CN1312373A - 编码zwa2基因的新核苷酸序列 - Google Patents

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CN1312373A CN00136074A CN00136074A CN1312373A CN 1312373 A CN1312373 A CN 1312373A CN 00136074 A CN00136074 A CN 00136074A CN 00136074 A CN00136074 A CN 00136074A CN 1312373 A CN1312373 A CN 1312373A
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阿尔弗雷德·普尔勒
约恩·卡利诺夫斯基
布里吉特·巴特
妮科尔·杜施
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Abstract

本发明涉及一种新的分离的多核苷酸,其含有选自如下一组的多核苷酸序列:a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸;b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸;c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸,以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及经弱化所用棒状细菌中的zwa2基因而发酵生产L－赖氨酸的方法。

Description

编码zwa2基因的新核苷酸序列
本发明提供了编码zwa2基因的核苷酸序列，及用棒状细菌发酵生产氨基酸尤其L-赖氨酸的方法，其中棒状细菌中zwa2基因是弱化的。
氨基酸尤其L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，但特别用于动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)一半胱氨酸有抗性，或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒状菌生产氨基酸的菌株的改良。
本发明人目的在于为改良氨基酸特别是L-赖氨酸的发酵生产而提供新措施。
L-氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物，制药工业，特别是动物营养。因此提供生产氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸序列互补的多核苷酸，以及
d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选是能复制的DNA，含有：
(ⅰ)SEQ ID NO:1所示的编码zwa2基因的核苷酸序列，
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
本发明还提供了：
权利要求4的多核苷酸，含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，
含有权利要求1的多核苷酸序列的载体，特别是pCR2.1zwa2int，以在大肠杆菌中的形式保藏，保藏号DSM 13113，
以及作为宿主细胞的棒状细菌，其用权利要求6的载体通过整合诱变而获得。
本发明还提供了多核苷酸，其基本上由一多核苷酸序列组成，其可通过用含有SEQ ID NO:1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述文库含有具有相应于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的完整基因文库含有具有相应于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的完整基因或其部分。
根据本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码zwa2基因的全长cDNA，以及分离与zwa2基因具有高度相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)产生编码zwa2的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个，优选至少20个，特别优选至少15个连续核苷酸，具有至少40个或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为含有经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽，特别是具有zwa2基因产物生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO:2的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO:2多肽至少80％，特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸尤其L-赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码zwa2基因的核苷酸序列是弱化的，尤其是低表达的。
本发明的微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-赖氨酸。此微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
醋谷棒杆菌ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
嗜热产氨FERM BP-1539
黄色短杆菌ATCC 14067
乳发酵短杆菌ATCC 13869和
扩展短杆菌ATCC 14020和从中获得的生产L-赖氨酸的突变体或菌株，例如：
谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709
黄色短杆菌FERM-P 1708
乳发酵短杆菌FERM-P 1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464和
谷氨酸棒杆菌DSM5715
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码Zwa2基因产物的新zwa2基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的zwa2基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立的一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库，例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50,495-508(1987))在入载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252:255-265,1996)阐述了借助于粘粒载体Super Cos I(Wahl等,1987，美国科学院院报84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3),317-3267)描述了用粘粒pHC 79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒pBR 322(Bolivar，生命科学25,807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因19:259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报74:5463-5467,1977)所述。
以此方式可获得编码zwa2基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1，是本发明的一部分。另外，从获得的此DNA序列中衍生出zwa2基因相应基因产物的氨基酸序列。所产生的Zwa2基因产物的氨基酸序列示作SEQID NO:2。
通过遗传密码简并性产生自SEQ ID NO:1的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。最后，用产生自SEQ IDNO:1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的一部分。
通过杂交鉴别DNA序列的指导参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41:255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在zwa2基因弱化后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸尤其是L-赖氨酸。
为产生弱化，zwa2基因的表达或酶蛋白的催化性质可被降低或关闭，任选地可组合使用这二种方法。
通过适当的培养或遗传修饰(诱变)基因表达的信号结构，可降低基因表达，基因表达的信号结构例如是阻抑物基因，激活基因，操纵子，启动子，弱化子，核糖体结合位点，起始密码子和终止子，对此的阐述参见于专利申请WO 96/15246,Boyd与Murphy(细菌学杂志170:5949(1988)),Voskuil与Chambliss(核酸研究26:3548(1998)),Jensen与Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998)),Patek等(微生物学142:1297(1996))及已知关于遗传和分子生物学的教材。例如，由Knipper所著教材(“分子遗传学”第6版，Georg Thieme Verlag,Stuttgart，德国，1995)，或Winnacker所著教材(“基因与克隆”，VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim德国，1990)。
本领域已知导致酶蛋白催化性质改变或降低的突变，例如可参见Qiu与Goodman(生物化学杂志272:8611-8617(1997)),Sugimoto等(生物科学生物技术及生物化学61:1760-1762(1997))及Mockel(“谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱氢酶∶酶的别构调节方法和结构”，Julich研究中心报导，Jul-2906,ISSN 0992952,Julich，德国1994)。关于遗传及分子生物学的已知教材中，例如由Hagemann所著教材(“Allgemeine Genetik”,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart 1986)。
转换、颠换、插入及缺失被认为是突变。依于氨基酸置换对酶活性的影响称作错义突变或无义突变。基因中至少一个碱基对的插入或缺失导致移码突变，其结果是掺入错误的氨基酸或提前中止翻译，一些密码子的缺失典型地导致酶活性的完全丧失，产生这些类型突变的方法是现有技术的一部分，并可参见于已知关于遗传及分子生物学的教材，例如由Knippers所著教材(“分子遗传学”，第6版，Georg Thieme Verlag,Stuttgart，德国，1995)由Winnacker所著教材(“基因与克隆”VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim，德国，1990)或由Hagemann所著教材(“Allgemeine Genetik”,Gustav FischerVerlag Stuttgart 1986)。
借助于质粒可进行zwa2基因的插入诱变，该质粒例如是pCR2.1zwa2int(图1)。
质粒pCR2.1zwa2int包括由Mead等所述的质粒pCR2.1-TOPO(生物/技术9:657-663(1991))，在其中已掺入SEQ ID NO:3所示zwa2基因的内部片段。转化和在染色体zwa2基因中同源重组(插入)之后，此质粒导致功能全部丧失，以此方法制备菌株DSM5715::pCR2.1zwa2int，其中zwa2基因被关闭。其它关于插入诱变的阐述例如见于Schwarzer和Puhler(生物/技术9,84-87(1991))或Fitzpatrick等(应用微生物学及生物技术学42,575-580(1994))。
另外，除zwa2基因的弱化外，增强尤其过表达相关生物合成途径，糖酵解，回补反应，柠檬酸循环或氨基酸输出中一或多种酶，对L-氨基酸的生产是有益的。
因此，例如为生产L-赖氨酸，选自以下一组的一或多个基因可被同时增强特别是过表达或扩增：
·编码二氢-2,6-吡啶二羧酶合酶的dapA基因(EP-B0197335)，
·编码四-二氢-2,6-吡啶二羧酶琥珀酰化酶的dapD基因(Wehrmann等，细菌学杂志180,3159-3168(1998))，
·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因
·编码琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶的dapE基因(Wehrmann等，细菌学杂志177:5991-5993(1995))，
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174:6076-6086，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)，
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254,395-403)(1998)，
·编码赖氨酸输出的lysE基因(DE-A-19548222)。
另外，除弱化zwa2基因之外，同时弱化以下基因对氨基酸尤其是L-赖氨酸的生产是有益的：
·编码烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的pck基因(DE-19950409.1；DSM 13047)和/或
·编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396,478；DSM12969)。
另外，除弱化zwa2基因之外，排除非所需二级反应对氨基酸尤其是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
本发明还提供了含有权利要求1多核苷酸的微生物，且此微生物可连接培养或在分批方法，或在补料分批或重复补料分批中分批培养以生产氨基酸尤其L-赖氨酸。已知培养法由Chmiel(Bioprozesstechink l.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik)(Gustav Fischer Verlag Stuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und pepriphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Barunswick/Wiesbaden,1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。另外，可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20C～45℃，优选28℃～40℃，持续培养直至赖氨酸形成最大量。此目的通常在10-160小时范围达到。
本领域已知测定L-氨基酸的方法，可如Spackman等(分析化学30,(1958),1190)所述，通过阴离子交换层析，随后茚三酮衍生作用或反相HPLC进行分析，如Lindroth等(分析化学(1979)51：1167-1174)的所述。
适于诱变的整合载体根据布达佩斯条约，以在大肠杆菌中的形式保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：·大肠杆菌菌株Top10F′/pCR2.1zwa2int，保藏号DSM 13113。
除弱化zwa2基因之外，增强zwa1基因或相关Zwa1基因产物的作用也是有益的，相关基因及相关措施可见于德国专利申请19959328.0，其是与本申请同时申请的。
适于诱变的整合载体pCR2.1zwa1exp保藏在E.coli TOP10F’中，保藏号DSM 13115。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详细阐述。
实施例1：制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文库
如Tauch等(1995，质粒33:168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ,AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Jolla,USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码号251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学院院报84:2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述XbaⅠ，编码27-0948-02)酶切，并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC 13032 DNA片段混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用GigapackⅡXL包装提取物(Stratagene,La Jolla,USA，产品描述GigapackⅡXL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等，(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定。细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板，在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 zwa2基因的分离与测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen,Hilden,德国)，根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen,Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。将得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123:343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美国科学院院报87:4645-4649)，并在含有50μg/mlzercin的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品与900200,Qiagen,Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74:5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Witerstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒。”在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphorese NF丙烯酰胺/双丙烯酸胺”凝胶(29∶1)(产品号A124.1,Roth,Karlsrwhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0处理，pZerol衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staclen,1986，核酸研究，14:217-231)进行计算机辅助编码区分析，同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)，对“国家生物技术信息中心”(NCBI,Bethsda,MD,USA)的非冗余数据库进行。
获得的zwa2核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，对该核苷酸序列的分析显示-1740碱基对的开放读框，其被称为zwa2基因，zwa2基因编码385个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO:2所示。
实施例3:制备zwa2基因插入诱变的整合载体
通过Eikmanns等的方法(微生物学140:1817-1828(1994))分离菌株ATCC 13032的染色体DNA。基于实施例2中揭示的谷氨酸棒杆菌zwa2基因的序列，选择以下寡核苷酸进行聚合酶链反应：
zwa2-in1:5’GGAACTTGGTGACCAGGACA3’
zwa2-in2:5’CTG GCT TTG CTG CGG TGA TT 3’
通过MWG生物技术有限公司(Ebersberg，德国)合成所列引物，并用Boenrigner有限公司的Pwo聚合酶，通过Innis等的标准PCR方法(PCR方法及应用指导，1990，科学出版社)，进行PCR反应。借助于PCR，分离了近于0.6kb长的DNA片段，示于SEQ ID NO:3，其包括zwa2基因的内部片段。
扩增的DNA片段用Invitrogen公司(Carlsbad CA，美国，目录号K4500-01)的TOPO TA克隆试剂盒连接入载体pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)生物/技术9:657-663)中。将连接混合物电穿孔进大肠杆菌菌株Top10F′中(Hanahan,DNA克隆实用方法，第1卷，IRL出版社，牛津，华盛顿DC，美国)。通过将转化混合物铺板于已补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，2ndEd，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y)上选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen公司的QIA prep spin微量制备试剂盒，从转化体之中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRⅠ酶切，随后琼脂糖凝胶电泳(0.8％)。该质粒被称为pCR2.1zwa2int。
实施例4：zwa2基因整合诱变入生产赖氨酸菌株DSM 5715中
用Tauch等的电穿孔法(FEMS微生物学通信，123:343-347(1994))，将实施例2中被称为pCR2.1zwa2int的载体电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 5715中。菌株DSM 5715是-AEC抗性的赖氨酸生产菌株，载体pCR2.1zwa2int在DSM 5715中不能自行复制，且仅当其已整合入DSM 5715的染色体中时存留在细胞中。将电穿孔物铺板于已补加15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，2ndEd，冷泉港实验室出版，冷泉港，N.Y1989)上，选择具有整合进染色体中的pCR2.1zwa2int的克隆。为检测整合，对照PCR反应通过Innis等的方法(PCR方法及应用指导，1990，科学出版社)，用Boehringer公司的Pwo聚酶进行。通过组合引物zwa2-in1和zwa2-in2(见实施例3)与引物M13通用正向(5’-gttttcccagtcacgac-3’；Invitrogen公司，目录号N540-02)和M13通用反向(5’-caggaaacagctatgac-3’；Invitrogen公司，目录号No.N530-04)，其只能在载体pCR2.1zwa2int的序列中结合，可以看出质粒pCR2.1zwa2int已插入赖氨酸生产菌株DSM5715的染色体中的染色体zwa2基因中。此菌株被称为DSM5715::pCR2.1zwa2int。
实施例5：生产赖氨酸
实施例3中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM 5715::pCR2.1zwa2int，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有适当抗生素的琼脂平板(具有25mg/l卡那霉素的脑心琼脂)上培养菌株24小时，用这些琼脂平板培养物接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)，用于预培养的培养基是完全培养基CgⅢ。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时，用此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MM：CSL(玉米浆)             5g/lMOPS                    20g/l葡萄糖(单独高压灭菌)    50g/l盐：(NH4)2SO4           25g/lKH2PO4               0.1g/lMgSO4·7H2O          1.0g/lCaCl2·2H2O          10mg/lFeSO4·7H2O          10mg/lMnSO4·H2O           5.0mg/l生物素(过滤灭菌)       0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌)  0.2mg/l亮氨酸(过滤灭菌)       0.1mg/lCaCO3                 25g/l
用氨水将CSL,MOPS和盐溶液调至PH7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
48小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH,Munich)测定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)，经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸量。
所得结果示于表1。表1
菌株  OD(660) 赖氨酸HCl(g/l)
DSM 5715::pCR2.1zwa2int  12.7    12.29
DSM 5715  13.1    9.54
序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司<120>编码zwa2基因的新核苷酸序列<130>990153 BT<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1740<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(341)..(1495)<400>1gtattgcgcc gatttcccag attttgattg aaaccgatgc gccgtatatg acgccggagc 60cgtttcgggg gagtaggaat gagccgtcgt tgattggtca tacggcgcta tgcattgcgg 120aggttcgggg gatggctgtg gaggatgttg cggcggcttt gaatgagaat tttgatcgcg 180tttatggggt cacaaatcta taacgtgagg tagctcacag tcaatctgtt ggccgtggtc 240agctgtgggg gttgtggtgg gtgtgactga agtttatgaa gttgcacgcc acggcgtttt 300ggtgatggac gggggtagtt tgttaccgta ttgtgactaa ttg tta att ccc ccg   355
                                        Leu Leu Ile Pro Pro
                                          1               5aga gcg aag aag ttt tac atg gcg ccc cat cag aag tca cgg atc aac   403Arg Ala Lys Lys Phe Tyr Met Ala Pro His Gln Lys Ser Arg Ile Asn
             10                  15                  20cgg atc aac agc acc cgc tcg gtg ccg ttg cgt ttg gct acc ggt ggc   451Arg Ile Asn Ser Thr Arg Ser Val Pro Leu Arg Leu Ala Thr Gly Gly
         25                  30                  35gtg ctc gcc acc ttg ctt atc ggc gga gtc acc gct gca gct acc aaa   499Val Leu Ala Thr Leu Leu Ile Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Thr Lys
     40                  45                  50aag gac atc att gtt gat gtc aac ggc gag cag atg tcc cta gtg act   547Lys Asp Ile Ile Val Asp Val Asn Gly Glu Gln Met Ser Leu Val Thr
 55                  60                  65atg tcc ggc act gtt gaa ggt gtg ctg gcg caa gct ggt gtg gaa ctt   595Met Ser Gly Thr Val Glu Gly Val Leu Ala Gln Ala Gly Val Glu Leu70                  75                  80                 85ggt gac cag gac att gtt tcc cct tca ctg gat tca tcc atc agt gat   643Gly Asp Gln Asp Ile Val Ser Pro Ser Leu Asp Ser Ser Ile Ser Asp
             90                  95                 100gaa gac act gtg act gtt cgt act gcc aag cag gtg gcg ctc gtg gtg   691Glu Asp Thr Val Thr Val Arg Thr Ala Lys Gln Val Ala Leu Val Val
        105                 110                 115gaa ggt caa atc caa aac gtg acc acc act gcg gtt tcc gtg gag gac   739Glu Gly Gln Ile Gln Asn Val Thr Thr Thr Ala Val Ser Val Glu Asp
    120                 125                 130ctc ctg cag gaa gtc ggt ggc att acc ggt gct gat gcg gtg gac gct   787Leu Leu Gln Glu Val Gly Gly Ile Thr Gly Ala Asp Ala Val Asp Ala
135                 140                 145gat ctt tca gag acc atc cca gaa tct ggt ttg aag gtg agt gtt acc   835Asp Leu Ser Glu Thr Ile Pro Glu Ser Gly Leu Lys Val Ser Val Thr150                 155                 160                 165aag ccg aag att att tcc atc aat gat ggt ggc aag gtc act tac gtt   883Lys Pro Lys Ile Ile Ser Ile Asn Asp Gly Gly Lys Val Thr Tyr Val
            170                 175                 180tct ttg gca gct cag aac gta cag gaa gcc cta gag ctg cgg gat att   931Ser Leu Ala Ala Gln Asn Val Gln Glu Ala Leu Glu Leu Arg Asp Ile
        185                 190                 195gag ctg ggt gct cag gac cgc att aat gtg cct ctg gat cag cag ctg   979Glu Leu Gly Ala Gln Asp Arg Ile Asn Val Pro Leu Asp Gln Gln Leu
    200                 205                 210aag aac aac gct gcg arc cag arc gac cgc gtt gac aac acc gaa arc   1027Lys Asn Asn Ala Ala Ile Gln Ile Asp Arg Val Asp Asn Thr Glu Ile
215                 220                 225act gaa act gtg tct ttc gat gct gag cca acc tac gtg gat gat cca   1075Thr Glu Thr Val Ser Phe Asp Ala Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Pro230                 235                 240                 245gaa gct cca gct ggc gat gaa act gtg gtc gaa gaa ggc gct cct gga   1123Glu Ala Pro Ala Gly Asp Glu Thr Val Val Glu Glu Gly Ala Pro Gly
            250                 255                 260acc aag gaa gtt act cgc acc gta aca acc gtt aat ggt cag gaa gaa   1171Thr Lys Glu Val Thr Arg Thr Val Thr Thr Val Asn Gly Gln Glu Glu
        265                  270                275tct tcc acg gtg atc aat gaa gtt gaa atc acc gca gca aag cca gca   1219Ser Ser Thr Val Ile Asn Glu Val Glu Ile Thr Ala Ala Lys Pro Ala
    280                 285                 290acc att agc cgt ggc acc aaa act gtc gct gca aac tcc gtg tgg gat   1267Thr Ile Ser Arg Gly Thr Lys Thr Val Ala Ala Asn Ser Val Trp Asp
295                 300                 305cag ctg gca cag tgt gaa tcc ggc gga aac tgg gca atc aac aca ggt   1315Gln Leu Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly310                 315                 320                 325aat ggc ttc tcc ggc ggc cta cag ttc cac cca cag acc tgg ctc gca   1363Asn Gly Phe Ser Gly Gly Leu Gln Phe His Pro Gln Thr Trp Leu Ala
            330                 335                 340tac ggt ggt gga gct ttc tcc ggt gac gct tcc ggt gca agc cgt gaa   1411Tyr Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Asp Ala Ser Gly Ala Ser Arg Glu
        345                 350                 355cag caa atc tcc atc gca gaa aag gtt cag gct gca caa ggt tgg gga   1459Gln Gln Ile Ser Ile Ala Glu Lys Val Gln Ala Ala Gln Gly Trp Gly
    360                 365                 370gca tgg cct gct tgc acc gca agc ttg ggc atc cga tagtagaaat        1505Ala Trp Pro Ala Cys Thr Ala Ser Leu Gly Ile Arg
375                 380                 385ctggcatcca ataggtagat tgggatgcta tggaagaacc ctcaggtgca cagctgctcg 1565gcccggtaga aatccgtgcg ctggcagaaa agctcgacgt cacaccaact aagaagttgg 1625ggcagaactt tgttcacgat cccaacacgg tgcgtcgcat tgttgctgcg gcagagctca 1685ccccagacga ccacgtggtg gaagttggcc ctggtctggg ctctctgacc cttgc      1740<210>2<211>385<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Leu Leu Ile Pro Pro Arg Ala Lys Lys Phe Tyr Met Ala Pro His Gln1               5                  10                  15Lys Ser Arg Ile Asn Arg Ile Asn Ser Thr Arg Ser Val Pro Leu Arg
         20                  25                  30Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Ala Thr Leu Leu Ile Gly Gly Val Thr
     35                  40                  45Ala Ala Ala Thr Lys Lys Asp Ile Ile Val Asp Val Asn Gly Glu Gln
 50                  55                  60Met Ser Leu Val Thr Met Ser Gly Thr Val Glu Gly Val Leu Ala Gln65                  70                  75                  80Ala Gly Val Glu Leu Gly Asp Gln Asp Ile Val Ser Pro Ser Leu Asp
             85                  90                  95Ser Ser Ile Ser Asp Glu Asp Thr Val Thr Val Arg Thr Ala Lys Gln
        100                 105                 110Val Ala Leu Val Val Glu Gly Gln Ile Gln Asn Val Thr Thr Thr Ala
    115                 120                 125Val Ser Val Glu Asp Leu Leu Gln Glu Val Gly Gly Ile Thr Gly Ala
130                 135                 140Asp Ala Val Asp Ala Asp Leu Ser Glu Thr Ile Pro Glu Ser Gly Leu145                 150                 155                 160
    Lys Val Ser Val Thr Lys Pro Lys Ile Ile Ser Ile Asn Asp Gly Gly
                    165                 170                 175
    Lys Val Thr Tyr Val Ser Leu Ala Ala Gln Asn Val Gln Glu Ala Leu5                  180                 185                 190
    Glu Leu Arg Asp Ile Glu Leu Gly Ala Gln Asp Arg Ile Asn Val Pro
            195                 200                 20510      Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asn Asn Ala Ala Ile Gln Ile Asp Arg Val
        210                 215                 220
    Asp Asn Thr Glu Ile Thr Glu Thr Val Ser Phe Asp Ala Glu Pro Thr
    225                 230                 235                 24015
    Tyr Val Asp Asp Pro Glu Ala Pro Ala Gly Asp Glu Thr Val Val Glu
                    245                 250                 255
    Glu Gly Ala Pro Gly Thr Lys Glu Val Thr Arg Thr Val Thr Thr Val20                  260                 265                 270
    Asn Gly Gln Glu Glu Ser Ser Thr Val Ile Asn Glu Val Glu Ile Thr
            275                 280                 28525      Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ile Ser Arg Gly Thr Lys Thr Val Ala Ala
        290                 295                 300
    Asn Ser Val Trp Asp Gln Leu Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp
    305                 310                 315                 32030
    Ala Ile Asn Thr Gly Asn Gly Phe Ser Gly Gly Leu Gln Phe His Pro
                    325                 330                 335
    Gln Thr Trp Leu Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Asp Ala Ser35                  340                 345                 350
    Gly Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ala Glu Lys Val Gln Ala
            355                 360                 36540      Ala Gln Gly Trp Gly Ala Trp Pro Ala Cys Thr Ala Ser Leu Gly Ile
        370                 375                 380
    Arg
    38545<210>3<211>629<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<400>3ggaacttggt gaccaggaca ttgtttcccc ttcactggat tcatccatca gtgatgaaga 60cactgtgact gttcgtactg ccaagcaggt ggcgctcgtg gtggaaggtc aaatccaaaa 120cgtgaccacc actgcggttt ccgtggagga cctcctgcag gaagtcggtg gcattaccgg 180tgctgatgcg gtggacgctg atctttcaga gaccatccca gaatctggtt tgaaggtgag 240tgttaccaag ccgaagatta tttccatcaa tgatggtggc aaggtcactt acgtttcttt 300ggcagctcag aacgtacagg aagccctaga gctgcgggat attgagctgg gtgctcagga 360ccgcattaat gtgcctctgg atcagcagct gaagaacaac gctgcgatcc agatcgaccg 420cgttgacaac accgaaatca ctgaaactgt gtctttcgat gctgagccaa cctacgtgga 480tgatccagaa gctccagctg gcgatgaaac tgtggtcgaa gaaggcgctc ctggaaccaa 540ggaagttact cgcaccgtaa caaccgttaa tggtcaggaa gaatcttcca cggtgatcaa 600tgaagttgaa atcaccgcag caaagccag                                   629
本发明具有如下附图：图1：质粒pCR2.1zwa2int图谱。长度数值应理解是大约值。所用缩写和名称含义如下：ColEl ori：质粒ColE1的复制起点lacZ:β-半乳糖苷酶基因的5′末端fl ori：噬菌体f1的复制起点KanR：卡那霉素抗性ApR：氨苄青霉素抗性EcoRⅠ：限制酶EcoRⅠ的切割位点zwa2:zwa2基因的内部片段

Claims (18)

1、分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸；
b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
2、如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸是能在棒杆细菌中复制的优选重组的DNA。
3、如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4、如权利要求2所述的多核苷酸，含有SEQ ID NO:1的核酸序列。
5、如权利要求2所述的能复制的DNA，含有
(ⅰ)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
6、一种载体，尤其是整合载体pCR2.1zwa2int，特征在于具有图1所示限制图谱，并以保藏号DSM 13113保藏在大肠杆菌Top10F’中。
7、用权利要求6的载体通过整合诱变获得的棒状细菌。
8、制备L-氨基酸尤其L-赖氨酸的方法，特征在于进行以下步骤：
a)发酵产生L-氨基酸的细菌，该细菌中至少zwa2基因是弱化的，
b)富集培养基或细菌细胞中的所需产物，并
c)分离L-氨基酸。
9、如权利要求8所述的方法，特征在于所用细菌中所需的L-氨基酸的生物合成途径的其它基因，尤其zwa1基因是增强的。
10、如权利要求8所述的方法，特征在于所用细菌中，降低所需L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分关闭。
11、如权利要求8所述的方法，特征在于编码zwa2基因的多核苷酸的表达被降低。
12、如权利要求8的方法，特征在于多核苷酸zwa2编码的多肽(酶蛋白)的催化性质被降低。
13、如权利要求8的方法，特征在于使用如图1所示并以保藏号DSM 13113保藏于E.coli中的载体pCR2.1zwa2int经整合诱变的方法产生弱化。
14、如权利要求8所述的方法，特征在于为产生L-赖氨酸，发酵如下的细菌，该细菌中选自以下一组的一或多个基因是同时增强的，尤其是过表达或扩增的：
14.1编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
14.2编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，
14.3编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
14.4编码四-二氢2,6-吡啶二羧酸琥珀酰化酶的dapD基因，
14.5编码琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶的dapE基因，
14.6编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
14.7编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因，
14.8编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因。
15、如权利要求8所述的方法，特征在于为生产L-赖氨酸，发酵如下细菌，该细菌中选自以下一组的一或多个基因是同时弱化的：
15.1编码磷酸丙酮酸羧化酶的pck基因，
15.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因。
16、前述任一项权利要求的方法，特征在于使用谷氨酸棒杆菌的微生物。
17、权利要求1的多核苷酸序列或其部分作为杂交探针以分离编码Zwa2基因产物的cDNA的用途。
18、权利要求1的多核苷酸序列或其部分作为杂交探针以分离与zwa2基因具有高度序列相似性的cDNA或基因的用途。
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