KR20010062279A - ｚｗａ2 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은

a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상이 동일한 폴리뉴클레오타이드;

b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드; 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 신규한 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 zwa2 유전자가 감쇠된 코리네형 세균이 사용되는, L-라이신의 발효적 생산방법을 제공한다.

Description

ｚｗａ2 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열{Novel nucleotide sequences coding for the zwa2 gene}

본 발명은 zwa2 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 zwa2 유전자가 감쇠된 코리네형 세균을 사용하여 아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

아미노산, 특히 L-라이신은 인간 의학 및 약학 산업, 특히 동물 사료 분야에서 사용되고 있다.

이러한 아미노산은 코리네형 세균 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 생산될 수 있다. 이러한 공정은 상당히 중요하기 때문에, 제조 공정 개선과 연관된 연구가 항상 진행중이다. 공정을 개선시키는 것은, 발효 기술 수단(예: 교반 및 산소 공급), 또는 영양배지의 조성(예: 발효 동안의 당 농도) 또는 완전한 산물로의 후처리(예: 이온 교환 크로마토그래피) 또는 미생물 자체의 고유 수행 특성과 관련될 수 있다.

이러한 미생물의 수행 특성을 개선시키기 위해, 돌연변이유발, 선별법 및 돌연변이체 선별법을 적용한다. 상기한 방법으로, 항대사물(예: 라이신 유사체 S-(2-아미노에틸)-시스테인)에 내성이 있거나, 조절에 중요한 대사물에 대해 영양요구성이고 L-아미노산을 생산하는 균주를 수득한다.

몇년 동안, 재조합 DNA 기술법이 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개선시키는데 또한 사용되어 왔다.

본 발명은 아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 개선된 방법을 위한 신규한 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 플라스미드 pCR2.1zwa2int의 지도이다.

L-아미노산, 특히 L-라이신은 인간 의학 및 약학 산업, 특히 동물 사료 산업에 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 L-라이신을 생산하기 위한 신규하고 개선된 방법을 제공하는데 일반적으로 관심이 있어왔다.

하기에서 L-라이신 또는 라이신은 이의 염기뿐만 아니라, 예를 들어 라이신 일염산염 또는 라이신 황산염과 같은 이의 염을 또한 의미한다.

본 발명은

a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상이 동일한 폴리뉴클레오타이드;

b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드; 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한

(i) zwa2 유전자를 암호화하는, 서열 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열;

(ii) 유전자 코드의 축퇴성 범위내에서 서열(i)과 상응하는 하나 이상의 서열; 또는

(iii) 서열(i) 또는 (ii)와 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열; 및 임의로

(iv) 서열(i)내에 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 포함하는, 바람직하게는 복제가능한 DNA인, 특허청구범위 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 특허청구범위 제4항에 따르는 폴리뉴클레오타이드; 특허청구범위 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 특히 이. 콜라이 DSM 13113으로 기탁된 pCR2.1zwa2int; 및 특허청구범위 제6항에 따르는 벡터를 사용하여 통합 돌연변이유발시켜 수득된, 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 세균을 제공한다.

본 발명은 또한 상기한 서열 1에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 프로브를 사용하여, 서열 1에 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부를 갖는 완전한 유전자를 포함하는 상응하는 유전자 라이브러리를 하이브리드화시켜 선별하고 상기한 DNA 서열을 분리시킴으로써 수득할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열로 실질적으로 구성된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은 zwa2 유전자 산물을 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 분리하고 zwa2 유전자의 서열과 매우 유사한 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한 RNA, cDNA 및 DNA용 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 zwa2 유전자를 암호화하는 유전자로부터 DNA를 제조할 수 있는 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 사용할 수 있는 상기한 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드를 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 특히 매우 바람직하게는 15개 이상을 연속적으로 포함한다. 40 내지 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드도 또한 적합하다.

"분리된"은 이의 천연 환경으로부터 분리된 것을 의미한다.

"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드에 관한 것이다.

"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산을 2개 이상 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

본 발명에 따르는 폴리펩타이드는 서열 2에 따르는 폴리펩타이드, 특히 zwa2 유전자의 유전자 산물의 생물학적 활성을 가지며 또한 서열 2에 따르는 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상이 동일한 폴리펩타이드, 특별하게는 서열 2에 따르는 폴리펩타이드와 90 내지 95% 이상이 동일하고 상기한 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명은, 특히 이미 아미노산을 생산하고 있으며 zwa2 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 감쇠되고 특히 저수준으로 발현되는 코리네형 세균을 사용하여 아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 제공되는 미생물은 글루코스, 사카로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-라이신을 생산할 수 있다. 미생물에는 대표적으로 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속이 포함될 수 있다. 코리네박테리움 속중에서도, 특별히 L-아미노산을 생산하는 능력이 탁월한 종으로 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 종을 언급할 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종중에서 적합한 균주로는, 예를 들어 다음의 공지된 야생형 균주:

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032;

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806;

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870;

코리네박테리움 멜라세콜로라(Corynebacterium melassecoloa) ATCC17965;

코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539;

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067;

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및 이로부터 제조된 L-라이신 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709;

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712;

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463;

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715이다.

본 발명에 이르러, 씨. 글루타미쿰으로부터 zwa2 유전자 산물을 암호화하는 신규한 zwa2 유전자를 분리해내는데 성공하였다.

씨. 글루타미쿰으로부터 zwa2 유전자 또는 다른 유전자를 분리하기 위해, 상기한 미생물의 유전자 라이브러리를 먼저 이. 콜라이중에 수집한다. 유전자 라이브러리의 수집은 공지된 일반적인 문헌 및 매뉴얼에 기술되어 있다. 예를 들어 다음의 문헌[참조 문헌: Winnacker, Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie; Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 삼브룩 등(Sambrook et al.)의 매뉴얼[참조 문헌: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 언급할 수 있다. 익히 공지된 유전자 라이브러리로는 코하라 등[참조 문헌: Kohara et al., Cell 50, 495-508 (1987)]에 의해 λ-벡터중에 수집된, 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 라이브러리가 있다. 바테 등[참조 문헌: Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996]은 코스미드 벡터 SuperCos I[참조 문헌: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164]을 사용하여 이. 콜라이 K-12 균주 MN554[참조 문헌: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]중에 수집한 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리를 기술하고 있다. 뵈르만 등[참조 문헌: Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326, 1992]은 또한 코스미드 pHC79[참조 문헌: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]를 사용한 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리를 기술하고 있다. 이. 콜라이중에서 씨. 글루타미쿰 유전자 라이브러리를 제조하기 위해서는, pBR322[참조 문헌: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC9[참조 문헌: Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268]와 같은 플라스미드를 또한 사용할 수 있다. 숙주로서 특히 적합한 이.콜라이 균주는 제한부위 및 재조합 결점이 있는 이. 콜라이 균주이다. 이러한 균주의 한가지 예로는 그랜트 등[참조 문헌: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]에 의해 기술된 바 있는 균주 DH5αmcr이 있다. 코스미드의 도움으로 클로닝된 긴 DNA 단편은 서열화하기에 적합한 일반적으로 사용되는 벡터에서 서브클로닝한 다음, 예를 들어 생거 등[참조 문헌: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977]에 의해 기술된 바와 같이 서열화할 수 있다.

zwa2 유전자를 암호화하는 신규한 DNA 서열은 이러한 방식으로 수득하며, 이는 서열 1로서 본 발명을 구성한다. 또한 상응하는 유전자 산물중 zwa2 유전자의 아미노산 서열은 이용가능한 DNA 서열로부터 유추한다. 수득되는 zwa2 유전자 산물의 아미노산 서열은 서열 2로 나타낸다.

유전자 코드의 축퇴성으로 유발되는, 서열 1로부터 생성되는 암호화 DNA 서열이 또한 본 발명을 구성한다. 동일한 방식으로, 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열이 또한 본 발명을 구성한다. 최종적으로 서열 1로부터 제조된 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성된 DNA 서열도 또한 본 발명을 구성한다.

당해 분야의 숙련가는 특히 매뉴얼("DIG System Users Guide for Filter Hybridization"; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993) 및 문헌[참조 문헌: Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에서 하이브리드화에 의해 DNA 서열을 확인하기 위한 설명서를찾을 수 있을 것이다. 당해 분야의 숙련가는 특히 게이트(Gait)의 매뉴얼(Oligonucleotide synthesis: a practical approach; IRL Press, Oxford, UK, 1984) 및 뉴튼과 그래함(Newton & Graham)의 문헌[참조 문헌: Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994]에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 DNA 서열을 증폭시키기 위한 설명서를 찾을 수 있을 것이다.

본 발명자들은 zwa2 유전자를 감쇠시킨 후에 코리네형 세균이 아미노산, 특히 L-라이신을 개선된 방법으로 생산한다는 것을 밝혀내었다.

감쇠를 수득하기 위해, zwa2 유전자 발현 또는 효소 단백질의 촉매성을 감소시키거나 전환시킬 수 있다. 임의로 두가지 수단을 합할 수 있다.

유전자 발현은 적절한 배양물 처리나 유전자 발현용 시그날 구조의 유전적 변형(돌연변이)에 의해 감소시킬 수 있다. 유전자 발현용 시그날 구조로는, 예를 들어 리프레서(repressor) 유전자, 액티베이터(activator) 유전자, 오퍼레이터(operator), 프로모터(promoter), 어태뉴에이터(attenuator), 리보솜 결합 부위, 개시 코돈 및 터미네이터(terminator)가 있다. 상기한 것들에 대한 정보는 당해 분야의 숙련가라면, 예를 들어 다음 문헌[참조 문헌: 제WO 96/15246호; Boyd and Murphy, Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988); Voskuil and Chambliss, Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998); Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998); Patek et al., Microbiology 142: 1297 (1996)] 및 공지된 유전학과 분자생물학 분야의 문헌[참조 문헌: Knippers, "Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart,Germany, 1995; Winnacker, "Gnen und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990]에서 찾을 수 있을 것이다.

효소 단백질의 촉매성을 변화시키거나 감소시키는 돌연변이는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 다음을 언급할 수 있다[참조 문헌: Qiu and Goodman, Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997); Sugimoto et al., Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997); Mockel, "Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Reports from the Julich Research Centre, Jul-2906, ISSN 09442952, Julich, Germany, 1994]. 예를 들어, 하게만[참조 문헌: Hagemann, "Allegemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986]의 문헌과 같은 유전학 및 분자생물학 분야의 교과서에서 간단한 설명을 찾아볼 수 있다.

전위, 역위, 삽입 및 결실이 돌연변이로서 고려된다. 효소 활성에 대한 아미노산 교환 효과에 따라 미스-센스 돌연변이 또는 넌-센스 돌연변이가 고려된다. 유전자중에 하나 이상의 염기쌍이 삽입 또는 결실되는 것은, 잘못된 아미노산이 혼입되거나 해독이 미성숙하게 종결된 결과로서 프레임이동 돌연변이를 유발시킨다. 몇몇 코돈의 결실은 통상 효소 활성을 완전하게 손실시킨다. 이러한 유형의 돌연변이를 생성하기 위한 지시사항은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 유전학 및 분자생물학 교과서에서 찾아볼 수 있다[참조 문헌: Knippers, "Molekulare Genetik". 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany 1995;Winnacker, "Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990; Hagemann, "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986].

zwa2 유전자의 삽입 돌연변이유발을 수행할 수 있는 플라스미드의 한가지 예가 pCR2.1zwa2int(도 1)이다.

플라스미드 pCR2.1zwa2int는 서열 3에 나타낸 zwa2 유전자의 내부 단편이 혼입되어 있는, 미드 등[참조 문헌: Mead et al., Bio/Technology 9:657-663(1991)]이 기술한 플라스미드 pCR2.1-TOPO로 구성된다. 이 플라스미드는 형질전환되고 염색체성 zwa2 유전자중에서 상동성 재조합을 수행한 후(삽입), 이의 전체 기능이 손실된다. 예를 들어, zwa2 유전자가 기능하지 않는 균주 DSM5715::pCR2.1zwa2int를 이러한 방식으로 제조한다. 삽입 돌연변이유발에 관한 추가 지시사항 및 설명은, 예를 들어 다음 문헌에서 찾을 수 있다[참조 문헌: Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Fitzpatrik et al., Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)].

또한, zwa2 유전자 감쇠뿐만 아니라 관련 생합성 경로, 해당 과정, 보충 대사경로, 시트르산 사이클 또는 아미노산 수송 경로중의 하나 이상의 효소를 촉진시키고, 특히 과발현시키는 것이 L-아미노산, 특히 L-라이신 생산에 또한 유리할 수 있다.

따라서 예를 들어, L-라이신의 생산을 위해 하기의 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 촉진시키고, 특히 과발현시키거나증폭시킬 수 있다:

·디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(참조 문헌: EP-B 0 197 335);

·테트라디하이드로디피콜리네이트 석시닐라제를 암호화하는 dapD 유전자[참조 문헌: Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)];

·피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자;

·석시닐디아미노피멜레이트 데석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자[참조 문헌: Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)];

·글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086];

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조 문헌: DE-A-198 31 609];

·말레이트/퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조 문헌: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1988)];

·라이신 수송자를 암호화하는 lysE 유전자[참조 문헌: DE-A-195 48 222].

추가로 아미노산, 특히 L-라이신을 생산하기 위해, zwa2 유전자 외에, 하기의 유전자를 동시에 감쇠시키는 것이 유리할 수 있다:

·포스페이트 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 유전자[참조 문헌: DE 199 50 409.1, DSM 13047] 및/또는

·글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[참조 문헌:US 09/396,478, DSM 12969].

또한 아미노산, 특히 L-라이신을 생산하기 위해 zwa2 유전자를 감쇠시키는 것 이외에, 원치않는 2차 반응을 억제하는 것이 또한 유리할 수 있다[참조 문헌: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

특허청구범위 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 미생물이 또한 본 발명에 의해 제공되며, 이는 아미노산, 특히 L-라이신을 생산할 목적으로, 뱃치공정중 연속적으로 또는 뱃치식으로 배양하거나 또는 유가식(fed batch) 방법 또는 반복적인 유가식 방법을 사용하여 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 문헌[참조 문헌: Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용될 배양 배지는 특정 균주의 요구성을 적절한 방식으로 충족시켜야만 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 설명은 매뉴얼["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981]에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 슈가 및 탄수화물(예: 글루코스, 사카로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스), 오일 및 지방(예: 콩기름, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 버터), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산)이 있다. 이들 물질은 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두 가루 및 우레아) 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 있다. 질소원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원으로는 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 나트륨을 포함하는 상응하는 염이 있다. 배양 배지는 증식을 위해 필수적인 금속 염, 예를 들어, 황산마그네슘 및 황화철을 추가로 포함한다. 최종적으로, 상기 언급된 물질외에 필수 성장 물질, 예를 들어, 아미노산 및 비타민이 사용될 수 있다. 더욱이 적합한 전구체를 배양 배지에 부가할 수 있다. 언급된 공급 물질은 단일 혼합물의 형태로 배양물에 부가하거나 배양 동안에 적절한 방식으로 서서히 공급할 수 있다.

배양물의 pH를 조절하기 위해, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절한 방식으로 사용한다. 발포체 생성을 조절하기 위해, 소포제, 예를 들어, 지방산의 폴리글리콜 에스테르를 사용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 적합한 선별 물질, 예를 들어 항생제를 배지에 부가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해, 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물(예: 공기)을 배양물에 통과시킨다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이고 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 라이신 농도가 최대로 생성될 때까지 배양물을 계속 배양한다. 이러한 목표는 일반적으로 10시간 내지 160시간내에 달성된다.

L-아미노산 측정방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 분석은 문헌[참조 문헌: Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화를 사용하여 수행할 수 있거나, 또다른 문헌[참조 문헌: Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 기술되어 있는 바와 같이 역상 HPLC를 사용할 수 있다.

돌연변이유발용으로 적합한 통합 벡터는 부다페스트 조약에 따라 도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ, Braunschweig, Germany)에 이. 콜라이에 포함시켜 기탁하였다: DSM 13113으로서 에스케리키아 콜라이 균주 TOP10F'/pCR2.1zwa2int.

zwa2 유전자를 감쇠시키는것 외에, zwa1 유전자 또는 관련된 Zwa1 유전자 산물에 대한 효과를 향상시키는 것이 유리할 수 있다. 상응하는 유전자 및 관련 방법은 본 특허원과 함께 출원된 독일 특허원 제199 59 328.0호에서 찾을 수 있다.

돌연변이유발용으로 적합한 통합 벡터 pCR2.1zwa1exp는 이. 콜라이 DH5α에 포함시켜 DSM 13115로서 기탁하였다.

실시예

본 발명은 실시예를 사용하여 하기에서 보다 상세하게 설명된다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 게놈 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 염색체 DNA를 문헌[참조 문헌: Tauch et al.(1995, Plasmid 33:168-179)]에 기술된 바와 같이 분리하고, 제한효소 Sau3AI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany; product description Sau3AI, Code no. 27-0913-02]로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 작은 새우 알칼리 포스파타제[Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany; product description SAP, Code no. 1758250]로 탈인산화시킨다. 스트라타진 캄파니(Stratagene Co, La Jolla, USA, product description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code no. 251301)로부터 구입한 코스미드 벡터 SuperCos1의 DNA[참조 문헌: Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Science USA 84:2160-2164]를 제한효소 XbaI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany; product description XbaI, Code no. 27-0948-02]로 절단하고, 마찬가지로 작은 새우 알칼리 포스파타제로 탈인산화시킨다. 이어서 코스미드 DNA를 제한효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description BamHI, Code no. 27-0868-04)로 절단한다. 상기 방법으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC13032 DNA와 혼합하고, 배치를 T4 DNA 리가제[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description T4 DNA Ligase, Code no, 27-0870-04]로 처리한다. 이어서 연결 혼합물은 기가팩 II XL 패킹 추출물[Stratagene, La Jolla, USA, product description Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217]을 사용하여 파아지에 패킹시킨다. 이. 콜라이균주 NM554[참조 문헌: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575]를 감염시키기 위해, 세포를 10mM MgSO₄에 넣고 파이지 현탁액의 분취량과 혼합한다. 코스미드 라이브러리의 감염 및 표준화는 문헌[참조 문헌: Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기술된 바와 같이 수행하는데, 이때 세포는 100㎍/ml의 앰피실린을 함유한 LB 한천상에 플레이팅한다[참조 문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190]. 37℃에서 밤새 배양한 후, 개별적인 재조합 클론을 선별한다.

실시예 2

zwa2 유전자의 분리 및 서열화

개별적인 콜로니의 코스미드 DNA는 제조업자의 데이타에 따라 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiaprep Spin Miniprep Kit)[Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany]를 사용하여 분리하고, 제한효소 Sau3AI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany; product description Sau3AI, Product No. 27-0913-02]로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 작은 새우 알칼리 포스파타제[Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany; product description SAP, Product No. 1758250]로 탈인산화시킨다. 겔 전기영동으로 분리시킨 후, 1500 내지 2000bp 크기의 코스미드 단편을 QiaExII 겔 추출 키트[Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany]를 사용하여 분리한다. 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Co., Groningen, the Netherlands,product description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01]로부터 구입한 서열화 벡터 pZero-1의 DNA를 제한효소 BamHI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany; product description BamHI, Product No. 27-0868-04]으로 절단한다. 문헌[참조 문헌: Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기술되어 있는 방법을 사용하여 DNA 혼합물을 T4 리가제[Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany]와 함께 밤새 항온처리하여 코스미드 단편을 서열화 벡터 pZero-1에 연결시킨다. 이어서 상기 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[참조 문헌: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649)내로 전기천공[참조 문헌: Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7]시키고, 50㎍/ml 제오신을 함유한 LB 한천[참조 문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190]상에 플레이팅한다. 재조합 클론의 플라스미드를 바이오로봇 9600[Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany]을 사용하여 작제한다. 짐머만 등의 방법[참조: Zimmermann et al., 1990, Nucleic Acids Research, 18:1067]에 따라 변형된 생거 등(Sanger et al.)의 디데옥시 쇄 종결 방법[참조 문헌: 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74:5463-5467]을 사용하여 서열화한다. PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems)로부터 구입한 "RR d로다민 종결 사이클 서열화 키트(RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit)(Product No. 403044, Weiterstadt, Germany)를 사용한다. 겔 전기영동으로 분리하고, 서열화 반응을 "로티포레시스(Rotiphorese) NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드 겔"(29:1)[ProductNo. A124.1. Roth, Karlsruhe, Germany]중에서 PE 어플라이드 바이오시스템즈(Weiterstadt, Germany)로부터 구입한 "ABI 프리즘 377" 서열기를 사용하여 분석한다.

미처리된 수득한 서열 데이터를 스타덴 소프트웨어 패키지(Staden software package, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) 버젼 97-0을 사용하여 처리한다. pZero 1 유도체의 각각의 서열을 연속된 배열로 어셈블리한다. 컴퓨터-보조된 암호화 영역 분석은 XNIP 프로그램(Staden, 1986, Nucleic Acids Rearch, 14:217-231]을 사용하여 수행한다. 기관[National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 풍부하지 못한 데이터 뱅크에 대해, "블래스트 서치 프로그램"(BLAST search program)[참조 문헌: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402]을 사용하여 상동성 분석을 수행한다.

zwa2 유전자에 대해 수득된 뉴클레오타이드 서열은 서열 1에 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열의 분석은 zwa2 유전자로서 지정된 1740개 염기쌍의 개방 판독 프레임을 생성한다. zwa2 유전자는, 서열 2에 나타낸 385개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 암호화한다.

실시예 3

zwa2 유전자의 삽입 돌연변이유발용 통합 벡터의 제조

균주 ATCC 13032의 염색체 DNA는 에이크만[참조 문헌: Eikmanns et al.,Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]의 방법에 의해 분리시킨다. 실시예 2에서 씨. 글루타미쿰에 대해 기재한 zwa2 유전자의 서열을 기본으로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응용으로 하기의 올리고뉴클레오타이드를 선택한다:

zwa2-in1: 5' GGA ACT TGG TGA CCA GGA CA 3'

zwa2-in2: 5' CTG GCT TTG CTG CGG TGA TT 3'

상기한 프라이머는 MMG 바이오텍 캄파니(MMG Biotech Co., Ebersberg, Germany)에서 합성하고, 인니스 등의 표준 PCR 방법[참조 문헌: Innis et al., PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]에 따라 Pwo 폴리머라제(Boehringer Co.)를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. 폴리머라제 연쇄 반응의 도움으로, zwa2 유전자의 내부 단편을 함유하는, 서열 3에 나타낸 바와 같이 크기가 대략 0.6kb인 DNA 단편을 분리한다.

증폭시킨 DNA 단편은 인비트로젠 코포레이션의 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA, USA; 카달로그 번호 K4500-01)를 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO[참조 문헌: Mead et al., 1991, Bio/Technology 9:657-663]와 연결시킨다. 이. 콜라이 균주 Top10F'를 연결 혼합물과 함께 전기천공시킨다[참조 문헌: Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol.I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]. 플라스미드 함유 세포는 형질전환 배치를 카나마이신 25㎎/ℓ가 보충된 LB 한천상에 플레이팅하여 선별한다[참조 문헌:Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. 플라스미드 DNA는 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit; Qiagen Co.)를 사용하여 형질전환체로부터 분리시키고, 제한효소 EcoRI을 사용하여 절단한 다음, 아가로스 겔(0.8%)상에서 전기영동시켜 확인한다. 이 플라스미드는 pCR2.1zwa2int로 명명한다.

실시예 4

라이신 생산자 DSM 5715중 zwa2 유전자의 통합 돌연변이유발

실시예 2에서 pCR2.1zwa2int로 명명된 벡터는 타우치 등[참조 문헌: Tauch et al., FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)]의 천기천공법을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715내로 전기천공시킨다. 균주 DSM 5715는 AEC 내성 라이신 생산자이다. 벡터 pCR2.1zwa2int는 DSM 5715중에서 자발적으로 복제될 수 없으며, DSM 5715의 염색체내로 통합되는 경우에만 세포에서 유지될 수 있다. 염색체내로 통합된 pCR2.1zwa2int를 갖는 클론은 15㎎/ℓ의 카나마이신이 보충된 LB 한천상에 전기천공 배치를 플레이팅하여 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989]. 통합을 확인하기 위해, Pwo 폴리머라제(Boehringer Co.)를 사용하는 인니스 등의 표준 방법[참조 문헌: Inniset al., PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]에 따라 대조 PCR 반응을 수행한다. 프라이머 zwa1-in1 및 zwa2-in2(실시예 3)와, 벡터 pCR2.1zwa2int의 서열내에서만 결합할 수 있는 전방향 범용 프라이머 M13(5'-gttttcccagtcacgac-3'; Invitrogen Corporation, 카달로그 번호 N540-02) 및 역방향 범용 M13(5'-caggaaacagctatgac-3'; Invitrogen Corporation, 카달로그 번호 N530-02)를 함께 사용함으로써, 라이신 생산자 DSM 5715의 염색체중 염색체성 zwa2 유전자내에 플라스미드 pCR2.1zwa2int가 삽입되어 있음을 알 수 있다. 이 균주는 DSM5715::pCR2.1zwa2int로 명명한다.

실시예 5

라이신 생산

실시예 3에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715::pCR2.1zwa2int는 라이신을 생산하기에 적합한 영양 배지에서 배양하고 배양 상층액의 라이신 농도를 측정한다.

이를 위해, 균주는 상응하는 항생제(카나마이신(25㎎/ℓ)이 있는 뇌/심장 한천)를 갖는 한천 플레이트상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 상기 한천 플레이트 배양으로부터 개시하여, 예비배양물을 접종한다(100㎖들이 원뿔형 플라스크중 배지 10㎖). 상기 예비배양용 배지로서 완전 배지 CgIII를 사용한다. 카나마이신(25㎎/ℓ)을 상기 배지에 가한다. 예비배양물은 240rpm의 진탕기상에서 33℃에서 48시간 동안 배양한다. 주 배양물은 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 상기 예비배양물을 사용하여 접종한다. 주 배양물용 배지로는 배지 MM을 사용한다.

배지 MM

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS 20g/ℓ

글루코스(개별적으로 오토클레이브함) 50g/ℓ

염:

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄*7H₂0 1.0g/ℓ

CaCl₂*2H₂O 10㎎/ℓ

FeSO₄*7H₂O 10㎎/ℓ

MnSO₄*H₂O 5.0㎎/ℓ

바이오틴(멸균-여과시킴) 0.3㎎/ℓ

티아민*HCl(멸균-여과시킴) 0.2㎎/ℓ

류신(멸균-여과시킴) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL, MOPS 및 염용액을 암모니아수를 사용하여 pH를 7로 조절하고 오토클레이브시킨다. 이어서 무수-오토클레이브시킨 CaCO₃와 함께 멸균 기질 및 비타민 용액을 가한다.

배플을 사용하여 100㎖들이 원뿔형 플라스크중 10㎖ 용적으로 배양을 실시한다. 카나마이신(25㎎/ℓ)을 가한다. 배양은 33℃ 및 80%의 대기 습도하에 수행한다.

48시간 후, 바이오멕(Biomek) 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 660nm의 측정 파장에서 OD를 측정한다. 생성된 라이신의 양은 이온 교환 크로마토그래피와 닌하이드린 검출법을 사용하는 칼럼후 유도체화에 의해, 에펜도르프-바이오트로닉(Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)의 아미노산 분석기를 사용하여 측정한다.

시험 결과는 표 1에 나타내었다.

균주	OD(660)	라이신 HCl(g/ℓ)
DSM5715::pCR2.1zwa2int	12.7	12.29
DSM5715	13.1	9.54

도면에서 길이에 관한 데이타는 대략적인 값으로 이해한다.

도면 및 명세서에서의 약어 및 명칭은 다음과 같은 의미를 갖는다.

ColE1 ori: 플라스미드 ColE1의 복제 오리진

lacZ: β-갈락토시다제 유전자의 5' 말단

f1 ori: 파아지 f1의 복제 오리진

KanR: 카나마이신 내성

ApR: 암피실린 내성

EcoRI: 제한효소 EcoRI의 절단 부위

zwa2: zwa2 유전자의 내부 단편

본 발명의 zwa2 유전자가 감쇠된 코리네형 세균을 사용하면 발효에 의해 L-아미노산, 특히 L-라이신을 보다 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (18)

1. a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상이 동일한 폴리뉴클레오타이드;

   b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

   c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드; 및

   d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
2. 제1항에 있어서, 코리네형 세균에서 복제될 수 있는, 바람직하게는 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
3. 제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
4. 제2항에 있어서, 서열 1에 나타낸 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
5. 제2항에 있어서,

   (i) 서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는

   (ii) 유전자 코드의 축퇴성 범위내에서 서열(i)과 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

   (iii) 서열(i) 또는 (ii)와 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및 임의로

   (iv) 서열(i)내에 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 포함하는, 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
6. 도 1의 제한효소 지도로 특성화되고 이. 콜라이 DH5α에 포함되어 DSM13113으로 기탁된, 특히 셔틀 벡터 pCR2.1zwa2int인 벡터.
7. 제6항에 따른 벡터를 사용하여 통합 돌연변이유발시킴으로써 수득된 코리네형 세균.
8. a) 적어도 zwa2 유전자가 감쇠된, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 세균을 발효시키는 단계;

   b) 배지내에 또는 세균 세포내에 목적하는 산물을 축적시키는 단계; 및

   c) L-아미노산을 분리시키는 단계를 수행하는, L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로중의 추가로 다른 유전자, 특히 zwa1 유전자가 향상된 세균을 사용하는 방법.
10. 제8항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 억제된 세균을 사용하는 방법.
11. 제8항에 있어서, zwa2 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 발현이 감소되는 방법.
12. 제8항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 zwa2를 암호화하는 폴리펩타이드(효소 단백질)의 촉매성이 감소되는 방법.
13. 제8항에 있어서, 감쇠를 수득하기 위해, 도 1에 나타내었고 이. 콜라이에 포함되어 DSM13113으로 기탁된 벡터 pCR2.1zwa2int를 사용하는 통합 돌연변이유발이 사용되는 방법.
14. 제8항에 있어서, L-라이신을 생산하기 위해,

    14.1 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

    14.2 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

    14.3 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

    14.4 테트라디하이드로디피콜리네이트 석시닐라제를 암호화하는 dapD 유전자,

    14.5 석시닐디아미노피멜레이트 데석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자,

    14.6 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

    14.7 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자 및

    14.8 라이신 수송자를 암호화하는 lysE 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 동시에 향상되고, 특히 과발현되거나 증폭된 세균을 발효시키는 방법.
15. 제8항에 있어서, L-라이신을 생산하기 위해,

    15.1 포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자 및

    15.2 글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠된 세균을 발효시키는 방법.
16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 속의 미생물이 사용되는 방법.
17. zwa2 유전자 산물을 암호화하는 cDNA를 분리시키기 위한 하이브리드화 프로브로서의, 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 용도.
18. zwa2 유전자 서열과 유사성이 높은 cDNA 또는 유전자를 분리시키기 위한 하이브리드화 프로브로서의, 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 용도.