa uskutočňuje predovšetkým pri relatívne nízkej stringencii v porovnaní s krokmi premývania (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Na hybridizačnú reakciu sa môže použiť napríklad tlmivý roztok 5x SSC pri teplote približne 50 až 68 °C. Pri tom sa môžu sondy hybridizovať aj s polynukleotidmi, ktoré vykazujú menšiu identitu so sekvenciou sondy ako 70 %. Také hybridy sú menej stabilné a odstraňujú sa premývaním za stringentných podmienok. To sa môže dosiahnuť napríklad znížením koncentrácie solí na 2x SSC a poprípade následne na 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Nemecko, 1995), pričom sa nastaví teplota na približne 50 až 68 °C. Poprípade je možné, aby koncentrácia solí klesla až na 0,lx SSC. Postupným zvýšením teploty hybridizácie z 50 °C na 68 °C v krokoch po približne 1 až 2 °C sa môžu izolovať fragmenty polynukleotidov, ktoré majú napríklad aspoň 70% alebo aspoň 80% alebo aspoň 90% až 95% identitu so sekvenciou použitej sondy. Ďalšie návody na hybridizáciu sú dostupné na trhu vo forme takzvaných kitov (napríklad DIG Easy Hyb od firmy Roche Diagnstics GmbH, Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1603558).
• · · · · ftft • ft ·· ··· · · · ft · · · · · ·· • · ·· ······· · ······ ftft · ·· ···
Návody na amplifikáciu sekvencií DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) nájde odborník medzi iným v príručke Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Velká Británia, 1984) a v Newton a Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Nemecko, 1994).
Zistilo sa, že koryneformné baktérie po zoslabení génu sucC a/alebo génu sucD produkujú zlepšeným spôsobom L-aminokyseliny, najmä L-lyzín.
Na dosiahnutie zoslabenia sa môže znížiť alebo vylúčiť buď expresia génu sucC a/alebo génu sucD, alebo katalytické vlastnosti enzýmových proteínov. Poprípade sa môžu obidve tieto opatrenia kombinovať.
Zníženie expresie génov môže nastať vhodným uskutočnením kultivácie alebo genetickou zmenou (mutáciou) signálnej štruktúry expresie génov. Signálnymi štruktúrami expresie génov sú napríklad represorové gény, aktivátorové gény, operátory, promótory, atenuátory, väzbové miesta ribozómov, iniciačný kodón a terminátory. Údaje k tomu nájde odborník napríklad v patentovej prihláške WO 96/15246, v Boyd a Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), vo Voskuil a Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), v Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), v Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad v učebnici od Knippers („Molekulare Genetik, 6. vydanie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995) alebo Winnacker („Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko, 1990).
• · 4 · 4 4 4
44 · 4 · · · · • · · · · · 4 4 • · · · 4444444 ·
444 ·· 4· · 4 4 4
Mutácie, ktoré vedú k zmene, poprípade zoslabeniu katalytických vlastností enzýmových proteínov, sú známe zo stavu techniky; ako príklady sa môžu uviesť práce od Qiu a Goodmana (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugirnoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) a Môckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms, správy výskumného centra Julichs, Jul-2906, ISSN09442952, Julich, Nemecko, 1994). Súborné opísania sa môžu prevziať zo známych učebníc genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad Hagemann („Allgemeine Genetik”, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Ako mutácie prichádzajú do úvahy tranzície, transverzie, inzercie a delécie. V závislosti od účinku zámeny aminokyselín na enzýmovú aktivitu sa hovorí o mutáciách s pozmeneným zmyslom („missense mutations) alebo mutáciách bez zmyslu („nonsense mutations”). Inzercie alebo delécie aspoň jedného páru báz v géne vedú k posunovým mutáciám („frame shift mutations), následkom ktorých sa vkladajú nesprávne aminokyseliny alebo sa predčasne prerušuje translácia. Delécie viacerých kodónov vedú typicky k úplnému zlyhaniu enzýmovej aktivity. Návody na vytvorenie takých mutácií patria do stavu techniky a môžu sa nájsť v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad v učebnici od Knippers („Molekulare Genetik”, 6. vydanie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995), Winnacker („Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
• · · · · · · a · ·· · · · β·· • · ···· · « • · « · 9 ··· 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9
999 999 99 · ·· ·
Obvyklou metódou mutácie génov C. glutamicum je metóda prerušenia génu („gene disruption) a zámeny génov („gene replacement”), ktorú opísal Schwarzer a Píihler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991).
Pri metóde prerušenia génov sa centrálna časť kódujúcej oblasti záujmového génu klonuje do plazmidového vektora, ktorý sa môže replikovať v hostiteľovi (typicky E. coli), avšak nie v C. glutamicum. Ako vektory prichádzajú do úvahy napríklad pSUP301 (Sirnon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1933)), pK18mob alebo pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB alebo pK19mobsacB (Jáger et al., Journal of Bacteriology 174:5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US patent 5,437,993), pCR®Blunt (firma Invitrogen, Groningen, Holandsko; Bernard et al., Journal of Molecular Biology,
234: 534-541 (1993)) alebo pEMl (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516). Plazmidový vektor, ktorý obsahuje centrálnu časť kódujúcej oblasti génu sa potom prenesie konjugáciou alebo transformáciou do žiadaného kmeňa C. glutamicum.
Metóda konjugácie je opísaná napríklad v Schäfer et al., (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Metódy transformácie sa opisujú napríklad v Thierbach et al·., (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican a Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) a Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Po homológnej rekombinácii pomocou „c.ross over udalosti sa kódujúca oblasť uvedeného génu preruší pomocou vektorovej sekvencie a získajú sa dve neúplné alely, ktorým chýbajú 3'-, poprípade 5'-konce. Túto • · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • e ···· · e • · · · · ···· 9 9 9
9 9 9 9 9 9
999 999 99 9 99 9 metódu použil napríklad Fitzpatrick et al. (Applied
Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) na elimináciu génu recA z C. glutamicum. Gén sucC a/alebo gén sucD sa môžu týmto spôsobom eliminovať.
Pri metóde zámeny génov („gene replacement) sa mutácia, napríklad delécia, inzercia alebo zámena báz, vytvára v záujmovom géne in vitro. Pripravená alela sa zasa klonuje do vektora nereplikatívneho pre C. glutamicum a tento sa potom prenesie transformáciou alebo konjugáciou do žiadaného hostiteľa C. glutamicum. Po homológnej rekombinácii prostredníctvom prvej udalosti „cross-over spôsobujúcej integráciu a vhodnej druhej udalosti „crossover spôsobujúcej excíziu v cieľovom géne, poprípade v cieľovej sekvencií sa dosiahne zavedenie mutácie, poprípade alely. Túto metódu použil napríklad Peters-Wendisch (Microbiology 144, 915 -927 (1998)), aby deléciou eliminoval gén pyc z C. glutamicum. Do génu sucC a/alebo sucD sa týmto spôsobom môže zaviesť delécia, inzercia alebo zámena báz.
Do génu sucC a/alebo sucD sa týmto spôsobom môže zaviesť delécia, inzercia alebo zámena báz.
Prídavné môže byť pre produkciu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné prídavné k zoslabeniu génu sucC a/alebo sucD zosilniť, najmä nadmerne exprimovať jeden alebo viac enzýmov danej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky, cyklu kyseliny citrónovej alebo exportu aminokyselín.
Takto sa napríklad môže na prípravu L-lyzínu a/alebo L-glutamátu okrem zoslabenia génu sucC a/alebo sucD súčasne zosilniť, najmä nadmerne exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335), • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086) , • gén tpi kódujúci triózafosfátizomerázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén pgk kódujúci 3-fosfoglycerátkinázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Eikmanns (1992),
Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254: 395-403 (1998)), • gén lysC kódujúci „feed back rezistentnú aspartátkinázu (prírastkové číslo P26512), • gén lysE kódujúci export L-lyzínu (DE-A-195 48 222), • gén zwal kódujúci protein Zwal (DE: 19959328.0, DSM
13115).
Ďalej môže byť pre produkciu L-lyzínu a/alebo L-glutamátu výhodné okrem zoslabenia génu sucC a/alebo sucD súčasne zoslabiť, najmä znížiť expresiu ·· ·
• ···· · · • ·· · • génu pck kódujúceho fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE
199 50 409.1, DSM 13047), • génu pgi kódujúceho glukóza-6-fosfátizomerázu (US 09/396,478, DSM 12969), • génu poxB kódujúceho pyruvátoxidázu (DE: 1995 1975.7, DSM 13114), • génu zwa2 kódujúceho protein Zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113).
Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu a/alebo L-glutamátu, okrem zoslabenia génu sucC a/alebo sucD výhodné vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982).
Mikroorganizmy obsahujúce polynukleotid podlá nároku 1 sú taktiež predmetom vynálezu a môžu sa na účely produkcie L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, kultivovať kontinuálne alebo diskontinuálne spôsobom batch (vsádzková kultivácia) alebo spôsobom fed batch (prítokový systém) alebo spôsobom repeated fed batch (opakovaný prítokový systém). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici od Chmiela (Bioprozesstechnik 1. Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici od Storhasa (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
• * ·· · ·· · ·· ·· · · · · · ·· e · ···· ··· • · · · · ···· · · · · • · ··· ··· ··· ··· ·· · ·· ···
Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných kmeňov. Opisy kultivačných médií rozličných mikroorganizmov sa nachádzajú v príručke „Manual of Methods for General Bacteriology od American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).
Ako zdroje uhlíka sa môžu používať cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej; mastné kyseliny, ako je kyselina palmitová, kyselina stearová, kyselina linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerol a etanol; a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu používať ako jednotlivé zložky alebo ako zmes.
Ako zdroje dusíka sa môžu používať organické zlúčeniny obsahujúce dusík, napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, slčidový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka sa môžu používať jednotlivo alebo ako zmes.
Ako zdroje fosforu sa môže používať kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré sú potrebné na rast. Napokon sa môžu dodatočne k vyššie uvedeným látkam používať esenciálne rastové látky, ako sú aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu okrem toho pridávať vhodné prekurzory. Uvedené vsádzkové suroviny sa môžu ku kultúre • · · • · • · · • · ·· · • · ··· ··· ·· ·· · • · · • I · · • · ···· • · · ·· · pridávať vo forme jednorazovej vsádzky alebo sa môžu vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.
Na kontrolu pH kultúry sa vhodne používajú zásadité zlúčeniny, ako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, poprípade amoniaková voda, alebo kyslé zlúčeniny, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny sa môžu používať odpeňovadlá, ako napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Na udržiavanie stability plazmidov sa môžu k médiu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky, napríklad antibiotiká. Aby sa udržiavali aeróbne podmienky, zavádza sa do kultúry kyslík alebo zmesi plynov obsahujúce kyslík, napríklad vzduch. Teplota kultúry je zvyčajne približne 20 °C až 45 °C a najmä približne 25 °C až 40 °C. Kultúra sa udržiava tak dlho, kým sa nevytvorí maximum žiadaného produktu. Tento cieľ sa zvyčajne dosiahne za 10 hodín až 160 hodín.
Metódy stanovenia L-aminokyselín sú známe zo stavu techniky. Analýza sa môže uskutočňovať tak, ako sa opisuje v Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190) anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou alebo sa môže uskutočňovať pomocou HPLC v obrátenej fáze („reversed phase HPLC), ako sa opisuje v Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 11671174).
Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie objasňuje na základe príkladov uskutočnenia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 • · · · • · ····· • ·· · ·· ·
Vytvorenie genómovej kozmidovej génovej banky z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromozómová DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sa izolovala tak, ako sa opisuje v Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179), a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom 5au3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, Code no. 27-0913-02). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (shrimp) (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, opj s produktu SAP, Code no. 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), získaná od firmy Stratagene (La Jolla, USA, opis produktu SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301), sa štiepila reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Xbal, Code no. 27-0948-02) a taktiež defosforylovala alkalickou fosfatázou z garnátov. Následne sa kozmidová DNA štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, Code no. 27-086804). Týmto spôsobom spracovaná kozmidová DNA sa zmiešala so spracovanou DNA ATCC13032 a zmes sa spracovala T4-DNA-ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-DNA-ligaza, Code no. 27-0870-04). Ligačná zmes sa potom pomocou Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, opis produktu Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) vbalila do fágov. Na infekciu kmeňa E. coli NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:15631575) sa bunky extrahovali v lOmM MgSOí a zmiešali s alikvotom suspenzie fágov. Infekcia a titrácia kozmidovej banky sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom sa bunky naniesli na agar LB (Lennox, 1955, • · ·· · ·· • · · · · · • · · · · · • · · ···· · · · • · · · · ·· · ·· ·
Virology, 1:190) so 100 pg/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony.
Príklad 2
Izolácia a sekvenovanie génu sucC a génu sucD
Kozmidová DNA jednej jednotlivej kolónie sa izolovala pomocou Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa údajov výrobcu a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, produkt č. 27-091302). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, produkt č. 1758250). Po separácii gélovou elektroforézou sa uskutočnila izolácia kozmidových plazmidov s rozsahom veľkostí 1 500 až 2 000 bp pomocou QiaExlI gel Extraction Kit (produkt č. 20021, Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA sekvenovacieho vektora pZero-1, získaná od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, opis produktu Zero Background Cloning Kit, produkt č. K2500-01), sa štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, produkt č. 27-086804). Ligácia kozmidových fragmentov do sekvenovacieho vektora pZero-1 sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) sa inkubovala cez noc. Táto ligačná zmes sa následne elektroporovala (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) do kmeňa E. coli DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) a naniesla na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s 50 pg/ml zeocínu. Plazmidová • · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • · ···· ·· • · · · · ···· · · · • · · · · · · ··· ··· ·· · ·· · preparácia rekombinantných klonov sa uskutočňovala pomocou Biorobot 9600 (product č. 900200, Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenovanie sa uskutočňovalo dideoxymetódou ukončenia reťazca od Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A.,74:5463-5467) s modifikáciami podlá Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Použil sa „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od PS Applied Biosystems (produkt č. 403044, Weiterstacit, Nemecko) . Separácia gélovou elektroforézou a analýza reakcie na sekvenovanie sa uskutočňovala v géle „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (produkt č. A124.1, Roth, Karslruhe, Nemecko) pomocou prístroja na sekvenovanie „ABI Prism 377 od PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).
Získané nespracované údaje o sekvenciách sa následne spracovali procesorom použitím programového balíka Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) Version 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov pZerol sa zostavili do jedného súvislého celku. Počítačová analýza kódujúcich oblastí sa uskutočnila pomocou programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Ďalšie analýzy sa uskutočnili pomocou „BLAST search programs (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) proti neredundantnej databanke od „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) .
Získaná nukleotidová sekvencia je znázornená v SEQ ID NO 1. Analýza nukleotidovej sekvencie poskytla otvorený čítací raster s 1 206 pármi báz, ktorý sa označil ako gén sucC, a otvorený čítací raster s 882 pármi báz, ktorý sa označil ako sucD. Gén sucC kóduje polypeptid so 402 aminokyselinami, ktorý je znázornený v SEQ ID No. 2. Gén • « ·· · ·· · ·· ·· · · · · · ·· • · · · · · · · · • · · · · ···· · · · · • · ··· · · · ··· ··· ·· · ·· ··· sucD kóduje polypeptid s 294 aminokyselinami, ktorý je znázornený v SEQ ID No. 3.
Príklad 3
3.1 Príprava integračného vektora na integračnú mutagenézu génu sucC
Z kmeňa ATCC 13032 sa metódou podlá Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) izolovala chromózomová DNA. Na základe sekvencie génu sucC známej z príkladu 2 pre C. glutamicum sa selektovali nasledovné oligonukleotidy pre polymerázovú reťazovú reakciu:
sucC-inl:
5'CGC GCG AAT CGT TCG TAT 3' sucC-in2:
5'CGC CAC CAA TGT CTA GGA 3'
Znázornené priméry syntetizovala firma MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko) a PCR reakcia sa uskutočnila podľa štandardnej metódy PCR od Innisa et al. (PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) s polymerázou Pwo od firmy Boehringer Mannheim (Nemecko, opis produktu Pwo DNA-polymeráza, produkt č. 1 644 947). Pomocou tejto polymerázovej reťazovej reakcie umožnili priméry amplifikáciu interného fragmentu génu sucC s veľkosťou 0,55 kb. Takto amplifikovaný produkt sa skúmal elektroforézou v 0,8% agarózovom géle.
Amplifikovaný fragment DNA sa ligoval pomocou Zero Blunt™ Kit od firmy Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; katalógové číslo K2700-20) do vektora pCR®Blunt II • · ·· · 99 · ·· ·· ··· · 9 ·· • · ···· 9 9 9 • · · · · ···· · · · · • · 9 9 9 9 9 9
999 999 99 9 99 999 (Bernard er al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) .
Kmeň E. coli TOPIO sa potom elektroporoval s ligačnou zmesou (Eanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 25 mg/1 kanamycínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a následnou elektroforézou v agarózovom géle (0,8%). Plazmid sa nazval pCRBluntsucCint a je znázornený na obrázku 1.
3.2 Delécia génu sucD
Na tento účel sa z kmeňa ATCC13032 metódou podlá Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179) izolovala chromózomová DNA. Na záKLade sekvencie génu sucD známej z príkladu 2 pre C. glutamicum sa selektovali ďalej opísané oligonukleotidy na prípravu delečnej alely sucD.
sucD-dl:
5'-CGA TGT GAT TGC GCT TGA TG -3' sucD-d2:
5'-ACC TCA CGC ATA AGC TTC GCA TGC TCT GAA CCT TCC GAA C 3' sucD-d3:
5'-GTT CGG AAG GTT CAG AGC ATG CGA AGC TTA TGC GTG AGG T 3' sucD-d4:
5'-ATG AAG CCA GCG ACT GCA GA -3' ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • · · · · · · · • · · · ···· · · · • · · · · · · ··· ··· ·· · ·· ·
Znázornené priméry syntetizovala firma MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko) a PCR reakcia sa uskutočnila použitím polymerázy Pfu (Stratagene, produkt, č. 600135, La Jolla,
USA) a zariadenia PTC 100-Thermocycler (MJ Research Inc., Waltham, USA). Pomocou tejto polymerázovej reťazovej reakcie umožnili priméry amplifikáciu alely sucD s internou deléciou. Takto amplifikovaný produkt sa skúmal elektroforeticky v 0,8% agarózovom géle a taktiež sa sekvenoval tak, ako sa opisuje v Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977).
Príklad 4
4.1 Integračná mutagenéza génu sucC v kmeni DSM 5715
Vektor pCRBluntsucCint uvedený v príklade 3.1 sa elektroporoval v C. glutamicum DSM 5715 podía elektroporačnej metódy od Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)). Pri kmeni DSM 5715 sa jedná o producenta L-lyzinu rezistentného na AEC. Vektor pCRBluntsucCint sa nemôže samostatne replikovať v DSM5715 a zachováva sa v bunke len vtedy, ak sa integroval do chromozómu DSM 5715. Selekcia klonov pomocou pCRBluntsucCint integrovaného do chromozómu sa uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 15 mg/l kanamycínu.
Na dôkaz integrácie sa fragment sucCint označil metódou „The DIG Systems Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer. Chro25 • · ·· · ·· · ·· ·· · · · · · ·· • · · · · · ··· • · · · · ···· · · · · • · 9 · · · · · ··· ··· ·· · ·· ··· mozómová DNA potenciálneho integrantu sa izolovala metódou od Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) a štiepila reštrikčným enzýmom Sphl a HindlII. Vznikajúce fragmenty sa separovali pomocou elektroforézy v agarózovom géle a hybridizovali pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer pri 68 °C. Plazmid pCRBluntsucCint uvedený v príklade 3.1 sa vnútri chromozómového génu sucC vložil do chromozómu DSM5715. Kmeň sa označil
DSM5715: -.pCRBluntsucCint.
4.2 Konštrukcia zámenného vektora pK18mobsacBsucDdel
Delečný derivát sucD získaný v príklade 3.2 sa po separácii v agarózovom géle (0,8%) pomocou Qiagenquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) izoloval z agarózového gélu a použil na ligáciu s mobilizovatelným klonovacim vektorom pK18mobsacB (Schäfer et al. (1994), Gene 14: 69-73). Tento sa predtým štiepil reštrikčným enzýmom Xmal a Xbal, zmiešal s delečnou alelou sucD a spracoval T4-DNA-1Ígázou (Amersham-Pharmaecia, Freiburg, Nemecko).
Potom sa kmeň E. coli DH5amcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) elektroporoval s ligačnou zmesou (Hanahan, In. DNA Cloning.
A PracticaJ Approacn. zv. I., IRL-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989), ktorý bol doplnený 25 mg/1 kanamycínu.
Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím QTAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen • · ·· · ·· · ·· ·· · · · · · ·· • · n··· ··· • · · · · ···· · · * · • · · · · · · · ··· ··· ·· · ·· ··· a klonovaná delečná alela sucD sa overovala sekvenovaním firmou MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko). Plazmid sa nazval pK18mobsacBsucDdel. Kmeň sa označil ako
E.coliDH5amcr/pK18mobsacBsucDdel.
4.3 Delečná mutagenéza génu sucD v kmeni C. glutamicum DSM 5715
Vektor pK18mobsacBsucDdel uvedený v príklade 4.2 sa elektroporoval podľa elektroporačnej metódy od Tauch et al. (1989 FEMS Microbiological Letters, 123:343-347). Tento vektor sa nemôže samostatne replikovať v DSM 5715 a zachováva sa v bunke len vtedy, ak sa integroval do chromozómu. Selekcia kloncv pomocou integrovaného pK18mobsacBsucDel sa uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989), ktorý bol doplnený 15 mg/1 kanamycínu. Vyrastené klony sa naniesli na agarové platne LE s 25 mg/1 kanamycínu a inkubovali 16 hodín pri 33 °C.
Aby sa dosiahla excízia plazmidu spoločne s úplnou chromozómovou kópiou génu sucD, naniesli sa potom klony na agar LB s 10% sacharózy. Plazmid pK18mobsacB obsahuje jednu kópiu génu sacB, ktorý premieňa sacharózu na levansacharózu toxickú pre C. glutamicum. Na agare LB so sacharózou preto rastú len také klony, pri ktorých sa zas excidoval integrovaný pK18mo'osacBsucDdel. Pri excízii sa môže excidovať spolu s plazmidom buď úplná chromozómová kópia génu sucD, alebo neúplná kópia s internou deléciou.
Aby sa dokázalo, že neúplná kópia sucD zostala v chromozóme, označil sa fragment plazmidu pK18mobsacBsucDdel ft · ftft · ftft • ft ftft · · · · · · • « ftftftft ftft • · · · · ···· ftft · • ftft ··· ftft · ftft ··· metódou „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer. Chromozómová DNA potenciálneho delečného mutantu sa izolovala metódou od Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 1828 (1994)) a štiepila reštrikčným enzýmom Sphl a HindlII v oddelených dávkach. Vznikajúce fragmenty sa separovali pomocou elektroforézy v agarózovom géle a hybridizovali pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer pri 68 °C. Na základe vzniknutých fragmentov sa mohlo ukázať, že kmeň DSM5715 stratil svoju úplnú kópiu génu sucD a namiesto nej má už Len deleovanú kópiu.
Kmeň sa označil ako C. glutamicum DSM5715ásucD.
Príklad 5
5.1 Príprava L-glutamátu pomocou kmeňa DSM
5715::pCRBluntsucCint
Kmeň C. glutamicum DSM 5715::pCRBluntsucCint získaný v príklade 4.1 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu L-glutanátu a obsah glutamátu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.
Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s príslušným antibiotikom (mozgovosrdcový agar s kanamycínom (25 mg/1)). Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predkultúru bolo úplné médium Cg III.
2,5 g/1 g/1 g/1 % (hmotnosť/objem) • · ·· · ·· · ·· ·· A A A A A ΑΑ e · · · · · · · · • · A A · A AAA W A A A • A AA· AA· • AA ··· ·· · ·· ···
Médium Cg III
NaCI
Bacto-peptón
Bacto-yeast extract
Glukóza (oddelene autoklávovaná) Hodnota pH sa nastavila na 7,4.
K tomu sa pridal kanamycín (25 mg/1). Predkultúra sa inkubovaia 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predkultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.
Médium MM:
CSL (Corn Steep Liquor) 5 g/1
MOPS (kyselina morfolinopropán- 20 g/1
sulfónová)
Glukóza (oddelene autoklávovaná) 50 g/1
Soli:
(NH4)2SO4 25 g/1
kh2po4 0,1 g/1
MgSO4.7H2O 1,0 g/1
CaCl2.2H:O 10 mg/1
FeSO4.7H2O 10 mg/1
MnS04.H20 5,0 mg/1
Biotín (sterilné filtrovaný) 0,3 mg/1
Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný) 0,2 mg/1
Fumarát (sterilné filtrovaný) 5,81 g/1
Leucín (sterilné filtrovaný) 0,1 g/1
CaCC>3 25 g/1
·· · ·· • · · · · * • · e · · · • · ···· · · · ·· · ·· ·
CSL, MOPS a roztok solí sa roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCCb.
Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa kanamycín (25 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.
Po 24 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo glutamátu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-Biolronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivát izáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.
Výsledok pokusu je uvedený v tabulke 1.
Tabulka 1
Kmeň Optická hustota (660 nm) L-Glutamát g/i
DSM5715 10,4 20
DSM5715::pCRBlunt sucCint 3,9 154
5.2 Príprava L-glutamátu pomocou kmeňa DSM5715AsucD
Kmeň C. glutamicum DSM 5715/pK18mobsacBsucDdel získaný v príklade 4.3 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na pro30 λ · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • · · · · · ·· • · · · · ···· · · · ··· ··· ·· · ·· · dukciu L-glutamátu a obsah glutamátu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.
Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni. Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Ako médium pre predkultúru sa použilo úplné médium Cg III. K tomuto sa pridal kanamycín (25 mg/ml). Predkultúra sa inkubovala v pretrepávačke 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min. Touto predkultúrou sa naočkovala hlavná kultúra tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.
Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.
Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo glutamátu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou choromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.
Výsledok pokusu je uvedený v tabuľke 2.
Tabulka 2
Kmeň Optická hustota (660 nm) L-Glutamát g/i
DSM5715 8,1 7
DSM5715AsucD 13,3 33
• · ·· · BB
B B BB BBB B • · B · B B · • B B B B BBBB B B ··» ··· ·· · ··
Prehľad obrázkov na výkresoch
Priložené sú nasledovné obrázky:
Obrázok 1: Mapa plazmidu pCRBluntsucCint
Použité skratky a značky majú nasledovný význam:
KmR: gén pre rezistenciu na kanamycín
Zeocin: gén pre rezistenciu na zeocin
HindlII: štiepne miesto pre reštrikčný enzým HindlII
Sphl: štiepne miesto pre reštrikčný enzým Sphl
EcoRI: štiepne miesto pre reštrikčný enzým EcoRI
sucCint: interný fragment génu sucC
ColEl or.i : počiatok replikácie plazmidu ColEl
Obrázok 2: Mapa plazmidu pK18mobsacBsucDdel
Použité skratky a značky majú nasledovný význam:
OriV: počiatok z pMBl podobný ColEl
sacB: gén sacB kódujúci proteín levansacharózu
RP4mob: mogilizačné miesto RP4
Kan: gén pre rezistenciu na kanamycín
• · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • · ···· ·· • · ·· ····· · • a · a · · a aaaaaa aa a a a a sucDdel:
Sphl:
PstI:
Xmal:
Xbal:
deleovana alela génu sucD z C štiepne miesto štiepne miesto štiepne miesto štiepne miesto pre reštrikčný pre reštrikčný pre reštrikčný pre reštrikčný glutamicum enzým Sphl enzým PstI enzým Xmal enzým Xbal ·· · ·· » · · · I
B · · · · <
» ······· «
B · · · I ·· · ·
SEKVENČNÝ PROTOKOL
<110> <120> <130> Degussa-Hílls AG Nové nukleotidové sekvencie
gén sucC a gén 990171 BT sucD
<140>
<141>
<160> 3
<170> Patentln Ver. 2 .1
<210> 1
<211> 2410
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (142)..(1347)
<223> sucC
<220>
<221> CDS
<222> (1372)..(2253)
<223> sucD
<400> 1
gcaccacgga tccaattttg ttgcaatttg caaagtttac agtgttagac ttcacaatac 60 gatcatattg gtgagttgaa acacttactt ttacgggaag actttgttaa agacgcagaa 120'
ggctctaagc atgggccgga a atg Met 1 gaa Glu ttg Leu gca Ala gtg Val 5 gat Asp ctt Leu ttt Phe gaa Glu tac Tyr 10 171
caa gca cgg gac ctc ttt gaa acc cat ggt gtg cca gtg ttg aag gga 219
Gin Ala Arg Asp Leu Phe Glu Thr His Gly Val Pro Val Leu Lys Gly
15 20 25
att gtg gca tca aca cca gag gcg gcg agg aaa gcg get gag gaa atc 267
íle Val Ala Ser Thr Pro Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ala Glu Glu íle
30 35 40
ggc gga ctg acc gtc gtc aag get cag gtc aag gtg ggc gga cgt ggc 315
Gly Gly Leu Thr Val Val Lys Ala Gin Val Lys Val Gly Gly Arg Gly
45 50 55
aag gcg ggt ggc gtc cgt gtg gca ccg acg tcg get cag get ttt gat 363
Lys Ala Gly Gly Val Arg Val Ala Pro Thr Ser Ala Gin Ala Phe Asp
60 65 70
• 4 ·· · ·· ···· 4 4 4 4 4 4 • · 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4444 4 4 • · 4 4 4 · ·
444 444 44 4 444
get Ala 75 gcg gat gcg att ctc ggc atg gat atc aaa gga cac act gtt aat 411
Ala Asp Ala íle Leu 80 Gly Met Asp íle Lys Gly His Thr Val Asn
85 90
cag gtg atg gtg gcg cag ggc get gac att get gag gaa tac tat ttc 459
Gin Val Met Val Ala 95 Gin Gly Ala Asp íle 100 Ala Glu Glu Tyr Tyr Phe 105
tcc att ttg ttg gat ege gcg aat cgt tcg tat ctg get atg tgc tet 507
Ser íle Leu Leu 110 Asp Arg Ala Asn Arg Ser 115 Tyr Leu Ala Met Cys Ser 120
gtt gaa ggt ggc atg gag atc gag atc ctg gcg aag gaa aag cct gaa 555
Val Glu Gly 125 Gly Met Glu íle Glu 130 íle Leu Ala Lys Glu Lys Pro Glu 135
get ttg gca aag gtg gaa gtg gat ccc ctc act ggt att gat gag gac 603
Ala Leu 140 Ala Lys Val Glu Val 145 Asp Pro Leu Thr Gly íle Asp Glu Asp 150
aaa gcg cgg gag att gtc act get get ggc ttt gaa act gag gtg gca 651
Lys 155 Ala Arg Glu íle Val 160 Thr Ala Ala Gly Phe 165 Glu Thr Glu Val Ala 170
gag aaa gtc att ccg gtg ctg atc aag atc tgg cag gtg tat tac gaa 699
Glu Lys Val íle Pro 175 Val Leu íle Lys íle 180 Trp Gin Val Tyr Tyr Glu 185
gag gaa gca aca ctc gtt gag gtg aac ccg ttg gtg ctc acg gat gac 747
Glu Glu Ala Thr 190 Leu Val Glu Val Asn Pro 195 Leu Val Leu Thr Asp Asp 200
ggc gat gtg att gcg ctt gat ggc aag atc acg ctg gat gat aac get 795
Gly Asp Val 205 íle Ala Leu Asp Gly 210 Lys íle Thr Leu Asp Asp Asn Ala 215
gat ttc ege cat gat aac cgt ggt gcg ttg get gaa tet gcc ggt ggc 843
Asp Phe 220 Arg His Asp Asn Arg 225 Gly Ala Leu Ala Glu Ser Ala Gly Gly 230
ttg gac att ttg gaa ctg aag gcc aag aag aat gat ctg aac tac gtg 891
Leu 235 Asp íle Leu Glu Leu 240 Lys Ala Lys Lys Asn 245 Asp Leu Asn Tyr Val 250
aaa ctt gat ggc tet gtg ggc atc att ggc aat ggt gca ggt ttg gtg 939
Lys Leu Asp Gly Ser 255 Val Gly íle íle Gly 260 Asn Gly Ala Gly Leu Val 265
atg tcc acg ttg gat atc gtg get gca get ggt gaa ege cat ggt ggg 987
Met Ser Thr Leu 270 Asp íle Val Ala Ala Ala 275 Gly Glu Arg His Gly Gly 280
cag ege ccc gcg aac ttc cta gac att ggt ggc gga gca tca get gaa 1035
Gin Arg Pro 285 Ala Asn Phe Leu Asp 290 íle Gly Gly Gly Ala Ser Ala Glu 295
tcg atg get get ggt ctc gat gtg atc ctt ggg gat age cag gta ege 1083
Ser Met Ala Ala Gly Leu Asp Val íle Leu Gly Asp Ser Gin Val Arg
300 305 310
1131
agt gtg ttt gtg aat gtg ttt ggt ggc atc acc gcg tgt gat gtg gtg
Ser Val Phe Val Asn Val Phe Gly Gly íle Thr Ala Cys Asp Val Val
315 320 325 330
gca aag gga atc gtt gga get ttg gat gtg ctc ggc gat caa gca acg
Ala Lys Gly íle Val Gly Ala Leu Asp Val Leu Gly Asp Gin Ala Thr
335 340 345
aag cct ctt gtg gtg ege ctt gat ggc aac aac gtg gtg gaa ggc aga
Lys Pro Leu Val Val Arg Leu Asp Gly Asn Asn Val Val Glu Gly Arg
350 355 360
ega atc ctc gcg gaa tat aac cac cct ttg gtc acc gtt gtg gag ggt
Arg íle Leu Ala Glu Tyr Asn His Pro Leu Val Thr Val Val Glu Gly
365 370 375
atg gat gca gcg get gat cac get gcc cat ttg gcc aat ctt gcc cag
Met Asp Ala Ala Ala Asp His Ala Ala His Leu Ala Asn Leu Ala Gin
380 385 390
cac ggc cag ttc gca acc get aat tagttaagga gcacctgttt aatc atg
His' Gly Gin Phe Ala Thr Ala Asn Met
395 400
tet att ttt ctc aat tca gat tcc ege atc atc att cag ggc att acc
Ser íle Phe Leu Asn Ser Asp Ser Arg íle íle íle Gin Gly íle Thr
405 410 415
ggt tcg gaa ggt tca gag cat gcg cgt ega att tta gcc tet ggt gcg
Gly Ser Glu Gly Ser Glu His Ala Arg Arg íle Leu Ala Ser Gly Ala
420 425 430 435
aag ctc gtg ggt ggc acc aac ccc ege aaa get ggg caa acc att ttg
Lys Leu Val Gly Gly Thr Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gin Thr íle Leu
440 445 450
atc aat gac act gag ttg cct gta ttt ggc act gtt aag gaa gca atg
íle Asn Asp Thr Glu Leu Pro Val Phe Gly Thr Val Lys Glu Ala Met
455 460 465
gag gaa acg ggt gcg gat gtc acc gta att ttc gtt cct cca gcc ttt
Glu Glu Thr Gly Ala Asp Val Thr Val íle Phe Val Pro Pro Ala Phe
470 475 480
gcc aaa get gcg atc att gaa get atc gac get cac atc cca ctg tgc
Ala Lys Ala Ala íle íle Glu Ala íle Asp Ala His íle Pro Leu Cys
485 490 495
gtg att att act gag ggc atc cca gtg cgt gac get tet gag gcg tgg
Val íle íle Thr Glu Gly íle Pro Val Arg Asp Ala Ser Glu Ala Trp
1179
1227
1275
1323
1374
1422
1470
1518
1566
1614
1662
1710
505
510
515 get tat gcc aag aag gtg gga cac acc ege atc att ggc cct aac tgc 1758
Ala Tyr Ala Lys Lys Val Gly His Thr Arg íle íle Gly Pro Asn Cys
520 525 530
500 • · • · · · · · • · · ···· · · · • · · · ·
cca ggc Pro Gly att att act ccc ggc Gly gaa tet ctt gcg gga att acg ccg gca Thr Pro Ala 545 1806
íle íle 535 Thr Pro Glu Ser 540 Leu Ala Gly íle
aac att gca ggt tcc ggc ccg atc ggg ttg atc tca aag tcg gga aca 1854
Asn íle Ala Gly Ser Gly Pro íle Gly Leu íle Ser Lys Ser Gly Thr
550 555 560
ctg act tat cag atg atg tac gaa ctt tca gat att ggc att tet acg 1902
Leu Thr Tyr Gin Met Met Tyr Glu Leu Ser Asp íle Gly íle Ser Thr
565 570 575
gcg att ggt att ggc ggt gac cca atc atc ggt aca acc cat atc gac 1950
Ala íle Gly íle Gly Gly Asp Pro íle íle Gly Thr Thr His íle Asp
580 585 590 595
get ctg gag gcc ttt gaa get gat cct gag acc aag gca atc gtc atg 1998
Ala Leu Glu Ala Phe Glu Ala Asp Pro Glu Thr Lys Ala íle Val Met
600 605 610
atc ggt gag atc ggt gga gat gca gag gaa ege get get gac ttc att 2046
íle Gly Glu íle Gly Gly Asp Ala Glu Glu Arg Ala Ala Asp Phe íle
615 620 625
tet aag cac gtg aca aaa cca gtt gtg ggt tac gtg gca ggc ttt acc 2094
Ser Lys His Val Thr Lys Pro Val Val Gly Tyr Val Ala Gly Phe Thr
630 635 640
gcc cct gaa gga aag acc atg ggg cat get ggc gcc atc gtg aca ggt 2142
Ala Pro Glu Gly Lys Thr Met Gly His Ala Gly Ala íle Val Thr Gly
645 650 655
tca gaa ggc act gcg ega gca aag aag cat gca ttg gag gcc gtg ggt 2190
Ser Glu Gly Thr Ala Arg Ala Lys Lys His Ala Leu Glu Ala Val Gly
660 665 670 675
gtt ege gtg gga aca act ccg agt gaa acc gcg aag ctt atg cgt gag 2238
Val Arg Val Gly Thr Thr Pro Ser Glu Thr Ala Lys Leu Met Arg Glu
680 685 690
gta gtt gca get ttg taactaacag gccacagatc ttagctttga ccagcggatt 2293
Val Val Ala Ala Leu
695
tgtggctaat cgcccggtct gtgtagagta ttcatctgtg cgcaggacag tgtgacaaac 2353 actgaatagt gcatggcttt aaggccctgt ggcgcagttg gttagcgcgc cgccctg 2410 <210> 2 <211> 402 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2
Met Glu Leu Ala Val Asp Leu Phe Glu Tyr Gin Ala Arg Asp Leu Phe 15 10 15 • · · · ·· · ·· ·· · · · · · ·· • · · · · · · · · • 9 9 9 9 9999 999 9
9 9 9 9 9 9 9
999 999 99 9 99 999
Glu Thr His Gly 20 Val Pro Val Leu Lys 25 Gly íle Val Ala Ser 30 Thr Pro
Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ala Glu Glu Ile Gly Gly Leu Thr Val Val
35 40 45
Lys Ala Gin Val Lys Val Gly Gly Arg Gly Lys Ala Gly Gly Val Arg
a 50 55 60
Val Ala Pro Thr Ser Ala Gin Ala Phe Asp Ala Ala Asp Ala íle Leu
• 65 70 75 80
Gly Met Asp íle Lys Gly His Thr Val Asn Gin Val Met Val Ala Gin
85 90 95
Gly Ala Asp íle Ala Glu Glu Tyr Tyr Phe Ser íle Leu Leu Asp Arg
100 105 110
Ala Asn Arg Ser Tyr Leu Ala Met Cys Ser Val Glu Gly Gly Met Glu
115 120 125
Ile Glu íle Leu Ala Lys Glu Lys Pro Glu Ala Leu Ala Lys Val Glu
130 135 140
Val Asp Pro Leu Thr Gly Ile Asp Glu Asp Lys Ala Arg Glu íle Val
145 150 155 160
Thr Ala Ala Gly Phe Glu Thr Glu Val Ala Glu Lys Val íle Pro Val
165 170 175
Leu íle Lys íle Trp Gin Val Tyr Tyr Glu Glu Glu Ala Thr Leu Val
180 185 190
Glu Val Asn Pro Leu Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Val íle Ala Leu
195 200 205
Asp Gly Lys íle Thr Leu Asp Asp Asn Ala Asp Phe Arg His Asp Asn
210 215 220
Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ser Ala Gly Gly Leu Asp íle Leu Glu Leu
. 225 230 235 240
Lys Ala Lys Lys Asn Asp Leu Asn Tyr Val Lys Leu Asp Gly Ser Val
245 250 255
Gly Ile íle Gly Asn Gly Ala Gly Leu Val Met Ser Thr Leu Asp Ile
260 265 270
Val Ala Ala 275 Ala Gly Glu Arg His 280 Gly Gly Gin Arg Pro 285 Ala Asn Phe
Leu Asp 290 íle Gly Gly Gly Ala 295 Ser Ala Glu Ser Met 300 Ala Ala Gly Leu
Asp 305 Val íle Leu Gly Asp 310 Ser Gin Val Arg Ser 315 Val Phe Val Asn Val 320
Phe Gly Gly Ile Thr 325 Ala Cys Asp Val Val 330 Ala Lys Gly íle Val 335 Gly
• · ·· · ·· ·· 9 · · • · · · · · • 9 9 · · ···· · • · · · · · 9 99 ·· ·
Ala Leu Asp Val 340 Leu Gly Asp Gin Ala 345 Thr Lys Pro Leu Val 350 Val Arg
Leu Asp Gly 355 Asn Asn Val Val Glu 360 Gly Arg Arg íle Leu 365 Ala Glu Tyr
Asn His 370 Pro Leu Val Thr Val 375 Val Glu Gly Met Asp 380 Ala Ala Ala Asp
His 385 Ala Ala His Leu Ala 390 Asn Leu Ala Gin His 395 Gly Gin Phe Ala Thr 400
Ala Asn <210> 3 <211> 294 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3
Met Ser íle Phe Leu Asn Ser Asp Ser Arg 10 íle íle íle Gin Gly 15 íle
1 5
Thr Gly Ser Glu Gly Ser Glu His Ala Arg Arg íle Leu Ala Ser Gly
20 25 30
Ala Lys Leu Val Gly Gly Thr Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gin Thr íle
35 40 45
Leu íle Asn Asp Thr Glu Leu Pro Val Phe Gly Thr Val Lys Glu Ala
50 55 60
Met Glu Glu Thr Gly Ala Asp Val Thr Val íle Phe Val Pro Pro Ala
65 70 75 80
Phe Ala Lys Ala Ala íle íle Glu Ala íle Asp Ala His íle Pro Leu
85 90 95
Cys Val íle íle Thr Glu Gly íle Pro Val Arg Asp Ala Ser Glu Ala
100 105 110
Trp Ala Tyr Ala Lys Lys Val Gly His Thr Arg íle íle Gly Pro Asn
115 120 125
Cys Pro Gly íle íle Thr Pro Gly Glu Ser Leu Ala Gly íle Thr Pro
130 135 140
Ala Asn íle Ala Gly Ser Gly Pro íle Gly Leu íle Ser Lys Ser Gly
145 150 155 160
Thr Leu Thr Tyr Gin Met Met Tyr Glu Leu Ser Asp íle Gly íle Ser
165 170 175
Thr Ala íle Gly íle Gly Gly Asp Pro íle íle Gly Thr Thr His íle
180 185 190
• · • · · • ····
Asp Ala Leu Glu Ala Phe Glu Ala Asp Pro Glu Thr Lys Ala íle Val
195 200 205
Met íle Gly Glu íle Gly Gly Asp Ala Glu Glu Arg Ala Ala Asp Phe
210 215 220
íle Ser Lys His Val Thr Lys Pro Val Val Gly Tyr Val Ala Gly Phe
225 230 235 240
Thr Ala Pro Glu Gly Lys Thr Met Gly His Ala Gly Ala íle Val Thr
245 250 255
Gly Ser Glu Gly Thr Ala Arg Ala Lys Lys His Ala Leu Glu Ala Val
260 265 270
Gly Val Arg Val Gly Thr Thr Pro Ser Glu Thr Ala Lys Leu Met Arg
275 280 285
Glu Val Val Ala Ala Leu
290

Claims (18)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaný polynukleotid, obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu kódujúcu gén sucC a/alebo sucD, vybranú zo skupiny zahŕňajúcej
    a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID No. 2,
    b) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID No. 3,
    c) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No. 2,
    d) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyseLinovou sekvenciou SEQ ID No. 3,
    e) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom
    a), b), c) alebo d), a • f) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov polynukleotidových sekvencií a), b), c), d) alebo e), pričom polypeptid prednostne vykazuje aktivitu sukcinyl-CoAsyntetázy.
    • · · · • · ···· • · · ·· · • · · • · ··· ··· ·· ·
  2. 2. Polynukleotidy podľa nároku 1, pričom polynukleotidom je prednostne rekombinantné DNA, replikovatelná v koryneformných baktériách.
  3. 3. Polynukleotidy podľa nároku 1, pričom polynukleotidom je RNA.
  4. 4. Polynukleotidy podľa nároku 2, obsahujúce sekvenciu nukleovej kyseliny znázornenú v SEQ ID NO 1.
  5. 5. Replikovatelná DNA podlá nároku 2 obsahujúca:
    (i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID NO 1, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvenciám (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá sa hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).
  6. 6. Replikovatelná DNA podľa nároku 5, vyznaču• júca sa tým, že hybridizácia sa uskutočňuje za stringencie zodpovedajúcej nanajvýš 2 x SSC.
  7. 7. Polynukleotidová sekvencia podľa nároku 1, ktorá kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 2.
    ·· · ·· · • · · · » ·· • · · · · · · • · ···· · · · · • · · · · · ·· · ·· ···
  8. 8. Koryneformné baktérie, v ktorých sa zoslabuje gén sucC a/alebo sucD.
  9. 9. Spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä e
    L-lyzínu a/alebo L-glutamátu, vyznačujúci sa % t ý m , že sa uskutočňujú nasledovné kroky:
    a) fermentácia baktérií produkujúcich žiadanú L-aminokyselinu, v ktorých sa zoslabuje, najmä eliminuje aspoň gén sucC a/alebo sucD alebo nukleotidové sekvencie, ktoré ho kódujú,
    b) koncentrovanie L-aminokyseliny v médiu alebo v bunkách baktérií a
    c) izolácia L-aminokyseliny.
  10. 10. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej L-aminokyseliny.
  11. 11. Spôsob podía nároku 9, vyznačujúci sa , t ý m , že sa používajú baktérie, v ktorých sa aspoň čiastočne eliminujú metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu • žiadanej L-aminokyseliny.
  12. 12. Spôsob podía nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa zoslabuje, najmä eliminuje expresia polynukleotidu(ov), ktorý(é) kóduje(ú) gén sucC, poprípade sucD.
    • · · • ···· • I ··· ··· ·· ·
  13. 13. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa znižujú katalytické vlastnosti polypeptidu (enzýmového proteínu), ktorý kódujú polynukleotidy sucC a sucD.
  14. 14. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa na výrobu L-aminokyselín fermentujú mikroorganizmy, v ktorých sa súčasne súčasne zosilňuje, poprípade nadmerne exprimuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
    14.1 gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu,
    14.2 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu ,
    14.3 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,
    14.4 gén tpi kódujúci triózafosfátizomerázu,
    14.5 gén pgk kódujúci 3-fosfoglycerátkinázu,
    14.6 gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu,
    7 gén lysE kódujúci export L-lyzínu,
    14.8 gén lysC kódujúci aspartátkinázu, „feed back rezistentnú
    14.9 gén zwal kódujúci proteín Zwal.
  15. 15. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-aminokyselín sa fermentujú • ·· · ·· ·· · · · · · · • · · · · · · • · · · ···· · · · • ··· ·· · ·· ··· koryneformné mikroorganizmy, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
    15.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu,
    15.2 gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu,
    15.3 gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu,
    15.4 gén zwa2 kódujúci protein Zwa2.
  16. 16. Koryneformné baktérie, ktoré obsahujú vektor, ktorý nesie časti polynukleotidu podľa nároku 1, najmenej však 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov nárokovanej sekvencie.
  17. 17. Spôsob pcdla jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy druhu Corynebacterium glutamicum.
  18. 18. Spôsob vyhladávania RNA, cDNA a DNA, aby sa izolovali nukleové kyseliny, poprípade polynukleotidy alebo gény, ktoré kódujú sukcinyl-CoA-syntázu alebo vykazujú vysokú podobnosť so sekvenciou génu sucC a/alebo sucD, vyznačujúci sa tým, že sa použije polynukleotid obsahujúci polynukleotidové sekvencie podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4 ako hybridizačné sondy.
    Obrázok 1: Plazmid pCRBluntsucCint • · ·· · ·· ·
SK1735-2000A 1999-11-25 2000-11-16 Nukleotidov sekvencie kdujce gn succ a sucd SK17352000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19956686A DE19956686A1 (de) 1999-11-25 1999-11-25 Neue für die Gene sucC und sucD codierende Nukleotidsequenzen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK17352000A3 true SK17352000A3 (sk) 2001-09-11

Family

ID=7930268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1735-2000A SK17352000A3 (sk) 1999-11-25 2000-11-16 Nukleotidov sekvencie kdujce gn succ a sucd

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6623946B1 (sk)
EP (1) EP1103611A1 (sk)
JP (1) JP2001190290A (sk)
KR (1) KR20010051915A (sk)
CN (1) CN1298019A (sk)
AU (1) AU7183700A (sk)
BR (1) BR0005608A (sk)
CA (1) CA2324496A1 (sk)
DE (1) DE19956686A1 (sk)
HU (1) HUP0004715A2 (sk)
ID (1) ID28476A (sk)
MX (1) MXPA00011289A (sk)
PL (1) PL344145A1 (sk)
SK (1) SK17352000A3 (sk)
ZA (1) ZA200006884B (sk)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4304837B2 (ja) * 2000-07-05 2009-07-29 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
WO2003008613A2 (en) * 2001-07-18 2003-01-30 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced soda gene
JP4152320B2 (ja) * 2001-09-28 2008-09-17 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
JP2006230202A (ja) * 2003-06-23 2006-09-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸の製造法
MXPA06006759A (es) 2003-12-18 2006-09-04 Basf Ag Metodos para la preparacion de lisina por fermentacion de corynebacterium glutamicum.
KR100822041B1 (ko) 2006-12-21 2008-04-15 씨제이제일제당 (주) 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 에이 코딩 유전자의 발현이강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한엘-라이신 생산방법
AU2008229076B2 (en) 2007-03-16 2014-05-15 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
US7947483B2 (en) 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
EP3514242A3 (en) 2008-09-10 2019-08-28 Genomatica, Inc. Microrganisms for the production of 1,4-butanediol
CN102459138A (zh) 2009-06-04 2012-05-16 基因组股份公司 分离发酵液成分的方法
VN29801A1 (sk) 2009-06-04 2012-05-25
CN102762735B (zh) 2009-10-13 2016-08-03 基因组股份公司 生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法
WO2011066076A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
US8048661B2 (en) 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
US8637286B2 (en) 2010-02-23 2014-01-28 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
KR101294935B1 (ko) 2011-04-01 2013-08-08 씨제이제일제당 (주) 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
RU2496867C2 (ru) 2011-04-25 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии
US9644220B2 (en) 2011-12-22 2017-05-09 Basf Se Processes and recombinant microorganisms for the production of fine chemicals
CN104685058B (zh) 2012-06-04 2020-07-07 基因组股份公司 制造4-羟基丁酸酯、1，4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法
CA2900580C (en) * 2013-02-08 2022-05-31 Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd Method for producing l-lysine by modifying aconitase gene and/or regulatory elements thereof
WO2016008332A1 (zh) * 2014-07-16 2016-01-21 中国科学院上海生命科学研究院 一种提高大肠杆菌异源合成聚酮类化合物的方法和用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4517512A (en) 1982-05-24 1985-05-14 Micro Component Technology, Inc. Integrated circuit test apparatus test head
JPH0655149B2 (ja) * 1985-03-12 1994-07-27 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―リジンの製造法
EP1263963A2 (en) * 1999-06-25 2002-12-11 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0004715A2 (en) 2002-10-28
JP2001190290A (ja) 2001-07-17
AU7183700A (en) 2001-05-31
CA2324496A1 (en) 2001-05-25
ZA200006884B (en) 2001-05-25
HU0004715D0 (sk) 2001-02-28
EP1103611A1 (de) 2001-05-30
US6623946B1 (en) 2003-09-23
PL344145A1 (en) 2001-06-04
MXPA00011289A (es) 2002-05-23
CN1298019A (zh) 2001-06-06
BR0005608A (pt) 2001-07-17
KR20010051915A (ko) 2001-06-25
ID28476A (id) 2001-05-31
DE19956686A1 (de) 2001-05-31
MX223007B (sk) 2004-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6623946B1 (en) Nucleotide sequences encoding the sucC and sucD genes
SK18352000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2
SK18342000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa1 a spôsoby fermentačnej výroby l-aminokyselín
US6897055B2 (en) Nucleotide sequences coding for the genes sucC and sucD
US6921651B2 (en) Process for the preparation of amino acids by using coryneform bacteria with attenuated 1-phosphofructokinase activity
SK18572000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gény sdha, sdhb a sdhc
SK3382001A3 (en) Nucleotide sequences coding for the dapc gene and process for the preparation of l-lysine
US7129066B2 (en) Nucleotide sequences coding for the citE gene
US20020086372A1 (en) Nucleotide sequences which code for the citB gene
US20020081674A1 (en) Nucleotide sequences for encoding of the lysR2-Gene
US20020102669A1 (en) Nucleotide sequences which code for the clpC gene
US20020106758A1 (en) Nucleotide sequences which code for the gorA gene
US20020098554A1 (en) Nucleotide sequences coding for the pepC gene
US20020142404A1 (en) Nucleotide sequences which code for the atr43 gene
US6689586B2 (en) Nucleotide sequences which code for the CcpA2 gene
US20020081672A1 (en) Nucleotide sequences which code for the citA gene
US7202061B2 (en) Process for the preparation of L-amino acids by attenuating the mikE17 gene
US20020151001A1 (en) Nucleotide sequences coding for the ccpA1 gene
US20020155554A1 (en) Nucleotide sequences which code for the chrA gene
US20020031810A1 (en) Nucleotide sequences coding for the lipA gene
US20020102663A1 (en) Nucleotide sequences which code for the menE gene
US20020106757A1 (en) Nucleotide sequences which code for the dep34 gene
WO2002024716A2 (en) Nucleotide sequences which code for the tmk gene
US20020106750A1 (en) Nucleotide sequences which code for the def gene
US20020055115A1 (en) Nucleotide sequences coding for the Dep33 efflux protein