CN1298019A

CN1298019A - 编码基因sucC和sucD的新核苷酸序列

Info

Publication number: CN1298019A
Application number: CN00132540A
Authority: CN
Inventors: 贝蒂娜·默克尔; 瓦尔特·普费弗勒; 阿希姆·马克思
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2001-06-06
Also published as: EP1103611A1; US6623946B1; MX223007B; MXPA00011289A; KR20010051915A; HU0004715D0; DE19956686A1; HUP0004715A2; PL344145A1; BR0005608A; SK17352000A3; ZA200006884B; JP2001190290A; AU7183700A; CA2324496A1; ID28476A

Abstract

本发明涉及含有编码sucC基因和sucD基因的多核苷酸序列的多核苷酸,其选自:a)与编码含SEQ IDNo.2所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少70%相同性的多核苷酸,b)与编码含SEQ ID No.3所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少70%相同性的多核苷酸,c)编码所含序列与SEQID No.2氨基酸序列具有至少70%相同性的多肽的多核苷酸,d)编码所含序列与SEQ ID No.3氨基酸序列具有至少70%相同性的多肽的多核苷酸,e)与a)、b)、c)或d)互补的多核苷酸,及,f)含多核苷酸序列a)、b)、c)、d)或e)的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及用所述基因以弱化形式存在的棒状细菌发酵生产L－氨基酸的方法,以及所述多核苷酸用作杂交探针的用途。

Description

编码基因sucC和sucD的新核苷酸序列

本发明提供了棒状细菌编码基因sucC和sucD的核苷酸序列和应用sucC基因和/或sucD基因弱化的细菌发酵生产氨基酸尤其是L-赖氨酸和L-谷氨酸的方法。

L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸和L-谷氨酸，可以用于人类药品和制药产业、食品产业、尤其可用于动物营养。

众所周知氨基酸是通过棒状细菌菌株特别是谷氨酸棒杆菌的发酵而产生。由于氨基酸的重要性人们一直在努力改善其生产方法。产量的提高包括发酵技术，例如搅拌和供氧，或营养培养基的组份，例如发酵过程中糖的浓度，或通过如离子交换层析对产物的加工，或微生物自身固有的生产性质。

利用包括诱变，筛选和突变体精选的方法改进生产特性。这样获得的菌株具有对抗代谢物的抗性或者成为重要的调控代谢物营养缺陷型，并且产生氨基酸。

近年来重组DNA技术方法也用于改善生产L-氨基酸的棒状细菌菌株。

本发明人的目的在于提供改善氨基酸，尤其是L-赖氨酸和L-谷氨酸发酵生产的新方法。

对于下文中提到的L-氨基酸或氨基酸，应理解的是，这些术语指一个或多个包括它们的盐形式的氨基酸，这些氨基酸选自如下一组，L-天冬氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。尤其优选的是指L-赖氨酸和L-谷氨酸。

本发明提供了分离的多核苷酸，它含有选自下列一组的多核苷酸序列：

a)与编码含SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％的相同性的多核苷酸，

b)与编码含SEQID No.3氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％的相同性的多核苷酸，

c)编码含有与SEQ ID No.2氨基酸序列有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

d)编码含有与SEQ ID No.3氨基酸序列有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

e)与a)、b)、c)或d)互补的多核苷酸，及，

f)含多核苷酸序列a)、b)、c)、d)或e)的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，该多肽优选的显示出琥珀酰辅酶A合成酶的活性。

本发明还提供了如权利要求1所述的多核苷酸，它优选的是可复制的DNA，包含：

(ⅰ)如SEQIDNo.1所述的核苷酸序列，或

(ⅱ)至少一个在遗传密码子简并性范围内基于序列(ⅰ)的序列，或

(ⅲ)至少一个可与序列(ⅰ)或(ⅱ)的互补序列相杂交的序列，以及任选地

(ⅳ)(ⅰ)的功能性中性有义突变株。

本发明进一步还提供了：

如权利要求4所述的含有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列的多核苷酸，

如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸优选的是重组的、可在棒状细菌中复制的DNA，

含有本发明的多核苷酸的部分，至少是所述序列的15个连续核苷酸的载体，和

sucC基因和/或sucD基因通过尤其是插入或缺失而弱化的棒状细菌。

本发明还提供了一些多核苷酸，它们基本上包含有一段多核苷酸序列，它可利用杂交的方法通过用含有如SEQ ID No.1的上述多核苷酸序列或其片段的探针筛选相应的基因文库获得，该文库含有完整的具有如SEQ ID No.1所述的多核苷酸序列的sucC基因和/或sucD基因，本发明还涉及上述DNA序列的分离。

含本发明的序列的多核苷酸适于作为RNA,cDNA,和DNA杂交探针，以便分离全长的编码琥珀酰辅酶A合成酶的cDNA，核酸和/或多核苷酸或基因，和分离序列与琥珀酰辅酶A合成酶基因有高度相似性的cDNA或基因。

含本发明的序列的多核苷酸还适于作为引物，以通过聚合酶链反应(PCR)从编码琥珀酰辅酶A合成酶的基因产生DNA。

作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30，优选的至少20，尤其特别优选的是15个连续核苷酸。长度至少是40或50个核苷酸的寡核苷酸也适用。

“分离的”是指从天然环境中分离的。

“多核苷酸”总的来说是指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其中这些术语可以是指未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。

至于术语“多肽”应理解为含有通过肽键连接的两个或两个以上氨基酸的肽或蛋白。

本发明的多肽包括如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所述的多肽，尤其是那些具有琥珀酰辅酶A合成酶活性的多肽，以及那些与如SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3所述的多肽具有至少70％相同性，且优选与如SEQID No.2或SEQ ID No.3所述的多肽具有至少80％，尤其优选至少90％到95％的相同性，并带有上述的活性的多肽。

本发明进一步还涉及利用已经可以生产氨基酸尤其是L-赖氨酸和L-谷氨酸的棒状细菌来发酵生产氨基酸的方法，其中所说的氨基酸选自如下一组，L-天冬氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸，尤其是L-赖氨酸和L-谷氨酸，而且所述细菌中编码sucC基因和/或sucD基因的核苷序列被弱化，尤其以低水平表达。

本文所用术语“弱化”描述的是降低或关闭微生物中由相关DNA编码的一种或多种酶(蛋白)的胞内活性，例如利用弱启动子或编码相应的具有低活性的酶的基因和/或等位基因和/或失活相关基因或酶(蛋白)，且任选地上述这些特征的组合。

本发明的微生物能从葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸，尤其是L-赖氨酸。微生物的类型可是棒状细菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中应当特别注意的是谷氨酸棒杆菌，它因产生L-氨基酸的能力而为本领域熟练技术人员熟知。

棒杆菌属合适的菌株，特别是谷氨酸棒杆菌类型，尤其是如下所知的野生型菌株

谷氨酸棒杆菌ATCC13032

醋谷棒杆菌ATCC15806

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

Corynebacterium melassecola ATCC17965

嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539

黄色短杆菌ATCC14067

乳发酵短杆菌ATCC13869和

扩展短杆菌ATCC14020

及从中获得的产生L-氨基酸的突变体和/或菌株，例如L-赖氨酸生产菌株

谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709

黄色短杆菌FERM-P 1708

乳发酵短杆菌FERM-P1712

谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463

谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464和

谷氨酸棒杆菌DSM 5714。

编码琥珀酰辅酶A合成酶(EC 6.2.1.5)的新基因sucC和sucD已从谷氨酸棒杆菌中得到分离。

为了从谷氨酸棒杆菌中分离sucC基因和/或sucD基因或其它基因，首先在大肠杆菌中构建了该微生物的一个基因文库。基因文库的构建在周知的教科书和手册中都有叙述。可提及的例子包括Winnacker所著的教科书：基因和克隆，基因技术入门(Verlag Chemie,Weinheim，德国，1990)或Sambrook等著的手册：分子克隆，实验室指南(冷泉港实验室出版社，1989)。一个非常有名的基因文库是大肠杆菌K-12菌株W3110，由Kohara等在λ载体上构建的(细胞50,495-508(1987))。Bathe等(分子和普通遗传学，252：255-265,1996)描述了一个来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032用粘粒载体SuperCosⅠ(Wahl等，1987，美国国家科学院进展，84：2160-2164)构建于大肠杆菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)的基因文库。

Bormann等(分子微生物学6(3),317-326(1992))描述了利用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))从谷氨酸棒杆菌ATCC13032获得的基因文库。O′Donohue(来自谷氨酸棒杆菌的四种普通芳香族氨基酸生物合成基因的克隆和分子分析。Ph.D论文，爱尔兰国家大学，Galway,1997)描述了利用Short等(核酸研究，16：7583)所述的λZap表达系统进行谷氨酸棒杆菌基因的克隆。

为了在大肠杆菌中产生来自谷氨酸棒杆菌的基因文库，可使用如pBR322(Bolivar，生命科学，25,807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因，19：259-268)质粒。尤其适于做宿主的是那些限制性缺陷和重组缺陷的大肠杆菌菌株，诸如菌株DH5α(Jeffrey H.Miller：“细菌遗传学快速教程，大肠杆菌和相关细菌的实验室指南和手册”，冷泉港实验室出版社，1992)。

在粘粒或其它λ载体的协助下克隆的长DNA片段可随后被亚克隆到易于获得的适于DNA测序的载体上。

DNA测序方法如特别是Sanger等所描述的(美国国家科学院进展，74：5463-5467,1977)。

获得的DNA序列然后可通过已知的运算和/或序列分析程序进行研究，例如Staden的研究方法(核酸研究14,217-232(1986)),Butler的GCG-方案(生化分析方法39,74-97(1998)),Pearson和Lipman的FASTA运算(美国国家科学院进展85,2444-2448(1988))或Alschul等的BLAST运算(自然遗传学6,119-129(1994))并与公共收录数据库中列出的序列条目进行比较。核苷酸序列的公共收录数据库正如欧洲分子生物实验室(EMBL，海德堡，德国)或生物技术信息国家中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)的数据库。

编码sucC和sucD基因的谷氨酸棒杆菌新DNA序列已被发现，如SEQ ID No.1是本发明的一部分。而且相关蛋白的氨基酸序列已通过上述方法得自现存的DNA序列。产生的susC基因和sucD基因产物的氨基酸序列示于SEQID No.2和SEQ ID No.3。

根据遗传密码子的简并性而由SEQ ID No.1衍生的编码DNA序列也是本发明的主题之一。同样的可与SEQ ID No.1或部分SEQ ID No.1杂交的DNA序列也是本发明的主题之一。最后，通过从SEQ ID No.1获得的引物进行聚合酶链反应产生的DNA序列也是本发明的主题之一。

本领域的熟练技术人员可以通过尤其是在宝灵曼GmbH(曼海姆，德国)出版的手册“DIG系统用户滤膜杂交指南”和Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41：255-260)的杂交方法发现鉴定DNA序列的信息。杂交在严格的条件下进行，就是说杂交仅在探针和靶序列，即用探针处理的多核苷酸，有至少70％相同的情况下发生。众所周知包括洗膜步骤的完全杂交受缓冲液组分、温度和盐浓度变化的影响或甚至是由其决定。优选地在相对洗膜步骤完全性相对低的程度进行杂交反应(Hybaid杂交指南，Hybaid有限公司，Teddington,UK,1996)。

例如5xSSC缓冲液可在温度为50-60℃时用于杂交反应。在此过程中探针也可和与探针序列相同性少于70％的多核苷酸杂交。这样的杂交不太稳定且在严格的条件下会被洗去。这可如通过降低盐浓度到2xSSC及任选地连续降至0.5xSSC(DIG系统用户滤膜杂交指南，宝灵曼，曼海姆，德国，1995)，温度继续保持50-68℃而实现。也可任选地降低盐浓度低至0.1xSSC。通过从50-68℃起1-2℃逐步提高温度，可分离显示出如与所用探针有至少70％或至少80％或至少90％-95％相同性的多核苷酸片段。杂交的详尽说明可连同所述的试剂盒商购得到(例如DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国，目录号160558)。

本领域的熟练技术人员可通过聚合酶链反应尤其是按Gait手册：寡核苷酸合成实用途径(IRL出版社，牛津，英国，1984)和Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，海德堡，德国，1994)中所述的方法发现增强DNA序列的细节。

现已发现棒状细菌在sucC基因和/或sucD基因弱化后可增强L-氨基酸，尤其L-赖氨酸的生产。

为了获得这种弱化，可以将sucC基因和/或sucD基因的表达降低或关闭，也可以将酶蛋白催化活性降低或关闭。或者将两种方法的结合起来。

基因表达的降低可通过合适的培养条件或基因表达的信号结构遗传改变(突变)获得。基因表达的信号结构是指如阻遏基因，激活基因，操纵子，启动子，灭活子，核糖体结合位点，起始密码子和终止子结构。本领域熟练技术人员可从上文获得信息如在发明应用WO96/15246,Boyd和Murphy(细菌学杂志170：5949(1988)),Voskuil和Chambliss(核酸研究26：3548(1998)),Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58：191(1998)),Patek等(微生物学142：1297(1996))和熟知的遗传学和分子生物学教科书中，例如Knippers的教科书(“分子遗传学”，第6版，Georg Thieme Verlag,Stuttgart，德国，1995)或Winnacker的教科书(“基因和克隆”，VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim，德国，1990)。

导致改变和/或降低酶蛋白催化活性的突变在本领域背景中已有介绍；可提及的例子包括Qiu和Goodman(生物化学杂志272：8611-8617(1997)),Sugimoto等(生物科学生物技术和生物化学61：1760-1762(1997))和Mockel(“谷氨酸棒杆菌中苏氨酸脱氢酶：取消变构调控和酶的结构”)，Juelichs研究中心的报告，Jul-2906,ISSN09442952,Jlich，德国，1994)。可从遗传和分子生物学教科书汇总获得概论和摘要，例如Hagemann(普通遗传学，Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)所著。

突变包括诸如转换、颠换、插入和缺失等现象。根据氨基酸替换对酶活性的影响，可分为错义突变和无义突变。基因中至少一个碱基对的插入或缺失，导致框架移动突变，导致加入错误的氨基酸或翻译过早结束。密码子缺失通常导致酶活性的完全抑制。产生这种突变的详细内容是本领域背景知识的一部分并且可从遗传学和分子生物学的教科书中获得，例如Kmippers著的教科书(“分子遗传学”，第6版，Georg Thieme Verlag,Strttgart，德国，1995)，Winnacker所著(“基因和克隆”，VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim，德国，1990)或Hagemann所著(“Allgemeine Genetik”,Gustav fischer Verlag,Stuttgart,1986)。

一种常规的突变谷氨酸棒杆菌基因的方法是Schwarzer和Puhler(生物/技术9,84-87(1991))描述的基因破坏和基因置换的方法。

基因破坏法的核心部分是将目的基因编码区克隆到在宿主细胞(典型的是大肠杆菌)中可复制但在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体上。可使用的载体包括如pSUP301(Simon等，生物/技术1,784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schfer等，基因145,69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jger等，细菌学杂志174：5462-65(1992)),pGEM-T(Promega公司，Madison,WI,USA),pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)生物化学杂志269：32678-84；美国专利5,487,993)，pCRBlunt(Firma Invitrogen,Groningen,Niederlande；Bemard等，分子生物学杂志，234：534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173：4510-4516)。含基因编码区核心部分的质粒载体接着通过接合或转化到谷氨酸棒杆菌目的菌株中得到转变。

接合的方法如Schfer等所描述的(应用和环境微生物学60,756-759(1994))。转化的方法如Thierbach等(应用微生物学和生物技术29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技术7,1067-1070(1989))和Tauch(FEMS微生物学通信123,343-347(1994))所描述的等。通过交换事件而同源重组后，受影响的基因编码区被载体序列破坏且获得两个不完整等位基因，每个都缺少3′和5′末端。这种方法在如Fitzpatrick等(应用微生物学和生物技术42,575-580(1994))关闭谷氨酸棒杆菌的recA基因时曾使用过。sucC基因和/或sucD基因也是通过这种方法关闭的。

在基因置换方法中，在感兴趣的基因中体外产生一突变，例如缺失、插入或碱基交换。将产生的等位基因随后克隆入不能在谷氨酸棒杆菌中复制的载体中，随后该载体经转化或结合转化而进入所需的谷氨酸棒杆菌宿主。通过实现整合的第一次交换事件和实现切割的合适的第二次交换事件而同源重组后，实现突变和/或等位基因在靶基因和/或靶序列中的掺入。这一方法例如在Peters-Wendisch(微生物学144,915-927(1998))经缺失关闭谷氨酸棒杆菌的pyc基因时使用过。以此方式可将缺失、插入或碱基交换掺入sucC和/或sucD基因中。

通过这种方法可将缺失、插入或碱基交换掺入到sucC基因和/或sucD基因中。

而且，为了有利于生产L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸，除了弱化sucC基因和/或sucD基因，也可以增强，尤其是过表达，一种或多种相关的生物合成途径、糖酵解、回补途径、三羧酸循环或氨基酸输出的酶。

因此，在L-赖氨酸和/或L-谷氨酸的生产上，除了弱化sucC基因和/或sucD基因，还可以将选自下列一组中的一个或多个基因增强，尤其是过表达：

·编码二氢-2,6-吡啶二羧酸盐合酶的dapA基因(EP-B 0 197

335)，

·编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学

杂志174：6076-6086)，

·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174：

6076-6086)，

·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志

174：6076-6086)，

·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)细菌学杂志174：

6076-6086)，

·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，生物化学

欧洲杂志254,395-403(1998))，

·编码反馈抑制天冬氨酸激酶的lysC基因(Accession No.P26512)，

·编码L-赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A195 48 222)，

·编码Zwal-蛋白的zwal基因(DE：19959328.0,DSM 13115)。

而且，除了弱化sucC基因和/或sucD基因外，同时将选自下列一组中的一个或多个基因的表达弱化也可利于提高L-赖氨酸和/或L-谷氨酸的生产：

·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1,DSM

13047)，

·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396,478,DSM

12969)，

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE：1995 1975.7,DSM 13114)，

·编码zwa2-蛋白的zwa2基因(DE：19959327.2,DSM 13113)。

另外除了弱化sucC基因和/或sucD基因外，关闭非所需的次要反应也有利于提高L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸和/或L-谷氨酸的生产(Nakayama：“培养生产氨基酸的微生物”，出处：微生物产物的过表达，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(eds.)，学院出版社，伦敦，UK,1982)。

含如权利要求1所述的多核苷酸的微生物也是本发明的主题之一，并可连续培养或以分批法分批发酵(分批培养)或用补料分批或重复补料分批法来生产L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸。在Chmiel的教科书(生物方法技术，生物工程入门(Gustav Fisher verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(生物反应器和外周设施(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中有已知培养方法的概述。

所用的培养基必须满足相关菌株的需要。不同微生物培养基的说明在美国细菌学协会(华盛顿D.CUSA,1981)的“普通细菌学方法指南”的册子中可见。

可能用到的碳源是糖和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪如大豆油、向日葵油、落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸，醇如甘油和乙醇，有机酸如乙酸。这些物质可单独使用或混合使用。

可作为氮源使用有机氮包括复合物如蛋白胨、酵母抽提物、肉类抽提物、麦芽抽提物、玉米浸泡液、大豆面粉和尿素，或无机复合物如硫酸铵，氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独使用或混合使用。

可作为磷源使用的有磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相关含钠的盐。而且培养基必须含有盐或金属如生长必须的硫酸镁或硫酸铁。最后，除上述物质外，基本的生长物质如氨基酸和维生素也要使用。除外，需向培养基中加合适的前体物质。上文提到的原种物质可以一次性添加到培养基中，或在实际培养中以适当的方法加入。

可用适当的碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸调节培养基的pH。用消泡剂如脂肪酸、多聚甘油酯防止泡沫产生。向培养基中加入适当的有效的选择性物质如抗生素以保持质粒的稳定。要在培养当中引入氧或含氧气体混合物如空气以维持通气条件。培养温度通常维持在20℃到45℃，优选的25℃到40℃。培养继续直到目的产物已达最大产量。此目的通常在10小时到160小时内达到。

从本领域背景中可知测定L-氨基酸的方法。可通过Spakdman等描述的方法进行分析(分析化学，30,(1958),1190)、阴离子交换柱后用茚三酮衍生法或用Lindroth等描述的反向柱HPLC法进行分析(分析化学(1979)51：1167-1174)。

本发明在下文中通过具体方案进行详细描述。

实施例1

来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文库的制备

通过Tauch等描述的方法(1995，质粒33：168-179)分离谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ部分切割(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品详情Sau3AⅠ，编号27-0913-02)。用虾碱性磷酸酶将DNA片段去磷酸化(Roche MolecularBiochemicals，曼海姆，德国，产品详情SAP，编号1758250)。用限制性内切酶XbaⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品详情XbaⅠ，编号27-0948-04)切割来自Stratagene(La Jolla,USA,产品详情SuperCosl粘粒载体试剂盒，编号251301)的粘粒载体SuperCosl的DNA(Wahl等(1987)美国国家科学院进展，USA 84：2160-2164)并同法用虾碱性磷酸酶去磷酸化。然后用限制性内切酶BamHl(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品详情BamHⅠ，编号27-0868-04)切割粘粒-DNA。将如此处理的粘粒-DNA和处理的ATCC13032-DNA混合再用T4-DNA-连接酶处理(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品详情，编号27-1870-04)。用GigapackⅡXL包装抽提物在噬菌体中包装此连接混合物(Stratagene,La Jolla，美国，产品详情GigapackⅡX1包装抽提物，货号200217)。将大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)细胞收集于10mM MgSO₄中并与一份噬菌体悬液混合以达到转染。按Sambrook等描述的方法(1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港)进行粘粒文库的转染和滴定，细胞涂于含100μg/ml氨苄的LB-琼脂(Lennox,1955，病毒学，1：190)上。37℃培养过夜后筛选重组克隆。

实施例2

基因sucC和sucD的分离和测序

根据厂商说明用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(货号为27106,Qiagen,Hilden，德国)分离单克隆的粘粒DNA并用限制性内切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品详情Sau3AⅠ，货号为27-0913-02)部分切割。用虾碱性磷酸酶将DNA片段去磷酸化(RocheMolecular Biochemicals，曼海姆，德国，产品详情SAP，货号为1758250)。凝胶分离后用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(货号为20021,Qiagen,Hilden，德国)分离出大小在区段1500到2000bp的粘粒片段。用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品详情BamHⅠ，货号为27-0868-04)切割来自Invitrogen(Groningen,Niederlande，产品详情Zero背景克隆试剂盒，货号为K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA。按Sambrook等所述的方法(1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港)进行粘粒片段与测序载体pZero-1的连接，T4连接酶(PharmaciaBiotech,Freiburg，德国)与DNA混合物孵育过夜。连接混合物电转于大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美国国家科学院进展，87：4645-4649)(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123：343-7)中并涂于含50ug/ml zeocin的LB-琼脂(Lennox,1955，病毒学，1：190)上。用Biorobot 9600(货号为900200,Qiagen,Hilden，德国)进行重组克隆的质粒制备。根据Zimmermann等(1990，核酸研究，18：1067)改良的Sanger等的双脱氧链终止法(1977，美国国家科学院进展，74：5463-5467)进行测序。应用PE应用生物系统(货号为403044,Weiterstadt，德国)的RR dRhodamin终止循环测序试剂盒。用rotiphoresis NF丙烯酰氨/双丙烯酰氨胶(29∶1)(货号为A124.1,Roth,Karlsruhe，德国)和PE应用生物系统“ABI Prism 377”测序设备(Weiterstadt，德国)进行凝胶电泳分离和分析。

利用97-0版的Staden程序包(1986，核酸研究，14：217-231)处理得到粗序列数据。将pZerol衍生物的单个序列集合成比邻的叠连群。编码区的计算机辅助分析通过XNIP程序进行(Staden,1986，核酸研究，14：217-231)。对照国家生物技术信息中心的无盈余数据库，使用BLAST研究程序(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)进行进一步分析。

获得的核苷序列如SEQ ID No.1中所示。核苷序列分析显示有一个1206碱基对的开放阅读框，鉴定为sucC基因，和一个882碱基对的开放阅读框，鉴定是sucD基因。sucC基因编码402个氨基酸的多肽，如SEQ ID No.2所示。sucD基因编码294个氨基酸的多肽，如SEQ ID No.3所示。

实施例3

3.1 用于sucC基因整合诱变的整合载体的制备

染色体DNA是按照Eikmanns等人的方法，从ATCC13032菌株中分离制备的(微生物学，1994,140：1817-1828)。根据实施例1中谷氨酸棒杆菌的sucC基因序列，用下述的寡核苷酸进行PCR(多聚酶链反应)：

sucC-in1：

5′CGC GCG AAT CGT TCG TAT 3′

sucC-in2：

5′CGC CAC CAA TGT CTA GGA 3′

上述引物可用MWG Biotech PCR仪进行合成(德国的埃伯堡)，而PCR反应所使用的酶为Pwo聚合酶，购自宝灵曼公司(德国，产品详情Pwo聚合酶，产品编号：No.1644947)，PCR操作按照Innis等人的方法进行(PCR操作指南，PCR方法和应用指南，1990，科学院出版社)。通过PCR反应，可以扩增长度为0.55kb的sucC基因内部片段。PCR产物可通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。

应用购自Invitrogen公司(美国加州Carlsbad；货号为K2700-20)的Zero Blunt^TM试剂盒，将扩增后的DNA片段连接到pCRBluntⅡ载体中(Bemard，等，分子生物学杂志，1993,234：534-541)。

对大肠杆菌的TOP10菌株电穿孔，再进行连接反应(Hanahan，见：DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，华盛顿，美国，1985)。在LB培养板上筛选携带质粒的转化细胞(Sambrook，等，分子克隆--实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)，培养基中添加浓度为25mg/l的卡那霉素。使用Qiagen公司生产的QIAprep旋转微量制备试剂盒，从转化子中制备质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRⅠ酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳(胶浓度为0.8％)鉴定。该质粒命名为pCRBluntsucCint，如图1所示。

sucD基因的缺失

首先采用Tauch等人的方法(质粒，1995,33：168-179)，从ATCC13032菌株中分离染色体DNA。根据实施例2所述的谷氨酸棒杆菌的sucD基因序列，下文所列出的寡核苷酸用于筛选sucD缺失等位基因。

sucD-d1：

5′-CGA TGT GAT TGC GCT TGA TG-3′

sucD-d2：

5′-ACC TCA CGC ATA AGC TTC GCA TGC TCT GAA CCT TCCGAA C-3′

sucD-d3：

5′-GTT CGG AAG GTT CAG AGC ATG CGA AGC TTA TGC GTGAGG T-3′

sucD-d4：

5′-ATG AAG CCA GCG ACT GCA GA-3′

相关的引物由MWG Biotech进行合成(德国的Ebersberg),PCR反应所使用的酶为Pfu聚合酶(Stratagene，产品编号：600135,La Jolla，美国)，仪器为PTC100-热循环仪(MJ研究公司，Waltham，美国)。借助PCR反应，引物可以扩增内部缺失的sucD等位基因。PCR产物可以通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，还可应用Sanger等人的方法进行测序(美国科学院研究进展，1977,74：5463-5467)。

实施例4

4.1 DSM5715菌株sucD基因的整合诱变

按照Tauch等人的电穿孔法(FEMS微生物学通信，1994,123：343-347)，实施例3中的质粒pCRBluntsucCint，电转至谷氨酸棒杆菌的DSM5715菌株中。DSM5715菌株为AEC抗性L-赖氨酸生产菌。由于载体pCRblunt-sucCint不能在DSM5715中自行复制，所以如果该质粒整合到DSM5715的基因组中，它只停留在纤维素中。将电转后的样本涂布在LB琼脂板上，进行筛选pCRBluntsucCint整合到染色体的克隆(Sambrook，等，分子克隆--实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)，培养基中添加浓度为15mg/l的卡那霉素。

为了检测质粒的整合，使用宝灵曼GmbH“地高辛体系滤膜杂交法使用指南”中所述的方法(德国曼海姆)，应用宝灵曼公司生产的地高辛杂交试剂盒，对sucCint片段进行标记。按照Eikmanns等人的方法(微生物学，1994,140：1817-1828)，分离可能整合菌株的染色体DNA，并用限制性内切酶SphⅠ和HindⅢ进行酶切。用琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，用宝灵曼公司生产的地高辛杂交试剂盒，在68℃下进行杂交。实施例3中的质粒pCRBluntsucCint自身插到DSM5715的染色体的sucC基因中。该菌株鉴别为：DSM5715：：pCRBluntsucCint。

4.2 交换载体pK18mobsacBsucDdel的构建

实施例3.2中的sucD缺失型衍生物是在使用Qiagenquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Hilden，德国)，用0.8％的琼脂糖凝胶进行分离，然后再用可移动的克隆载体pK18mobsacB(Schafer，等，基因，1994,14：69-73)进行连接。在这之前，用限制性内切酶XmaⅠ和XbaⅠ对该载体进行酶切，并与sucD缺失的等位基因混合，然后用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，弗雷堡，德国)连接。

用连接混合物对大肠杆菌DH5αmcr(Grant，等，美国科学院研究进展，1990,87：4645-4649)进行电穿孔(Hanahan，见：DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，冷泉港，纽约，1989)。用LB琼脂培养基筛选转化细胞，筛出携带质粒的细胞(Sambrook，等，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)，培养基中添加浓度为25mg/l的卡那霉素。

用Qiagen公司生产的QIAprep旋转微量制备试剂盒，从转化子中分离质粒DNA，克隆的sucD缺失的等位基因由MWG Biotech(Ebersberg，德国)进行测序而证实。该质粒命名为pK18mobsacBsucDdel。该菌株称为DH5αmcr/pK18mobsacBsucDdel.

4.3 对谷氨酸棒杆菌DSM5715菌株中sucD基因的缺失诱变

按照Tauch等人所介绍的电穿孔法(FEMS微生物学通信，1994，123：343-347)，对实施例4.2中的pK18mobsacBsucDdel载体进行电转。该载体不能在DSM5715中自行复制，结果整合在染色体中的质粒只能存在于纤维素中。通过将电转后标本涂布在LB琼脂板上，进行筛选整合有pK18mobsacBsucDdel的克隆(Sambrook，等，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)，培养基中添加浓度为15mg/l的卡那霉素。生长出的克隆在卡那霉素浓度为25mg/l的LB琼脂板上划线培养，33℃，16小时。

为了使质粒和染色体中完整的sucD基因一起切下，克隆还要在含10％蔗糖的LB琼脂中生长。pK18mobsacBsucDdel质粒含有一拷贝的sacB基因，后者可以把蔗糖转变为对谷氨酸棒杆菌无毒性的左旋蔗糖酶。只有整合的pK18mobsacBsucDdel质粒被切除的克隆，才可以在含有蔗糖的LB琼脂上生长。sucD基因的完整染色体拷贝或伴有内部缺失的不完整拷贝可与质粒一起被切除。

为了检测不完整的sucD基因是否还残留在染色体中，按照宝灵曼GmbH出版的“地高辛体系滤膜杂交法使用指南”一书中所述的方法(德国曼海姆，1993)，应用宝灵曼公司生产的地高辛杂交试剂盒，标记pK18mobsacBsucDdel质粒片段。按照Eikmanns等人的方法(微生物学，1994,140：1817-1828)，分离可能缺失突变体的染色体DNA，分别用限制性内切酶SphⅠ和PstⅠ进行酶切。酶切片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并在68℃下用宝灵曼公司的地高辛杂交试剂盒进行杂交。根据片段所显示的结果，DSM5715菌株的sucD基因拷贝完全丧失，相反，仅缺失的拷贝还一直存在。该菌株称为谷氨酸棒杆菌DSM5715ΔsucD。

实施例5

应用菌株DSM5715：：pCRBluntsucCint生产L-谷氨酸

用合适的营养培养基培养实施例4.1中谷氨酸棒杆菌株DSM5715：：pCRBluntsucCint，生产L-谷氨酸，并测定培养基上清中的谷氨酸的浓度。

为了生产谷氨酸，首先将该菌株接种在含相应抗生素的琼脂板上，33℃，24小时(卡那霉素浓度为25mg/l的脑心琼脂)。挑取琼脂平板上的菌落接种预培养基(100毫升的三角烧瓶中加10毫升培养基)。用于预培养的培养基为CgⅢ完全培养基。

CgⅢ培养基

NaCl 2.5g/l

Bacto-肽胨 10g/l

Bacto-酵母膏 10g/l

葡萄糖(单独高压灭菌) 2％(W/V)

pH值调至7.4

在该培养基中添加卡那霉素(25mg/l)。将预培养物在摇瓶中进行摇荡，240转/分，33℃，16小时。将预培养物接种在主培养基中，使主培养基的初始光密度(OD)为0.1 OD(波长为660nm)。MM培养基用于主培养。

MM培养基

CSL(玉米浸液) 5g/l

MOPS(吗啉代丙磺酸) 20g/l

葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l

盐类：

(NH4)₂SO₄ 25g/l

KH₂PO₄ 0.1g/l

MgSO₄·7H₂O 1.0g/l

CaCl₂·2H₂O 10mg/l

FeSO₄·7H₂O 10mg/l

MnSO₄·H₂O 5.0mg/l

生物素(过滤除菌) 0.3mg/l

盐酸硫胺素(过滤除菌) 0.2mg/l

延胡索酸(过滤除菌) 5.81g/l

亮氨酸(过滤除菌) 0.1g/l

CaCO₃ 25g/l

CSL，MOPS与盐溶液用氨水调至pH值为7，再进行高压灭菌。然后再加入灭菌后的底物和维生素类溶液，以及干态灭菌的CaCO₃。10毫升的培养基在100毫升带挡板的烧瓶中培养。培养基中加入浓度为25mg/l的卡那霉素。在温度为33℃，湿度为80％的条件下培养。

24小时后，用Biomek1000(贝克曼仪器GmbH，慕尼黑)测定培养液的光密度值，波长为660nm。所生成的谷氨酸可以用Eppendorf-BioTronik(汉堡，德国)氨基酸分析仪，经离子交换层析，以及茚三酮检测，可对过柱后的分离物进行定量。

表1所示为检测结果。

表1

菌株	OD值(660nm)	L-谷氨酸mg/l
菌株	OD值(660nm)	L-谷氨酸mg/l	DSM5715	10.4	20
DSM5715：：pCRBluntsucCint	3.9	154	DSM5715	10.4	20

5.1 使用DSM5715ΔsucD菌株生产L-谷氨酸

在适合产L-谷氨酸的营养培养基中对实施例4.3中的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pK18mobsacBsucDdel进行培养，测定培养液上请中谷氨酸的含量。

为了上述目的，首先将该菌株在琼脂板上孵育24小时上，33℃。然后将琼脂板上的菌落接种在这种琼脂培养基上(100毫升的三角烧瓶中含有10毫升的培养基)。全营养培养基CgⅢ用于预培养。并在培养基中添加卡那霉素，浓度为25mg/l。将预培养物在摇瓶中进行摇荡，240转/分，33℃,16小时。对从预培养物所获得的主要培养物进行接种，结果主培养物的光密度为0.1 OD(波长为660nm)。MM培养基用于主培养。

培养在含有10毫升的培养基的带挡板的100毫升摇瓶中进行。培养温度为33℃，湿度为80％。

72小时后，用Biomek1000(贝克曼仪器GmbH公司，慕尼黑)测定培养液的光密度值，波长为660nm。所生成的谷氨酸可以用Eppendorf-BioTronik(汉堡，德国)氨基酸分析仪，经离子交换层析，茚三酮检测，对过柱分离物进行定量。表2为检测结果。

表2

菌株	OD值(660nm)	L-谷氨酸mg/l
菌株	OD值(660nm)	L-谷氨酸mg/l	DSM5715	8.1	7
DSM5715ΔsucD	13.3	33	DSM5715	8.1	7

以下为本发明的附图：

图1：pCRBluntsucCint质粒图谱。

以下为所使用术语和缩写的含义。

KmR：卡那霉素抗性基因

Zeocin： Zeocine抗性基因

HindⅢ：限制性内切酶HindⅢ的酶切位点

SphⅠ：限制性内切酶SphⅠ的酶切位点

EcoRⅠ：限制性内切酶EcoRⅠ的酶切位点

sucCint： sucC基因内部片段

ColE1 ori：质粒ColE1的复制起点

图2：pK18mobsacBsucDdel质粒图谱

所使用的术语和缩写的意思如下。

oriV：类似ColE1的pMB1的复制起点

sacB：编码左旋蔗糖酶的sacB基因

RP4mob： RP4活动位点

Kan：卡那霉素抗性基因

sucDdel：谷氨酸棒杆菌的sucD缺失等位基因

SphⅠ：限制性内切酶SphⅠ的酶切位点

PstⅠ：限制性内切酶PstⅠ的酶切位点

XmaⅠ：限制性内切酶XmaⅠ的酶切位点

XbaⅠ：限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点

序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司<120>编码基因sucC和sucD的新核苷酸序列<130>990171 BT<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2410<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(142)..(1347)<223>sucC<220><221>CDS<222>(1372)..(2253)<223>sucD<400>1gcaccacgga tccaattttg ttgcaatttg caaagtttac agtgttagac ttcacaatac 60gatcatattg gtgagttgaa acacttactt ttacgggaag actttgttaa agacgcagaa 120ggctctaagc atgggccgga a atg gaa ttg gca gtg gat ctt ttt gaa tac 171

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110 115 120gtt gaa ggt ggc atg gag atc gag atc ctg gcg aag gaa aag cct gaa 555Val Glu Gly Gly Met Glu Ile Glu Ile Leu Ala Lys Glu Lys Pro Glu

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695tgtggctaat cgcccggtct gtgtagagta ttcatctgtg cgcaggacag tgtgacaaac 2353actgaatagt gcatggcttt aaggccctgt ggcgcagttg gttagcgcgc cgccctg 2410<210>2<211>402<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Met Glu Leu Ala Val Asp Leu Phe Glu Tyr Gln Ala Arg Asp Leu Phe

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20 25 30Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ala Glu Glu Ile Gly Gly Leu Thr Val Val

35 40 45Lys Ala Gln Val Lys Val Gly Gly Arg Gly Lys Ala Gly Gly Val Arg

50 55 60Val Ala Pro Thr Ser Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala Asp Ala Ile Leu65 70 75 80Gly Met Asp Ile Lys Gly His Thr Val Asn Gln Val Met Val Ala Gln

85 90 95Gly Ala Asp Ile Ala Glu Glu Tyr Tyr Phe Ser Ile Leu Leu Asp Arg

100 105 110Ala Asn Arg Ser Tyr Leu Ala Met Cys Ser Val Glu Gly Gly Met Glu

115 120 125Ile Glu Ile Leu Ala Lys Glu Lys Pro Glu Ala Leu Ala Lys Val Glu

130 135 140Val Asp Pro Leu Thr Gly Ile Asp Glu Asp Lys Ala Arg Glu Ile Val145 150 155 160Thr Ala Ala Gly Phe Glu Thr Glu Val Ala Glu Lys Val Ile Pro Val

165 170 175Leu Ile Lys Ile Trp Gln Val Tyr Tyr Glu Glu Glu Ala Thr Leu Val

180 185 190Glu Val Asn Pro Leu Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Val Ile Ala Leu

195 200 205Asp Gly Lys Ile Thr Leu Asp Asp Asn A la Asp Phe Arg His Asp Asn

210 215 220Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ser Ala Gly Gly Leu Asp Ile Leu Glu Leu225 230 235 240Lys Ala Lys Lys Asn Asp Leu Asn Tyr Val Lys Leu Asp Gly Ser Val

245 250 255Gly Ile Ile Gly Asn Gly Ala Gly Leu Val Met Ser Thr Leu Asp Ile

260 265 270Val Ala Ala Ala Gly Glu Arg His Gly Gly Gln Arg Pro Ala Asn Phe

275 280 285Leu Asp Ile Gly Gly Gly Ala Ser Ala Glu Ser Met Ala Ala Gly Leu

290 295 300Asp Val Ile Leu Gly Asp Ser Gln Val Arg Ser Val Phe Val Asn Val305 310 315 320Phe Gly Gly Ile Thr Ala Cys Asp Val Val Ala Lys Gly Ile Val Gly

325 330 335Ala Leu Asp Val Leu Gly Asp Gln Ala Thr Lys Pro Leu Val Val Arg

340 345 350Leu Asp Gly Asn Asn Val Val Glu Gly Arg Arg Ile Leu Ala Glu Tyr

355 360 365Asn His Pro Leu Val Thr Val Val Glu Gly Met Asp Ala Ala Ala Asp

370 375 380His Ala Ala His Leu Ala Asn Leu Ala Gln His Gly Gln Phe Ala Thr385 390 395 400Ala Asn<210>3<211>294<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>3Met Ser Ile Phe Leu Asn Ser Asp Ser Arg Ile Ile Ile Gln Gly Ile1 5 10 15Thr Gly Ser Glu Gly Ser Glu His Ala Arg Arg Ile Leu Ala Ser Gly

20 25 30Ala Lys Leu Val Gly Gly Thr Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gln Thr Ile

35 40 45Leu Ile Asn Asp Thr Glu Leu Pro Val Phe Gly Thr Val Lys Glu Ala

50 55 60Met Glu Glu Thr Gly Ala Asp Val Thr Val Ile Phe Val Pro Pro Ala65 70 75 80Phe Ala Lys Ala Ala Ile Ile Glu Ala Ile Asp Ala His Ile Pro Leu

85 90 95Cys Val Ile Ile Thr Glu Gly Ile Pro Val Arg Asp Ala Ser Glu Ala

100 105 110Trp Ala Tyr Ala Lys Lys Val Gly His Thr Arg Ile Ile Gly Pro Asn

115 120 125Cys Pro Gly Ile Ile Thr Pro Gly Glu Ser Leu Ala Gly Ile Thr Pro

130 135 140Ala Asn Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Gly Leu Ile Ser Lys Ser Gly145 150 155 160Thr Leu Thr Tyr Gln Met Met Tyr Glu Leu Ser Asp Ile Gly Ile Ser

165 170 175Thr Ala Ile Gly Ile Gly Gly Asp Pro Ile Ile Gly Thr Thr His Ile

180 185 190Asp Ala Leu Glu Ala Phe Glu Ala Asp Pro Glu Thr Lys Ala Ile Val

195 200 205Met Ile Gly Glu Ile Gly Gly Asp Ala Glu Glu Arg Ala Ala Asp Phe

210 215 220Ile Ser Lys His Val Thr Lys Pro Val Val Gly Tyr Val Ala Gly Phe225 230 235 240Thr Ala Pro Glu Gly Lys Thr Met Gly His Ala Gly Ala Ile Val Thr

245 250 255Gly Ser Glu Gly Thr Ala Arg Ala Lys Lys His Ala Leu Glu Ala Val

260 265 270Gly Val Arg Val Gly Thr Thr Pro Ser Glu Thr Ala Lys Leu Met Arg

275 280 285Glu Val Val Ala Ala Leu

290

Claims

1．含有编码sucC基因和/或sucD基因的的多核苷酸序列的分离的多核苷酸，其选自如下一组

a)与编码含SEQ ID No.2所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少70％相同性的多核苷酸，

b)与编码含SEQ ID No.3所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少70％相同性的多核苷酸，

c)编码含有与SEQ ID No.2氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

d)编码含有与SEQ ID No.3氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

e)与a)、b)、c)或d)互补的多核苷酸，及，

f)含多核苷酸序列a)、b)、c)、d)或e)的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，该多肽序列优选地具有琥珀酰辅酶A合成酶的活性。

2．如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸优选地是重组的可在棒状细菌中复制的DNA。

3．如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。

4．如权利要求2所述的多核苷酸，含有SEQ ID No.1所示的核酸序列。

5．如权利要求2所述的可复制的DNA，其含有

(ⅰ)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者

(ⅳ)(ⅰ)的功能性中性有义突变。

6．如权利要求5所述的可复制的DNA，其中杂交是在相当于最大2×SSC的严格条件下进行。

7．如权利要求1所述的多核苷酸，其编码含有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的多肽。

8．棒状细菌，其sucC基因和/或sucD基因是弱化的。

9．生产L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸和/或L-谷氨酸的方法，其中进行下列步骤：

a)发酵产生所需的L-氨基酸的细菌，该细菌中首先sucC基因和/或sucD基因或者其编码核苷酸序列是弱化的，尤其是关闭的；

b)在培养基中或在细菌细胞中富集L-氨基酸，并

c)分离L-氨基酸。

10．如权利要求9所述的方法，其中所用的细菌中所需的L-氨基酸的生物合成途径的额外基因被增强。

11．如权利要求9所述的方法，其中所用的细菌中降低所需的L-氨基酸的形成的代谢途径被至少部分地关闭。

12．如权利要求9所述的方法，其中编码sucC基因和/或sucD基因的多核苷酸的表达被弱化，尤其是被关闭。

13．如权利要求9所述的方法，其中多核苷酸sucC和sucD编码的多肽(酶蛋白)的催化特性被降低。

14．如权利要求9所述的方法，其中为了生产L-氨基酸，发酵如下的微生物，该微生物中，选自下列一组中的一个或多个基因被同时增强和/或过表达：

14.1．编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，

14.2．编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，

14.3．编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的gap基因，

14.4．编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因，

14.5．编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因，

14.6．编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因，

14.7．编码L-赖氨酸输出蛋白的lysE基因，

14.8．编码反馈抑制天冬氨酸激酶的lysC基因，

14.9．编码Zwal-蛋白的zwal基因。

15．如权利要求9所述的方法，其中为了生产L-氨基酸，发酵如下棒状细菌微生物，该微生物中，选自下列一组中的一个或多个基因同时被弱化：

15.1．编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，

15.2．编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，

15.3．编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，

15.4．编码Zwa2-蛋白的zwa2基因。

16．含有一个载体的棒状细菌，其中该载体带有如权利要求1所述多核苷酸的部分、至少是所述序列中的15个连续的核苷酸。

17．如前述一或多项权利要求的方法，其中所利用的微生物是谷氨酸棒杆菌。

18．检测RNA,cDNA和DNA，以分离编码琥珀酰辅酶A合成酶或者具有与sucC基因和/或sucD基因的序列具有高度相似性的核酸和/或多核苷酸或基因的方法，其中将含有如权利要求1、2、3或4所述的多核苷酸序列的多核苷酸用作杂交探针。