CN1432066A - 编码glb0基因的新核苷酸序列 - Google Patents

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CN1432066A CN01810385.5A CN01810385A CN1432066A CN 1432066 A CN1432066 A CN 1432066A CN 01810385 A CN01810385 A CN 01810385A CN 1432066 A CN1432066 A CN 1432066A
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Abstract

本发明提供了一种分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的多核苷酸序列：a)与编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还提供了经增强编码类血红蛋白的glbO基因而发酵制备L－氨基酸的方法，及上述多核苷酸作为引物或杂交探针的应用。

Description

编码glbO基因的新核苷酸序列
本发明提供了编码glbO基因的核苷酸序列，及用棒状细菌(coryneform bacteria)经发酵制备L-氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，其中棒状细菌中glbO基因是增强的。
现有技术
L-氨基酸，尤其L-赖氨酸，用于人的药物及制药工业，但尤为用于动物营养。
已知L-氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的发酵而生产。由于L-氨基酸的极其重要性，不断进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵技术，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分，如发酵期间的糖浓度，或产物形成的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法，可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性或重要的调节氨基酸营养缺陷的并产生L-赖氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于生产L-赖氨酸的棒杆菌菌株改良，其通过扩增各个L-赖氨酸生物合成基因，并研究对L-氨基酸生产的作用而进行改良。此方面的综述文章见Kinoshita(“谷氨酸细菌”，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，BenjaminCummings，英国伦敦，1985，115-142)，Hilliger(生物技术2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6：261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技术的关键回顾15，73-103(1995))，及Sahm等(纽约科学协会年报782，25-39(1996))。
发明目的
本发明人目的在于为改良L-氨基酸，尤其L-赖氨酸的生产而提供新措施。
发明详述
下文提及的L-氨基酸或氨基酸指选自如下一组的一或多种氨基酸，包括其盐，所述的组包括L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，和L-精氨酸。尤为优选L-赖氨酸。
当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了分离自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码含有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
其中所述多肽优选呈现类血红蛋白活性。
本发明还提供了一种多核苷酸，其优选是在棒状细菌中能复制的重组DNA。
本发明还提供了一种多核苷酸，其是一种RNA。
本发明还提供了一种如上述的多核苷酸，其中其优选包含一种能复制的DNA，所述DNA含有
(i)SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并范围内匹配于(i)序列的至少一个序列，或
(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(iv)(i)中有功能的中性有义突变。
本发明还提供了
含有本发明多核苷酸的一种载体，
和作为宿主细胞的棒状细菌，其含有所述载体或其glbO基因是增强的。
本发明还提供了多核苷酸，其基本上含有一多核苷酸序列，其可通过用含有所述多核苷酸序列的相应于SEQ ID NO：1或其片段的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述文库包括具有相应于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列的完整基因。
含有本发明序列的多核苷酸序列适用作RNA，cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码类血红蛋白(haemoglobin-like protein，glbO)的全长cDNA，以及分离与类血红蛋白的基因具有高度相似性的cDNA或基因。
含有本发明序列的多核苷酸序列还适用作引物以通过聚合酶链反应(PCR)制备编码类血红蛋白的DNA或基因。
作为探针或引物的所述寡核苷酸包括至少30个，优选至少20个，特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40个或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其中RNA或DNA可被修饰或未被修饰。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽，特别是具有类血红蛋白活性的多肽，以及与SEQ ID NO：2的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO：2的多肽至少80％，特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产L-氨基酸的棒状细菌生产L-氨基酸尤其L-赖氨基酸的发酵方法，在该棒状细菌中编码glbO基因的核苷酸序列被增强，尤其是被过表达。
文中术语“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属，在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
棒杆菌属特别是谷氨酸棒杆菌的合适菌株，例如是已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和
扩展短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020和从中获得的生产L-赖氨酸的突变体或菌株，如：
谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709
黄色短杆菌FERM-P 1708
乳发酵短杆菌FERM-P 1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P6464和
谷氨酸棒杆菌DSM5715。
谷氨酸棒杆菌的编码类血红蛋白的新glbO基因得以分离。
为分离谷氨酸棒杆菌的glbO基因或其它基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(VerlagChemie，Weinhein，德国，1990)，或Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社，1989)。一个熟知的基因文库是由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的大肠杆菌K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252，255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCosI(Wahl等，1987，美国科学院院报84，2160-2164)，在大肠杆菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。
Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326，1992)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。
使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因19：259～268)也可在大肠杆菌产生谷氨酸棒杆菌的基因文库。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αMCR，如Grant等(美国科学院院报87(1990)4645～4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可用适于测序的通用载体亚克隆并测序，如Sanger等(美国科学院院报74：5463-5467，1977)所述。
以此方式获得的谷氨酸棒杆菌的编码glbO基因的新DNA序列如SEQ ID NO：1所示，其是本发明的一部分。用前述方法从此DNA序列中也已推导出相应蛋白质的氨基酸序列。所得glbO基因产物的氨基酸序列在SEQ ID NO：2示出。
通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO：1的编码DNA序列也是本发明的一部分。蛋白质中氨基酸的保守取代，如用丙氨酸取代甘氨酸，或用谷氨酸取代天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质活性的根本改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至稳定其功能。本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751-757(1987))，O’Regan等(基因77：237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3：240-247(1994))，Hochuli等(生物/技术6：1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO：1的氨基酸序列和编码这些氨基酸序列的DNA序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。最后，用产生自SEQ ID NO：1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的一部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸的长度。
本领域技术人员通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)，以及Liebl等(国际系统细菌学杂志(1991)41：255～260)。本领域技术人员用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成：实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，海德堡，德国，1994)。
发现在glbO基因过表达后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸，尤其L-赖氨酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式作用。通过可诱导启动子，在L-氨基酸发酵生产期间增强表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白的降解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变营养培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，EP 0 472 869，US4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))，Reischeid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，WO 96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物学综述60：512-538(1996)及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的glbO基因已借助于质粒被过表达。
适当的质粒是那些在棒状细菌中复制的质粒。许多已知质粒载体例，如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64，549-554)，pEKEx1(Eikamanns等，基因102，93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107，69-74，(1991))，是基于隐蔽性质粒pHM1519，pBL1或pGA1的。其它质粒载体，例如那些基于pCG4(US-A 4,489,160)，或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学信息66，119-124(1990))，或pAG1(US-A 5,158,891)的质粒载体，可以相同方式使用。
其它适当的质粒载体是那些可以用来通过整合入染色体中而进行基因扩增的载体，例如Reinscheid等(应用和环境微生物学60，126-132(1994))所述用于复制或扩增hom-thrB操纵子的质粒载体。在这种方法中，将所述完整基因克隆入一个质粒载体中，所述载体能在宿主中复制(典型是大肠杆菌)，但在谷氨酸棒杆菌中不能复制。可提及的载体，例如是，pSUP301(Simon等，生物/技术1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物的化学杂志269：32678-84；US-A 5487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，荷兰；Bernard等，分子生物学杂志，234：534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173：4510-4516)。然后通过接合或转化，将含有被扩增的基因的质粒载体移至所需谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如Schafer等(应用和环境微生物学60，756-759(1994))所述。转化方法例如Thierbach等，(应用微生物学和生物技术29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通信123，343-347(1994))所述。在通过“交换”同源重组后，所得菌株含有至少两个拷贝的所述基因。
本发明因此还提供了一种发酵生产L-氨基酸尤其L-赖氨酸的方法，其中使用用一种质粒载体转化的一个菌株，而且所述质粒载体携带编码类血红蛋白的基因的核苷酸序列。
另外，不仅扩增glbO基因，而且所需L-氨基酸的生物合成途径的基因，如特定生物合成途径，糖酵解，柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的过表达，对氨基酸尤其L-赖氨酸的生产可以是有益的。
为生产L-赖氨酸，例如，除了增强glbO基因之外，还可以同时增强尤其过表达一或多个选自以下一组的基因：
·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0 197335)
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)
·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)
·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)。
除扩增glbO基因之外，同时弱化尤其降低以下基因表达对氨基酸尤其L-赖氨酸的生产也可以是有益的：
·编码磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，和/或
·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE：199 51 975.79)。
除过表达glbO基因之外，抑制非所需的二级反应对L-氨基酸，特别是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续或非连续通过分批法，或补料分批法或重复补料分批法培养，以生产氨基酸尤其L-赖氨酸。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须充分符合特殊菌株的要求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C..USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪，如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸，如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇，如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至L-赖氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
本发明因此提供了一种发酵生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，其中进行以下步骤：
a)将生产L-氨基酸的棒状细菌发酵，该细菌中至少编码类血红蛋白的glbO基因被增强，尤其是被过表达，
b)积累培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，
c)分离所述L-氨基酸。
L-赖氨酸可以通过阴离子交换层析，随后茚三酮衍生进行分析，如Spackman等(分析化学30，(1958)，1190)所述。
本发明的目的是通过发酵方法用于生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详细阐述。实施例1：产生谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒基因文库
如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Joua，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编号251301)的粘粒载体Super Cosl(Wahl等，(1987)美国科学院院报84：2160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI编号27-0948-02)酶切，并也用虾碱性磷酸酶去磷酸化。
粘粒DNA然后用限制性的内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编号27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶。编号27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编号200217)包装进噬菌体中。
将细菌置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬浮液混合而感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox.1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。实施例2：glbO基因的分离与测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau 3AI，编号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酶酶(Roche分子生物化学，德国曼海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA片段去磷酸化。经凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。
将得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biobech，Freiburg，德国)孵育过夜。然后将连接混合物电穿孔进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报87：4645-4649)(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123：343-7)，并在含有50μg/ml zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。
重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”(产品号403044，Weiterstadt，德国)。在购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29∶1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中，进行凝胶电泳分离和序列分析。
所得原始序列数据然后用Staden软件包(1986，核酸研究，14：217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231)进行计算机辅助编码区分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行进一步分析。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，对该核苷酸序列的分析显示一393碱基对的开放阅读框架，其被称为glbO基因。glbO基因编码一个131个氨基酸的蛋白质。实施例3：制备增强谷氨酸棒杆菌中glbO基因的穿梭载体pEC-K18mob2glbOexp3.1：大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-K18mob2的构建
根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体。此载体含有质粒pGA1的包括复制效应子per的复制区rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，细菌学杂志179，1525-1532(1997))，具有卡那霉素抗性的转座子Tn5的aph(3’)-IIa基因(Beck等，(1982)，基因19，327-336)，质粒pMB1的复制区oriV(Sutcliffe，冷泉港关于定量生物学的座谈会43，77-90(1979))，包括lac启动子和一个多克隆位点(mcs)的lacZα基因片段(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))和质粒RP4的mob区域(Simon等，生物/技术1：784-791(1983))。然后将构建的载体转化入大肠杆菌菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆。实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，美国华盛顿DC)。
通过将转化混合物铺板于已经补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂上，选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港实验室，N.Y.)。使用Qiagen的QIAprepSpin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII酶切，随后进行琼脂糖凝胶电泳(0.8％)鉴定。所得质粒称为pEC-K18mob2，并示于图1。
以下微生物根据布达佩斯条约于2000年1月20日保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，德国)：
谷氨酸棒杆菌菌株DSM 5715/pEC-K18mob2，保藏号DSM 132453.2大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-K18mob2中glbO的克隆
所用载体是实施例3.1中所述的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-K18mob2。此质粒的DNA用限制性内切酶Ecl136II充分酶切，然后用虾碱性磷酸酶(Roche诊断试剂GmbH，德国曼海姆，产品描述SAP，产品号1758250)去磷酸化。
使用Eikmanns等所述方法从菌株ATCC13032中分离染色体DNA(微生物学140：1817-1828(1994))。基于实施例2中获得的谷氨酸棒杆菌glbO基因的序列，选择以下寡核苷酸进行PCR：
glb-exp1，SEQ ID NO：3所示，
5’GGT CGG TGA GAT AAT CAG 3’
glb-exp2，SEQ ID NO：4所示，
5’TGG CAG AAG TTA AGC GTG 3’
通过ARK科学公司GmbH生物系统(Darmstadt，德国)合成所述引物，而且通过Innis等所述标准PCR方法进行PCR反应(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)，使用得自Roche DiagnosticsGmbH的Pwo聚合酶(德国曼海姆)。通过聚合酶链反应，所述引物使携带glbO基因的一个936kb的DNA片段得以扩增。
将以此方式获得的glbO片段与制备的pEC-K18mob2载体混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4 DNA连接酶，编号27-0870-04)处理此混合物。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，Oxford，华盛顿DC，美国)。通过在含25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学1：190)上铺板转化混合物，选择携带质粒的细胞。在37℃孵育过夜后，选择重组单个克隆。根据厂商指导，用Qiaprep Spin微量制备试剂盒〔产品号27106，Qiagen，Hilden，德国〕从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRI和EcoRI/PstI酶切，随后进行琼脂糖凝胶电泳分析质粒。通过测序检测扩增的DNA片段的DNA序列。所得质粒被称为pEC-K18mob2glbOexp，示于图2。实施例4  用质粒pEC-K18mob2glbOexp转化菌株DSM5715
用如Liebl等所述(FEMS微生物学通信53，299-303(1989))的电穿孔法，用质粒pEC-K18mob2glbOexp转化菌株DSM5715。在补加25mg/l卡那霉素的由18.5g/l脑心浸液肉汁，0.5M山梨醇，5g/l细菌培养用胰化蛋白胨，2.5g/l细菌培养用酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l细菌培养用琼脂组成的LBHIS琼脂上选择转化体。在33℃孵育2天。
通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144，915-927)从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRI和EcoRI/PstI酶切，随后经琼脂糖凝胶电泳分析质粒。所得菌株的纯培养物被称为DSM5715/p EC-K18mob2glbOexp。实施例5  生产赖氨酸
将实施例4中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pEC-K18mob2glbOexp在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃，在具有适当抗生素的琼脂板(含25mg/l卡那霉素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从此琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII
NaCl                                 2.5g/l
Bacto-胨                             10g/l
Bacto-酵母提取物                     10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)                 2％(w/v)pH调节为7.4。
加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.05。培养基MM用于主培养物。
培养基MM：
CSL(玉米浆)                       5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)                20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)              50g/l
(NH4)2SO4                      25g/l
KH2PO4                          0.1g/l
MgSO4·7H2O                     1.0g/l
CaCl2·2H2O                     10mg/l
FeSO4·7H2O                     10mg/l
MnSO4·H2O                      5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)                  0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)             0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)                0.1g/l
CaCO3                            25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
试验结果示于表1。表1
    菌株     OD(660nm)   赖氨酸HCl25g/l
    DSM5715     7.6     13.5
    DSM5715/pEC-K18mob2glbOexp     8.5     15.7
附图的简要说明：
图1：质粒pEC-K18mob2图。
图2：质粒pEC-K18mob2glbOexp图。
缩写和名称如下定义。所述碱基对数字是在测定重复性的框架内所得的近似值。
per：pGA1的控制拷贝数的基因。
oriV：源自pMB1的类ColE1。
rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制区。
RP4mob：RP4迁移位点。
LacZ-alpha：来自大肠杆菌的lacZ基因片段。
Kan：卡那霉素抗性基因。
glbO：来自谷氨酸棒杆菌的glbO基因。
EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点。
HindIII：限制酶HindIII的酶切位点。
PstI：限制酶PstI的酶切位点。
Ec1136II：限制酶Ec1136II的酶切位点。
                          序列表<110>德古萨股份公司<120>编码glbo基因的新核苷酸序列<130>990218 BT<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>840<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(186)..(578)<400>1atggtggttt taccggcgcc atttggacca agtacggccc agtgcgaccc ttgcggaatt  60gagagggaga tatcgtcgag aagcaatttc tcgccgcgcc gcacggtgac gccggccatg  120ttgagtgcta gttcgcgcat gggtaacacc ttactggcgt aaggccaggg cttagactgg  180taccc atg aca acc tca gaa aat ttt tat gat tct gtg ggc ggc gag gaa  230
  Met Thr Thr Ser Glu Asn Phe Tyr Asp Ser Val Gly Gly Glu Glu
    1               5                  10                  15acg ttt tcc ctc atc gtc cac cgt ttt tat gaa cag gtc ccc aac gac    278Thr Phe Ser Leu Ile Val His Arg Phe Tyr Glu Gln Val Pro Asn Asp
             20                  25                  30gat att tta ggc ccg atg tat ccg ccg gat gat ttt gag ggc gcc gag    326Asp Ile Leu Gly Pro Met Tyr Pro Pro Asp Asp Phe Glu Gly Ala Glu
         35                  40                  45cag cgt cta aag atg ttc ctc agc cag tac tgg ggc ggc ccg aag gat    374Gln Arg Leu Lys Met Phe Leu Ser Gln Tyr Trp Gly Gly Pro Lys Asp
     50                  55                  60tat cag gag cag cgt gga cac cct cgt ctg cgc atg cgt cac gtc aat    422Tyr Gln Glu Gln Arg Gly His Pro Arg Leu Arg Met Arg His Val Asn
 65                  70                  75tac ccc atc ggc gtc acc gca gcg gag cgt tgg ctg cag ctc atg tcc    470Tyr Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala Glu Arg Trp Leu Gln Leu Met Ser80                  85                  90                  95aat gca ctc gac ggc gtg gat ttg acc gcg gag cag cgt gaa gcg att    518Asn Ala Leu Asp Gly Val Asp Leu Thr Ala Glu Gln Arg Glu Ala Ile
            100                 105                 110tgg gag cat atg gtg cgc gcg gcc gat atg ctg atc aat tcc aac ccc    566Trp Glu His Met Val Arg Ala Ala Asp Met Leu Ile Asn Ser Asn Pro
        115                 120                 125gat ccg cac gct taacttctgc caaaaagtcg ttttgaccat aagctaagcg        618Asp Pro His Ala
    130attgtgaatc gaattgcaga aatcgcacgc agtttcggcg tgctgggctt cagcgctttc   678ggcggcccca ccgcgcacct cggatatttc cgcacggaat tcgtggagcg gcggcgctgg   738ctggatgatc gccaatattc cgagatcgta gcgctcagcc aactacttcc cggacctgga   798tcgtcgcagg tcggtatgat gctgggctac caccgcgccg gt                      840<210>2<211>131<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Met Thr Thr Ser Glu Asn Phe Tyr Asp Ser Val Gly Gly Glu Glu Thr1               5                  10                  15Phe Ser Leu Ile Val His Arg Phe Tyr Glu Gln Val Pro Asn Asp Asp
         20                  25                  30Ile Leu Gly Pro Met Tyr Pro Pro Asp Asp Phe Glu Gly Ala Glu Gln
     35                  40                  45Arg Leu Lys Met Phe Leu Ser Gln Tyr Trp Gly Gly Pro Lys Asp Tyr
 50                  55                  60Gln Glu Gln Arg Gly His Pro Arg Leu Arg Met Arg His Val Asn Tyr65                 70                  75                  80Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala Glu Arg Trp Leu Gln Leu Met Ser Asn
             85                  90                  95Ala Leu Asp Gly Val Asp Leu Thr Ala Glu Gln Arg Glu Ala Ile Trp
        100                 105                 110Glu His Met Val Arg Ala Ala Asp Met Leu Ile Asn Ser Asn Pro Asp
    115                 120                 125Pro His Ala
130<210>3<211>18<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><223>glb-exp1<400>3ggtcggtgag ataatcag                                            18<210>4<211>18<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><223>glb-exp2<400>4tggcagaagt taagcgtg                                            18
                             PCT/RO/134表关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二)PCT/RO/134表(1992年7月)

Claims (17)

1、来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码含有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，和
d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
其中所述多肽优选地具有类血红蛋白的活性。
2、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选地为重组的DNA。
3、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4、权利要求2的能复制的DNA，含有
(i)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并范围内匹配于(i)序列的至少一个序列，或
(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(iv)(i)中有功能的中性有义突变。
5、权利要求2的多核苷酸序列，其编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
6.含有权利要求1的多核苷酸序列的载体。
7.含有权利要求6的载体的棒状细菌。
8、经发酵制备L-氨基酸的方法，其中进行以下步骤：
a)将生产L-氨基酸的棒状细菌进行发酵，该细菌中至少编码类血红蛋白的基因被增强，尤其是过表达。
b)富集培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及
c)分离L-氨基酸。
9、权利要求8的方法，其中所用细菌中所需的L-氨基酸生物合成途径的其它基因也被增强。
10、权利要求8的方法，其中所用细菌中降低L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分抑制。
11、权利要求8的方法，其中使用经质粒载体转化的菌株，且所述质粒载体携带编码类血红蛋白的基因的核苷酸序列。
12、权利要求8-11任一项的方法，其中使用生产L-赖氨酸的棒状细菌。
13、权利要求9的方法，其中选自下组的一个或多个基因被同时增强，尤其是过表达或扩增：
编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因，
编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
编码3-磷酸甘油酸激酶pgk基因，
编码赖氨酸输出的lysE基因。
14、权利要求10的方法，其中L-赖氨酸是通过发酵如下细菌产生的，该细菌中选自下组一个或多个基因被同时弱化：
编码磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的pck基因，
编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，
编码丙酮酸氧化酶的poxB基因。
15、前述权利要求所述任一项方法，其中使用谷氨酸棒杆菌的微生物。
16.权利要求1的多核苷酸序列作为引物以通过聚合酶链反应产生编码glbO基因产物的基因DNA的应用。
17.权利要求1的多核苷酸序列作为杂交探针的应用。
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