JP2019519241A - グルコース透過酵素ライブラリーを生成するための方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年6月30日に出願された米国仮出願第62/356,924号の優先権の利益を主張し、その全体が、すべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表に関する陳述
分野
しかし、特定の商業的産物を産生するための所与の代謝プロセスのためのグルコース輸送の理想的なレベルを作り出すための具体的なグルコース透過酵素の選択は、株の遺伝子型と発酵が行われるプロセス環境との相互作用を含むいくつかの相互作用因子の十分な理解に依拠する。さらに、グルコース濃度および他の炭素源濃度との組合せでの正確な発現、親和性および輸送速度は、目的の経路を通じたフラックスに合致するよう細胞にグルコースの均衡のとれたフラックスを送達するために必要であり得る。これらのパラメータを経験的に理解すること、次いでそれらを具体化する単一の透過酵素を選択することは、困難であるまたは不可能である場合がある。
よって、従来の株改善プログラムに固有の上述した欠点を被らない、特定の商業的産物を産生するための工業用微生物を操作する新しい方法についての当技術分野における大きな必要性が存在する。
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
概要
プロモーター
グルコース透過酵素
ヘキソキナーゼ
グルコース透過酵素遺伝子および/またはヘキソキナーゼ遺伝子の変異形態の生成
グルコース透過酵素遺伝子および/またはヘキソキナーゼ遺伝子を含むライブラリーの生成
プラスミドのアセンブリング/クローニング
宿主細胞の形質転換
選択された配列のループアウト
宿主微生物
細胞発酵および培養
産物回収および定量
選択判定基準および目標
(実施例1)
グルコース透過酵素およびグルコキナーゼライブラリーを用いるCorynebacteriumの形質転換
グルコース透過酵素ライブラリーの生成
E.coli中へのアセンブルされたクローンの形質転換
Corynebacterium中へのアセンブルされたクローンの形質転換
Corynebacterium中の個々のグルコース透過酵素−グルコキナーゼ(Glukokinase)構築物の評価
発酵条件下での個々のグルコース−透過酵素−グルコキナーゼ構築物の評定
参照による組込み
Claims (66)
- 第1のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結した異種グルコース透過酵素遺伝子を含む宿主細胞であって、該第1のプロモーターポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から選択されるヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
- 前記グルコース透過酵素遺伝子が、細菌グルコース透過酵素遺伝子である、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記細菌グルコース透過酵素遺伝子が、配列番号13、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号9および配列番号14から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項2に記載の宿主細胞。
- 前記細菌グルコース透過酵素遺伝子が、配列番号23、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号19および配列番号24から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である、請求項2に記載の宿主細胞。
- 第2のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結したヘキソキナーゼ遺伝子をさらに含み、該第2のプロモーターポリヌクレオチドが、配列番号2、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記ヘキソキナーゼ遺伝子が、グルコキナーゼ遺伝子である、請求項5に記載の宿主細胞。
- 前記グルコキナーゼ遺伝子が、細菌グルコキナーゼ遺伝子である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 前記細菌グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号15および配列番号16から選択されるポリペプチド配列をコードする遺伝子である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記細菌グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号25および配列番号26から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記第1のプロモーターポリヌクレオチドと前記第2のプロモーターポリヌクレオチドとが異なっている、請求項5から9のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記第1のプロモーターポリヌクレオチドと前記第2のプロモーターポリヌクレオチドとが同一である、請求項5から9のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- Corynebacterium属に属する、請求項1から11のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- Corynebacterium glutamicumである、請求項1から11のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- グルコースから生体分子を産生する方法であって、請求項1から13のいずれか一項に記載の宿主細胞を前記生体分子の産生に適した条件下で培養するステップを含む方法。
- 前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸またはアルコールである、請求項14に記載の方法。
- 前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである、請求項15に記載の方法。
- 前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項15に記載の方法。
- 前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項15に記載の方法。
- グルコースからの生体分子の産生を増加させることが可能な微生物を生成するための方法であって、
a)宿主微生物を遺伝的に改変するステップであって、該改変するステップは、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を、該宿主微生物のゲノムに導入することを含み、グルコース透過酵素遺伝子の該ライブラリー由来の各グルコース透過酵素遺伝子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結しており、該改変は、該グルコース透過酵素遺伝子を発現する該宿主微生物の株を生成させる、ステップと;
b)該宿主微生物の複数の株が生成するまでステップa)を複数ラウンド繰り返すステップであって、該宿主微生物の該複数の株の各株は、グルコース透過酵素遺伝子の該ライブラリー由来の別々のグルコース透過酵素遺伝子を発現する、ステップと;
c)該宿主微生物の該複数の株の各株を、発酵条件下で、グルコースを含む炭素源と接触させるステップと;
d)対照微生物によりグルコースから産生された生体分子の量と比較して増加した量の該生体分子をグルコースから産生する該宿主微生物の各株を選択するステップであって、該対照微生物は、グルコース透過酵素遺伝子の該ライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を発現しない、ステップと
を含む方法。 - グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリー内の前記グルコース透過酵素遺伝子のそれぞれが、細菌グルコース透過酵素遺伝子である、請求項19に記載の方法。
- 細菌グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号13、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号9、配列番号14またはこれらの組合せのポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む、請求項20に記載の方法。
- 細菌グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号23、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号19、配列番号24またはこれらの組合せのヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む、請求項20に記載の方法。
- ヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリー由来のヘキソキナーゼ遺伝子を導入するステップであって、ヘキソキナーゼ遺伝子の該ライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子が、プロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結しており、該プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号2、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から選択される配列を含む、ステップをさらに含む、請求項19から22のいずれか一項に記載の方法。
- ヘキソキナーゼ遺伝子の前記ライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子の前記導入が、グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリー由来の各グルコース透過酵素遺伝子の前記導入と同時である、請求項23に記載の方法。
- ヘキソキナーゼ遺伝子の前記ライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子が、グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を含むキメラ構築物中に存在する、請求項24に記載の方法。
- 前記ヘキソキナーゼ遺伝子が、グルコキナーゼ遺伝子である、請求項23から25のいずれかに記載の方法。
- 前記グルコキナーゼ遺伝子が、細菌グルコキナーゼ遺伝子である、請求項26に記載の方法。
- 細菌グルコキナーゼ遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号15および/または配列番号16のポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む、請求項27に記載の方法。
- 細菌グルコキナーゼ遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号25および/または配列番号26のヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドと前記ヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドとが異なっている、請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドと前記ヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドとが同一である、請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主微生物が、Corynebacterium属に属する、請求項19から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主微生物が、Corynebacterium glutamicumである、請求項19から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される、請求項19から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸またはアルコールである、請求項19から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである、請求項35に記載の方法。
- 前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項35に記載の方法。
- 前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項35に記載の方法。
- グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーであって、グルコース透過酵素遺伝子の該ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結している、ライブラリー。
- 各グルコース透過酵素遺伝子が、細菌グルコース透過酵素遺伝子である、請求項39に記載のライブラリー。
- 細菌グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号13、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号9、配列番号14またはこれらの組合せのポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む、請求項40に記載のライブラリー。
- 細菌グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号23、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号19、配列番号24またはこれらの組合せのヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む、請求項40に記載のライブラリー。
- グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子が、キメラ構築物の第1の部分であり、該キメラ構築物が、第2の部分を含み、該第2の部分が、ヘキソキナーゼ遺伝子である、請求項39から42のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記ヘキソキナーゼ遺伝子が、プロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結しており、該プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号2、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から選択される配列を含む、請求項43に記載のライブラリー。
- 前記ヘキソキナーゼ遺伝子が、グルコキナーゼ遺伝子である、請求項43から44のいずれかに記載のライブラリー。
- 前記グルコキナーゼ遺伝子が、細菌グルコキナーゼ遺伝子である、請求項45に記載のライブラリー。
- 細菌グルコキナーゼ遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号15および/または配列番号16のポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む、請求項46に記載のライブラリー。
- 細菌グルコキナーゼ遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号25および/または配列番号26のヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む、請求項46に記載のライブラリー。
- 前記グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドと前記ヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドとが異なっている、請求項44から48のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドと前記ヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドとが同一である、請求項44から48のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 生体分子を産生する方法であって、請求項39から50のいずれか一項に記載のライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を宿主細胞に導入するステップと、該宿主細胞を該生体分子の産生に適した条件下で培養するステップとを含む方法。
- 前記生体分子が、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸またはアルコールである、請求項51に記載の方法。
- 前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである、請求項52に記載の方法。
- 前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項52に記載の方法。
- 前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、Corynebacterium属に属する、請求項51から55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、Corynebacterium glutamicumである、請求項51から55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される、請求項51から57のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号23、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号19および配列番号24から選択されるコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
- 配列番号25および配列番号26から選択されるコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
- 第1のコドン最適化ポリヌクレオチドおよび第2のコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、該第1のポリヌクレオチドおよび該第2のポリヌクレオチドが、宿主細胞における発現のためにそれぞれコドン最適化されており、該第1のコドン最適化ポリヌクレオチドが、グルコース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードし、該第2のコドン最適化ポリヌクレオチドが、グルコキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
- 前記第1のコドン最適化ポリヌクレオチドが、配列番号23、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号19および配列番号24から選択される、請求項61に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
- 前記第2のコドン最適化ポリヌクレオチドが、配列番号25および配列番号26から選択される、請求項61または62に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
- グルコース透過酵素活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号13、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号9および配列番号14から選択される配列を含む、請求項61に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
- グルコキナーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号15および配列番号16から選択される配列を含む、請求項61または64に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
- 前記宿主細胞が、E.coliおよび/またはC.glutamicumである、請求項59から65のいずれかに記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
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