CN113201536B - 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用 - Google Patents
具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本公开涉及具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用。具体来说，本公开涉及具有启动子活性的多核苷酸，含有前述多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备蛋白的方法和生产氨基酸的方法。本公开具有启动子活性的多核苷酸是SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸的突变体，与SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸相比，突变体的启动子活性显著增强，能够促使目标基因稳定高效表达，进而稳定、高效的生产下游产物。
Description
技术领域
本公开属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备蛋白的方法和生产氨基酸的方法。
背景技术
赖氨酸(lysine)的化学名称是2,6-二氨基庚二酸，是动物和人体必需氨基酸，能促进人体发育、增强免疫能力，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸有L-型(左旋)、D-型(右旋)和DL型(消旋型)三种化学旋光异构体，其中只有L型才能为生物所利用，通常所说的赖氨酸即为L-赖氨酸。
L-赖氨酸是常见的组成蛋白质的20种氨基酸之一，与组氨酸和精氨酸同属于碱性氨基酸。由于人体和动物体不能靠自身合成L-赖氨酸，只能从食物中获取，属于八大必须氨基酸之一。L-赖氨酸在人类主食谷物食品中的含量较低，缺乏会引起蛋白质代谢及功能障碍，对生长造成不利影响，并且在加工过程中容易被破坏，故被称为第一限制性氨基酸，在医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中有着十分重要的地位。
目前为止，工业上生产L-赖氨酸的方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。棒状细菌和埃希氏菌在L-赖氨酸的工业化生产中获得了广泛应用，常用的埃希氏菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，常用的棒状细菌有棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，短杆菌属的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentus)，以及节杆菌属的某些种和微杆菌属的某些种。
在已知的具有L-赖氨酸生物合成途径的微生物和植物中，可以将L-赖氨酸生物合成途径划分为两个完全不同的途径，即氨基乙二酸途径(AAA)和二氨基庚二酸途径(DAP)。二氨基庚二酸途径(DAP)是天冬氨酸族氨基酸合成途径中的一部分，以天冬氨酸为底物，DAP途径存在合成内消旋二氨基庚二酸的琥珀酰化酶途径、乙酰酶途径和转氨酶途径，以及不经过内消旋二氨基庚二酸直接合成外消旋二氨基庚二酸的脱氢酶途径。
谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业微生物，其优势在于能发酵生产工业化规模的氨基酸。谷氨酸棒杆菌利用脱氢酶途径合成L-赖氨酸有6个酶催化反应，分别是天冬氨酸激酶(AK，由基因lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(ASADH，由基因asd编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS，由基因dapA编码)、二氢吡啶二羧酸还原酶(DHDPR，由基因dapB编码)、二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH，由基因ddh编码)和二氨基庚二酸脱羧酶(DAPDC，由基因lysA编码)。谷氨酸棒杆菌利用琥珀酰化酶途径合成L-赖氨酸的过程中还涉及合成内消旋二氨基庚二酸的四种酶：琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(由基因dapD编码)，四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶(由基因dapC编码)，琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶(由基因dapE编码)及二氨基庚二酸差向异构酶(由基因dapF编码)。众所周知，增强L-赖氨酸合成途径中的一个或多个基因的表达，能够有效提高L-赖氨酸的产量。
引用文献1公开了一种棒杆菌细菌，所述细菌除在其天然位点(座位)具有至少一个拷贝的编码蛋白质或RNA合成的可读框(ORF)、基因或等位基因外，一定还在第二个、可选地在第三个或第四个位点以整合入染色体的形式具有第二个、可选地第三个或第四个拷贝的该可读框(ORF)、基因或等位基因。该方法的棒杆菌细菌通过增加基因拷贝数的方式来提高基因表达水平，进而提高棒杆菌细菌生产氨基酸的产量。但基因拷贝数的增加会降低菌种基因组的稳定性，无法保证L-赖氨酸的稳定高效生产。
引用文献2公开了一种L-赖氨酸的生产方法，通过在培养基中培养下述具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌，并从该培养基收集L-赖氨酸，来生产L-赖氨酸，所述大肠杆菌经过修饰而降低了内消旋α,ε-二氨基庚二酸合成途径的1种或2种以上的酶，例如2,3,4,5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶或二氨基庚二酸差向异构酶的活性，并且其中导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。该方法需要在抑制内消旋α,ε-二氨基庚二酸合成途径的酶活性的同时，提高二氨基庚二酸脱氢酶的表达，存在操作过程复杂，操作成本高，无法高效生产L-赖氨酸的问题。
引用文献3公开了一种核酸分子，其被可操作地连接到编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因，可以增加二氨基庚二酸脱氢酶的酶活，从而增加菌株的L-赖氨酸产量。虽然该文献中的核酸分子与野生型启动子相比具有更高的活性，但尚不知晓是否存在具备更高启动子活性的核酸分子。本领域技术人员公知二氨基庚二酸脱氢酶的活性越高越利于赖氨酸的生产，因此，开发活性更高的启动子，将有利于增强二氨基庚二酸脱氢酶的表达，从而更具工业应用潜力。
引用文献：
引用文献1：CN1748031A
引用文献2：CN101765659A
引用文献3：CN101939432A
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的技术问题，例如：通过增加基因拷贝数来提高产量的棒杆菌细菌存在基因组稳定性差，具有L-赖氨酸生产能力的菌株的改造过程复杂，无法稳定、高效生产L-赖氨酸的缺陷。本公开提供了一种具有启动子活性的多核苷酸，与野生型ddh基因的启动子相比，多核苷酸的启动子活性显著提高。将具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接，可以在保持基因组稳定性的条件下提高目标基因的表达强度。
用于解决问题的方案
(1)一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(i)-(ii)中任一项所示的组：
(i)如SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸的突变体，所述突变体在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的一个或多个位置处包含突变的核苷酸；
(ii)与(i)所示序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且不包括SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸；
其中，所述突变体的启动子活性与如SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸的启动子活性相比，具有更高的启动子活性；并且，
所述突变体在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的核苷酸序列不选自ATGCATTGT。
(2)根据(1)所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述突变体的启动子活性与如SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸的启动子活性相比，具有18倍以上的增强的启动子活性。
(3)根据(1)或(2)所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述突变体在SEQ IDNO：9所示序列的第292-300位的4个、5个、6个、7个、8个或9个位置处包含突变的核苷酸；优选地，所述突变体在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的6个、7个、8个或9个位置处包含突变的核苷酸。
(4)根据(1)-(3)任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述具有启动子活性的多核苷酸的第292-300位的核苷酸序列选自如下任一组：
(a)ACAAAAGGT；
(b)TCTTCATCT；
(c)GGAAAGTAT；
(d)TTATTATAT；
(e)TAATCCTCT；
(f)TCAATTTAT；
(g)GCGCAATCT；
(h)CAGTTCCGT；
(i)AAGTTTTAT；
(g)TAAATGTAT；
(k)GGATTGTAT；
(l)CAAACTCAT；
(m)TACAAATCT；
(n)TATCAGTCT；
(o)CGAGGATAT；
(p)CCTTGTTAT。
(5)一种转录表达盒，其中，包含(1)-(4)任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
(6)一种重组表达载体，其中，包含(1)-(4)任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸，或(5)所述的转录表达盒。
(7)一种重组宿主细胞，其中，包含(5)所述的转录表达盒，或者(6)所述的重组表达载体。
(8)根据(7)所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌；更优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC14067。
(9)一种根据(1)-(4)任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸、(5)所述的转录表达盒、(6)所述的重组表达载体，或者(7)-(8)任一项所述的重组宿主细胞在制备用于增强基因转录水平的试剂或试剂盒中的应用。
(10)一种根据权利要求(6)所述的重组表达载体，或(7)-(8)任一项所述的重组宿主细胞在制备蛋白或生产氨基酸中的应用；
优选地，所述蛋白为参与合成氨基酸的酶；优选地，所述参与合成氨基酸的酶为二氨基庚二酸脱氢酶；
优选地，所述氨基酸包括L-赖氨酸及其衍生物，其中，所述衍生物包括戊二胺、5-氨基戊酸和戊二酸中的至少一种。
(11)一种增强目标基因表达的方法，其中，所述方法包括将权利要求(1)-(4)任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的步骤。
(12)一种制备蛋白的方法，其中，选择(5)所述的转录表达盒，(6)所述的重组表达载体，或(7)-(8)任一项所述的重组宿主细胞表达所述蛋白；可选地，所述蛋白为参与合成L-赖氨酸的酶；可选地，所参与合成L-赖氨酸的酶包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、赖氨酸运输蛋白、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或两种以上的组合；优选地，所述蛋白为二氨基庚二酸脱氢酶。
(13)一种生产氨基酸的方法，其中，选择(5)所述的转录表达盒，(6)所述的重组表达载体，或(7)-(8)任一项所述的重组宿主细胞表达参与合成氨基酸的酶，以所述参与合成氨基酸的酶生产所述氨基酸；
优选地，所述氨基酸包括L-赖氨酸及其衍生物，其中，所述衍生物包括戊二胺、5-氨基戊酸和戊二酸中的至少一种；
优选地，所述参与合成氨基酸的酶为二氨基庚二酸脱氢酶。
发明的效果
在一个实施方案中，本公开提供了具有启动子活性的多核苷酸，是启动子活性显著提高的二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh基因)启动子的突变体。与野生型ddh基因启动子相比，突变体启动子活性显著提高，将其与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因的表达强度，且不会破坏基因组的稳定性，使目标基因能够稳定高效表达，进而稳定、高效的生产下游产物。
在另一个实施方案中，本公开提供了转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，包含上述具有启动子活性的多核苷酸。在转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞中，具有启动子活性的多核苷酸与蛋白编码基因可操作地连接，可以提高蛋白编码基因的表达强度。
在另一个实施方案中，本公开提供了生产氨基酸的方法，利用上述具有启动子活性的多核苷酸，能够提高合成氨基酸的酶的表达，进而稳定、高效的生产氨基酸。当用于L-赖氨酸生产时，能够获得稳定高产的L-赖氨酸。
附图说明
图1示出了pEC-XK99E-Pddh-rfp质粒的示意图；
图2示出了培养平板上生长突变体克隆菌后的荧光显示结果，图中箭头标识位置为具有高强度红色荧光显示的单个克隆菌。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
本公开中的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
本公开中的术语“突变”是指在多核苷酸的一个或多个(例如，若干个)位置处包含突变的核苷酸，并且保持多核苷酸的启动子活性。其中，本公开中的突变(包含，取代、插入和/或缺失)特指其中的取代，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。
在一些具体的实施方案中，本公开的“突变”包含在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的一个或多个位置处的取代的核苷酸，且不包含SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位被ATGCATTGT取代的核苷酸。上述位置处的核苷酸被取代后的突变体，与如SEQ IDNO：9所示序列的多核苷酸的启动子活性相比，具有更高的启动子活性。
示例性地，本公开的“突变”包含在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个位置处的取代的核苷酸。在一些具体的实施方案中，本公开的“突变”包含在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的4个、5个、6个、7个、8个或9个位置处包含突变的核苷酸，优选在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的6个、7个、8个或9个位置处包含突变的核苷酸。上述位置处的核苷酸被取代后的突变体，与其他位置处被取代的突变比相比，具有更高的启动子活性。
本公开中的术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
在一些具体的实施方案中，具有启动子活性的多核苷酸包含与SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸的突变体具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性的序列。在本公开中，具有特定百分数的序列同一性指的是，与SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸的突变体中存在可使突变体的转录活性保持或提高的突变序列。
本公开中的术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。在核糖核酸(RNA)的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
本公开中的术语“启动子核心区”是指位于原核生物启动子区的一段核酸序列，是发挥启动子功能的核心序列区，主要包括-35区、-10区、-35区和-10区之间的区域以及转录起始位点，-35区是RNA聚合酶的识别位点，-10区是RNA聚合酶的结合位点。
在一些具体的实施方案中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸能够用于起始蛋白编码基因的表达。在另外一些实施方案中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸能够用于起始非编码基因的表达。
本公开中的术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本公开中的术语“蛋白编码基因”是指能够通过一定的规则指导蛋白的合成DNA分子，蛋白编码基因指导蛋白合成的过程一般包括以双链DNA为模板的转录过程和以mRNA为模板的翻译过程。蛋白编码基因含有CDS序列(Coding Sequence)，能够指导编码蛋白质的mRNA的产生。蛋白编码基因包括但不限于用于编码参与合成氨基酸的酶，在一些实施方案中，蛋白编码基因涉及用于编码参与合成L-赖氨酸的酶。对于参与合成L-赖氨酸的酶，包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、赖氨酸运输蛋白、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或两种以上的组合。本公开的具有启动子活性的多核苷酸，可适于调控目标基因的表达，实现目标产物的高效生产。
本公开中的术语“转录表达盒”指的包含转录调控元件与目标基因，利用转录调控元件对目标基因的表达进行调控的一类表达元件。在本公开中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。在本公开中，目标基因具体为蛋白编码基因。目标基因与多核苷酸“可操作地连接”，是指将具有启动子活性的多核苷酸与目标基因功能性连接，以启动和介导目标基因的转录，所述可操作地链接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。
本公开中的术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
示例性的，本公开涉及的载体为基于pEC-XK99E-rfp质粒[1]构建的ddh基因启动子强度表征质粒pEC-XK99E-Pddh-rfp，pEC-XK99E-Pddh-rfp质粒图谱如图1所示。图1中Pddh表示为ddh基因的启动子；ddh表示野生型二氨基庚二酸脱氢酶基因；linker表示为位于ddh基因与rfp蛋白之间的连接肽；rfp表示为红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)；Kan表示为卡那霉素抗性(Kanamycin resistant)。pEC-XK99E-Pddh-rfp转化入合适的宿主之后，可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的多核苷酸的转录起始元件或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入转录起始元件或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。
本公开中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本公开的具有启动子活性的多核苷酸的细胞即可。在一个实施方案中，宿主细胞指原核细胞，具体地，宿主细胞来源于适合发酵生产氨基酸的微生物，例如棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。作为优选地，宿主细胞是来源于棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌。其中，谷氨酸棒杆菌可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC14067等。
本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子的突变体
本公开利用野生型二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)的启动子序列，对ddh基因的核心启动子区序列进行突变，得到二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子的突变体。二氨基庚二酸脱氢酶基因的启动子序列如SEQ ID NO：9所示，二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子的突变体在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的一个或多个位置处包含突变的核苷酸，且所述突变体在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的核苷酸序列不选自ATGCATTGT。
经研究发现，二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子的突变体，是具有启动子活性的多核苷酸；且与SEQ ID NO：9所示序列的二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子相比，二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子的突变体具有改进的启动子活性。
在一些具体的实施方案中，具有启动子活性的多核苷酸与二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子的突变体序列相比，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性(包括这些数值之间所有范围和百分数)，且不包括SEQ IDNO：9所示序列。
在一些具体的实施方案中，具有启动子活性的多核苷酸与在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的4个、5个、6个、7个、8个或9个位置处包含突变的核苷酸，且与如SEQ IDNO：9所示序列的多核苷酸的启动子活性相比，具有更高的启动子活性；优选在SEQ ID NO：9所示序列的第292-300位的6个、7个、8个或9个位置处包含突变的核苷酸。
在一些具体的实施方案中，具有启动子活性的多核苷酸第292-300位的核苷酸序列选自如下任一组：(a)ACAAAAGGT；(b)TCTTCATCT；(c)GGAAAGTAT；(d)TTATTATAT；(e)TAATCCTCT；(f)TCAATTTAT；(g)GCGCAATCT；(h)CAGTTCCGT；(i)AAGTTTTAT；(g)TAAATGTAT；(k)GGATTGTAT；(l)CAAACTCAT；(m)TACAAATCT；(n)TATCAGTCT；(o)CGAGGATAT；(p)CCTTGTTAT。具有启动子活性的多核苷酸包含如SEQ ID NO：10-25任一所示的序列。与SEQID NO：9所示序列的二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子相比，突变体的启动子活性得到增强18倍以上，优选19倍，优选20倍，优选22倍，优选23倍，优选24倍，优选25倍，优选26倍，更优选27倍，更优选28倍，更优选30倍，更优选31倍以上。
重组表达载体的构建
在一些具体的实施方案中，首先构建包含二氨基庚二酸脱氢酶基因启动子的重组载体，然后对ddh基因的核心启动子区进行突变，获得包含有具有启动子活性的多核苷酸的重组表达载体。
对于重组载体的构建，根据目前已公开的谷氨酸棒杆菌的基因组信息设计引物ddh-F和ddh-R，以ddh-F和ddh-R对谷氨酸棒杆菌的基因组进行PCR扩增，获得ddh基因的启动子序列。
利用pEC-XK99E-rfp[1]质粒信息设计引物pEC-F和pEC-R，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，利用引物pEC-F和pEC-R扩增得到pEC-XK99E骨架、连接肽和红色荧光蛋白的DNA片段。
将引物ddh-F和ddh-R的扩增片段与引物pEC-F和pEC-R的扩增片段进行重组连接，获得连接有具有启动子活性的多核苷酸(也即，ddh基因启动子突变体序列)的重组表达载体。
谷氨酸棒杆菌的具体来源为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)。
氨基酸的生产过程
(1)本公开中将具有启动子活性的多核苷酸，与参与合成氨基酸的酶的编码基因可操作的连接，得到能够合成参与合成氨基酸的酶的重组表达载体，利用重组表达载体转化宿主细胞，获得重组宿主细胞。
(2)对重组宿主细胞进行发酵培养，从重组宿主细胞或重组宿主细胞的培养液中收集氨基酸，完成氨基酸的生产过程。
上述生产过程中，由于多核苷酸具有改进的启动子活性，在重组宿主细胞中，参与合成氨基酸的酶的编码基因的转录活性提高，参与氨基酸合成的酶的表达量提高，进而使氨基酸的产量显著提升。
对于生产的氨基酸，所述氨基酸包括L-赖氨酸及其衍生物，优选地，所述衍生物包括戊二胺、5-氨基戊酸和戊二酸中的至少一种。
对于参与合成氨基酸的酶，所述参与合成氨基酸的酶是参与合成L-赖氨酸的酶；优选地，参与合成氨基酸的酶为二氨基庚二酸脱氢酶。具有启动子活性的多核苷酸可以显著提高二氨基庚二酸脱氢酶的转录活性，使二氨基庚二酸脱氢酶的表达量显著提高。
在一些具体的实施方案中，宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，谷氨酸棒杆菌是用于生产L-赖氨酸的重要菌株，利用具有启动子活性的多核苷酸、转录表达盒或重组表达载体对谷氨酸棒杆菌进行改造后，谷氨酸棒杆菌参与合成L-赖氨酸的酶的表达量显著提高，具体为二氨基庚二酸脱氢酶的表达量显著提高，使谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的能力大大提高。
在一些具体的实施方案中，重组宿主细胞是经过如下改良的谷氨酸棒杆菌：1)谷氨酸棒杆菌中的天冬氨酸激酶编码基因引入了T311I突变编码序列；2)谷氨酸棒杆菌中丙酮酸羧化酶基因启动子的第279位至第317位的核心区为CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG；3)将具有启动子活性的多核苷酸与编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因可操作地连接，然后导入谷氨酸棒杆菌。以上述方法改造的谷氨酸棒杆菌，是L-赖氨酸的高产菌株。
具体地，天冬氨酸激酶、丙酮酸羧化酶以及二氨基庚二酸脱氢酶的编码基因可被分离，插入到用于转化生产的表达载体中，表达载体在宿主细胞中可独立于宿主细胞复制并表达所述酶，或在某些情况下整合进入宿主细胞的基因组中。在本领域，用于操纵微生物的方法是已知的，如《分子生物学现代方法》(Online ISBN：9780471142720,John Wileyand Sons,Inc.)、《微生物代谢工程：方法和规程》(Qiong Cheng Ed.,Springer)和《系统代谢工程：方法和规程》(Hal S.Alper Ed.,Springer)等出版物中被解释。
在一些具体的实施方案中，重组宿主细胞的培养条件为：首先将谷氨酸棒杆菌接种到TSB液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到的800μl发酵培养基/孔的24孔板中，初始OD控制约为0.1，30℃培养17h，孔板摇床转速为800rpm。
对于TSB液体培养基，成分为：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L。
对于发酵培养基，成份为：葡萄糖，80g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1g/L；NaCl，1g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，10g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.45g/L；FeSO4·7H2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，40g/L；初始pH7.2。
在一些具体的实施方案中，对于重组宿主细胞或重组细胞的培养液回收氨基酸，可通过本领域常用方法，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1.谷氨酸棒杆菌ddh基因启动子强度表征质粒的构建
为了表征谷氨酸棒杆菌ddh基因启动子的强度，本实施例首先构建一个表征载体，将ddh基因启动子和ddh基因片段连接在pEC-XK99E质粒骨架基础上，利用ddh基因启动子表达ddh基因、连接肽和红色荧光蛋白(rfp)基因。具体如下：
(1)根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Corynebacterium glutamicum ATCC13032，Gene ID:2830649)基因组序列及ddh基因注释信息，设计引物ddh-F和ddh-R，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得ddh基因启动子和ddh基因片段，扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示。
(2)以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，以pEC-F和pEC-R引物进行扩增，扩增pEC-XK99E质粒骨架、连接肽和红色荧光蛋白基因的DNA片段，扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示。
将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组扩增片段，以及pEC-XK99E-rfp的质粒扩增片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-XK99E-Pddh-rfp表征载体，其质粒图谱如图1所示。以上所用引物序列如表1所示，连接肽序列信息如表2所示。
表1
表2
实施例2.谷氨酸棒杆菌ddh基因启动子突变体筛选及强度表征
(1)谷氨酸棒杆菌ddh基因启动子突变体文库的构建
本实施例对谷氨酸棒杆菌ddh基因启动子的核心区“TGATGAAAGAGATGTCCCTGAATC ATCATCTAAGTATGCATCTCGGTAAGCTCGACCAGG”进行突变，其中下划线处分别为该启动子的-35区和-10区主要序列。本实施例在以上核心区对应位置进行突变“TGATGAAAGAGATGTCCCTGAATCATCATCTAAGTNNNNNNNNNGGTAAGCTCGACCAGG”，分别采用ddh-M1、ddh-M2和ddh-M3、ddh-M4引物扩增质粒的两个片段，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，对获得的所有克隆菌进行收集并提取质粒，获得ddh基因启动子突变体文库。为了对比现有技术中已经公开的ddh启动子突变体，我们同时在pEC-XK99E-Pddh-rfp质粒基础上，构建引用文献3(CN101939432A)中相同的ddh启动子突变体，具体为启动子核心区序列为“TGATGAAAGAGATGTCCCTGAATCATCATCTAAGTATGCATtgtGGTAAGCTCGACCAGG”，横线标出的是引用文献3公开的突变位点。将以上文库、现有技术突变体pEC-XK99E-Pddh-x-rfp和实施例1中获得野生型对照pEC-XK99E-Pddh-rfp分别转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032，涂布TSB平板，通过荧光成像系统对长有数百个克隆的平板进行荧光拍照，根据克隆的荧光亮度初步筛选表达强度提高的突变体。图2示出了培养平板上生长突变体克隆菌后的荧光照片，图中箭头标识位置为具有高强度红色荧光显示的单个克隆菌。TSB平板培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L；琼脂粉，15g/L。本实施例对大于1万个克隆进行初步筛选，获得约20个荧光强度显著增强的突变体。以上所用引物序列如表3所示。
表3
(2)谷氨酸棒杆菌ddh基因启动子突变体文库的强度表征
对以上平板观察荧光强度增强的所有突变体进行96孔板培养表征启动子的强度，TSB液体培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L。将筛选获得的菌株和野生型对照、现有技术对照分别用牙签接种至每孔含有200μl TSB液体培养基的96孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800rpm，30℃培养24h后检测菌株的荧光强度，并对荧光强度较野生型对照提高的菌株进行测序。部分启动子突变体序列相同，最终成功获得16个表达强度显著提高的不同启动子突变体，结果如表4所示，按顺序将本发明获得的启动子编号为Pddh-1至Pddh-16。Pddh-1至Pddh-16启动子活性提高范围为18-31倍左右，为改造ddh等基因的表达提供丰富元件。
以上述方法对引用文献3的ddh启动子突变体(Pddh-x)进行荧光强度的检测，结果如表4所示，Pddh-x相对野生型启动子活性仅提高15倍，本发明的启动子相对于现有技术公开的启动子表达强度提高了15-101％，具有实质性的进步。
表4
实施例3.谷氨酸棒杆菌ddh基因启动子突变体应用于赖氨酸生产
(1)谷氨酸棒杆菌ddh基因启动子突变体的重组载体构建
根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别以ATCC13032基因组为模板，以ddh-UF/ddh-UR和ddh-DF1/ddh-DR，ddh-UF/ddh-UR和ddh-DF10/ddh-DR，ddh-UF/ddh-UR和ddh-DF16/ddh-DR为引物，PCR扩增Pddh-1、Pddh-10和Pddh-16启动子突变的上下游同源臂；同时以pK18-1/2引物扩增pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1)的骨架。上述两种PCR片段回收后，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，分别获得启动子突变的重组载体pK18-Pddh-1、pK18-Pddh-10、和pK18-Pddh-16。以上所用引物序列如表5所示。
表5
(2)谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌的pyc基因启动子突变体构建
将上述构建的重组载体pK18-Pddh-1、pK18-Pddh-10、和pK18-Pddh-16分别转化谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌SCgL37(该菌株是将谷氨酸棒杆菌ATCC13032天冬氨酸激酶编码基因引入了T311I(碱基由ACC突变为ATC)氨基酸突变，丙酮酸羧化酶基因启动子的第279位至第317位的核心区突变为CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG的菌株)，涂布含有5g/L葡萄糖和25μg/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确的一次重组转化子分别接种含有5g/L葡萄糖的LB培养基，过夜培养，分别稀释涂布添加100g/L蔗糖的LB固体培养基平板进行筛选，分别获得的ddh启动子突变的菌株SCgL38、SCgL39和SCgL40。
(3)谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌ddh基因启动子突变体的L-赖氨酸生产能力评价
为了测试谷氨酸棒杆菌中ddh启动子突变对菌株产L-赖氨酸的影响，分别对SCgL37、SCgL38、SCgL39和SCgL40菌株进行发酵测试，发酵培养基成份为：葡萄糖，80g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1g/L；NaCl，1g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，10g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.45g/L；FeSO4·7H2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，40g/L；初始pH7.2。首先将菌株接种到TSB液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μl发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.1，30℃培养17h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测L-赖氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-赖氨酸的糖酸转化率。结果如表6所示，ddh启动子突变后菌株的赖氨酸产量和糖酸转化率均有提高，而且随着启动子强度的增强而提高更加显著。以上结果表明增强ddh启动子表达强度的突变体可应用于L-赖氨酸生产。
表6
| 菌株 | 赖氨酸产量(g/L) | 转化率(％) |
| SCgL37 | 2.97±0.06 | 5.41±0.04 |
| SCgL38 | 3.47±0.21 | 6.47±0.57 |
| SCgL39 | 3.53±0.21 | 7.05±1.09 |
| SCgL40 | 3.60±0.36 | 7.49±1.26 |
由于L-赖氨酸下游产物的合成均依赖于二氨基庚二酸脱氢酶催化的反应步骤，通过本公开的ddh基因启动子的突变体增强ddh基因的表达也可以提高下游产物的产量。因此，本公开提供的技术方案也可用于L-赖氨酸下游产物的生产，如戊二胺、5-氨基戊酸、戊二酸等的生产。
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
参考文献：
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<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
cctgatgcgg tattttctcc gtgcgtggcg agttttacaa ag 42
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
gacgtcgcgt gcgatcagat c 21
<210> 3
<211> 84
<212> DNA
<213> Plasmid
<400> 3
atctgatcgc acgcgacgtc ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctctg 60
cttcctccga agacgttatc aaag 84
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Plasmid
<400> 4
ggagaaaata ccgcatcagg c 21
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
ccctgaatca tcatctaagt nnnnnnnnng gtaagctcga ccaggacagt g 51
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
aaccttccat acgaactttg aaacg 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 7
caaagttcgt atggaaggtt ccg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 8
acttagatga tgattcaggg ac 22
<210> 9
<211> 351
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 9
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cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tatgcatctc 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 351
<210> 10
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 10
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<210> 11
<211> 351
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 11
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<210> 12
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 12
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 351
<210> 17
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 351
<210> 25
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 25
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
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gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
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ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 351
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<213> Corynebacterium glutamicum
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caggaaacag ctatgacatg ttccagccat cgccaaataa g 41
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<213> Corynebacterium glutamicum
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acttagatga tgattcaggg ac 22
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 28
ccctgaatca tcatctaagt acaaaaggtg gtaagctcga ccaggacagt g 51
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<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 29
ccctgaatca tcatctaagt taaatgtatg gtaagctcga ccaggacagt g 51
<210> 30
<211> 51
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 30
ccctgaatca tcatctaagt ccttgttatg gtaagctcga ccaggacagt g 51
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<211> 43
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 31
tgtaaaacga cggccagtgc tgtactggac tgccttttga acg 43
<210> 32
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<212> DNA
<213> Plasmid
<400> 32
gcactggccg tcgttttac 19
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Plasmid
<400> 33
catgtcatag ctgtttcctg tgtg 24
<210> 34
<211> 1331
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 34
cctgatgcgg tattttctcc gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg 60
cctaaatggc gggtattttc atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc 120
ccatccggat aaaccaccat gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc 180
cccacagatc ctgactgctg ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca 240
aaaggctcaa caatacgaaa cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc 300
atcatctaag tatgcatctc ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg 360
attacaagaa catgaccaac atccgcgtag ctatcgtggg ctacggaaac ctgggacgca 420
gcgtcgaaaa gcttattgcc aagcagcccg acatggacct tgtaggaatc ttctcgcgcc 480
gggccaccct cgacacaaag acgccagtct ttgatgtcgc cgacgtggac aagcacgccg 540
acgacgtgga cgtgctgttc ctgtgcatgg gctccgccac cgacatccct gagcaggcac 600
caaagttcgc gcagttcgcc tgcaccgtag acacctacga caaccaccgc gacatcccac 660
gccaccgcca ggtcatgaac gaagccgcca ccgcagccgg caacgttgca ctggtctcta 720
ccggctggga tccaggaatg ttctccatca accgcgtcta cgcagcggca gtcttagccg 780
agcaccagca gcacaccttc tggggcccag gtttgtcaca gggccactcc gatgctttgc 840
gacgcatccc tggcgttcaa aaggcagtcc agtacaccct cccatccgaa gacgccctgg 900
aaaaggcccg ccgcggcgaa gccggcgacc ttaccggaaa gcaaacccac aagcgccaat 960
gcttcgtggt tgccgacgcg gccgatcacg agcgcatcga aaacgacatc cgcaccatgc 1020
ctgattactt cgttggctac gaagtcgaag tcaacttcat cgacgaagca accttcgact 1080
ccgagcacac cggcatgcca cacggtggcc acgtgattac caccggcgac accggtggct 1140
tcaaccacac cgtggaatac atcctcaagc tggaccgaaa cccagatttc accgcttcct 1200
cacagatcgc tttcggtcgc gcagctcacc gcatgaagca gcagggccaa agcggagctt 1260
tcaccgtcct cgaagttgct ccatacctgc tctccccaga gaacttggac gatctgatcg 1320
cacgcgacgt c 1331
<210> 35
<211> 5938
<212> DNA
<213> Plasmid
<400> 35
atctgatcgc acgcgacgtc ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctctg 60
cttcctccga agacgttatc aaagagttca tgcgtttcaa agttcgtatg gaaggttccg 120
ttaacggtca cgagttcgaa atcgaaggtg aaggtgaagg tcgtccgtac gaaggtaccc 180
agaccgctaa actgaaagtt accaaaggtg gtccgctgcc gttcgcttgg gacatcctgt 240
ccccgcagtt ccagtacggt tccaaagctt acgttaaaca cccggctgac atcccggact 300
acctgaaact gtccttcccg gaaggtttca aatgggaacg tgttatgaac ttcgaagacg 360
gtggtgttgt taccgttacc caggactcct ccctgcaaga cggtgagttc atctacaaag 420
ttaaactgcg tggtaccaac ttcccgtccg acggtccggt tatgcagaaa aaaaccatgg 480
gttgggaagc ttccaccgaa cgtatgtacc cggaagacgg tgctctgaaa ggtgaaatca 540
aaatgcgtct gaaactgaaa gacggtggtc actacgacgc tgaagttaaa accacctaca 600
tggctaaaaa accggttcag ctgccgggtg cttacaaaac cgacatcaaa ctggacatca 660
cctcccacaa cgaagactac accatcgttg aacagtacga acgtgctgaa ggtcgtcact 720
ccaccggtgc ttaactgcag gcatgcaagc ttggctgttt tggcggatga gagaagattt 780
tcagcctgat acagattaaa tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg 840
gcggcagtag cgcggtggtc ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta 900
gcgccgatgg tagtgtgggg tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata 960
aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac 1020
gctctcctga gtaggacaaa tccgccggga gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc 1080
ggagggtggc gggcaggacg cccgccataa actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc 1140
atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta caaactcttt ttgtttattt ttctaaatac 1200
attcaaatat gtatccgctc atgaattaat tccgctagat gacgtgcggc ttcgacctcc 1260
tgggcgtggc gcttgttggc gcgctcgcgg ctggctgcgg cacgacacgc gtctgagcag 1320
tattttgcgc gccgtcctcg tgggtcaggc cggggtggga tcaggccacc gcagtaggcg 1380
cagctgatgc gatcctccac tactgcgcgt cctcctggcg ctgccgagca cgcagctcgt 1440
cggccagctc ttcaaggtcg gccacaagcg tttctaggtc gctcgcggca cttgcccagt 1500
cgcgtgatgc tggcgcgtct gtcgtatcga gggcgcggaa aaatccgatc accgttttta 1560
aatcgacggc ggcatcgagt gcgtcggact ccagcgcgac atcggagaga tccaccgctg 1620
atgcttcagg ccagttttgg tacttcgtcg tgaaggtcat gacaccatta taacgaacgt 1680
tcgttaaaaa ttctagcccc aattctgata atttcttccg gcactcctgc gaaaacctgc 1740
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atttcaccct gaccagcgaa gcggcacttt agtgcatgag gtgtgcccct ggtttcccct 1860
ctttggaggg ttcaacccaa aaaagcacac aagcaaaaat gaaaatcatc atgagcaagt 1920
tggtgcgaag cagcaacgcg ctagctccaa aaaggtctcc aggatctcga ggagattttt 1980
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cgagacaccc taaagggggg gaaccgtttt ctgctgacgg tgtttcgttt attagttttc 2160
agcccgtgga tagcggaggg tgagggcaag tgagagccag agcaaggacg ggacccctaa 2220
aggggggaac cgttttctgc tgacggtgtt tcgtttatta gttttcagcc cgtggacggc 2280
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ctagttcgcc tgcaagctca cgagtcgagg gatcagcaac cgattgagaa cgggcatcca 2400
ggatcgcagt tttgacgcga agttcgagca actcgcctgt catttctcgg cgtttgtttg 2460
cttccgctaa tcgctgtcgc gtctcctgcg catacttact ttctgggtca gcccatctgc 2520
gtgcattcga tgtagctgcg ccccgtcgcc ccatcgtcgc tagagctttc cgccctcggc 2580
tgctctgcgt ttccacccga cgagcaggga cgactggctg gcctttagcc acgtagccgc 2640
gcacacgacg cgccatcgtc aggcgatcac gcatggcggg aagatccggc tcccggccgt 2700
ctgcaccgac cgcctgggca acgttgtacg ccacttcata cgcgtcgatg atcttggcat 2760
cttttaggcg ctcaccagca gctttgagct ggtatcccac ggtcaacgcg tggcgaaacg 2820
cggtctcgtc gcgcgctcgc tctggatttg tccagagcac tcgcacgccg tcgatcaggt 2880
cgccggacgc gtccagggcg ctcggcaggc tcgcgtccaa aatcgctagc gccttggctt 2940
ctgcggtggc gcgttgtgcc gcttcaatgc gggcgcgtcc gctggaaaag tcctgctcaa 3000
tgtacttttt cggcttctgt gatccggtca tcgttcgagc aatctccatt aggtcggcca 3060
gccgatccac acgatcatgc tggcagtgcc atttataggc tgtcggatcg tctgagacgt 3120
gcagcggcca ccggctcagc ctatgcgaaa aagcctggtc agcgccgaaa acacgagtca 3180
tttcttccgt cgttgcagcc agcaggcgca tatttgggct ggttttacct gctgcggcat 3240
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cgtgctcaat cttcccgccg gcctggtggc tgggcacatc gatgtcaagc acgatcaccg 3420
cggcatgttg cgcgtgcgtc agcgcaacgt actggcaccg cgtcagcgct tttgagccag 3480
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gatcggcgga caatttccac gcgctagctg tgactgtgtc ctgcggatcg gctagagtca 3720
tgtcttgagt gctttctccc agctgatgac tgggggttag ccgacgccct gtgagttccc 3780
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cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag 3960
ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa 4020
gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc 4080
tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg 4140
gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat 4200
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atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 4680
cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 4740
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tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 4860
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ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 4980
acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 5040
tctgagcggg actctggggt tcgcggaatc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 5100
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 5160
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ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 5280
ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 5340
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 5400
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 5460
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 5520
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 5580
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 5640
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tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5760
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gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 5880
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcc 5938
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 36
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 37
ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctct 39
<210> 38
<211> 351
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 38
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tatgcattgt 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 351
Claims (21)
1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列为如SEQ IDNO：10-25任一项所示的序列。
2.一种转录表达盒，其特征在于，包含权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的转录表达盒，其特征在于，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸，或权利要求2-3任一项所述的转录表达盒。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2-3任一项所述的转录表达盒，或者权利要求4所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌。
8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC 14067。
9.一种根据权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸、权利要求2-3任一项所述的转录表达盒、权利要求4所述的重组表达载体，或者权利要求5-8任一项所述的重组宿主细胞在制备用于增强基因转录水平的试剂或试剂盒中的应用。
10.一种根据权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5-8任一项所述的重组宿主细胞在制备蛋白或生产氨基酸中的应用。
11.根据权利要求10所述的重组表达载体，其特征在于，所述蛋白为参与合成氨基酸的酶。
12.根据权利要求11所述的重组表达载体，其特征在于，所述参与合成氨基酸的酶为二氨基庚二酸脱氢酶。
13.根据权利要求10所述的重组表达载体，其特征在于，所述氨基酸包括L-赖氨酸及其衍生物，其中，所述衍生物包括戊二胺、5-氨基戊酸和戊二酸中的至少一种。
14.一种增强目标基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的步骤。
15.一种制备蛋白的方法，其特征在于，选择权利要求2-3任一项所述的转录表达盒，权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5-8任一项所述的重组宿主细胞表达所述蛋白。
16.根据权利要求15所述的制备蛋白的方法，其特征在于，所述蛋白为参与合成L-赖氨酸的酶。
17.根据权利要求16所述的制备蛋白的方法，其特征在于，所参与合成L-赖氨酸的酶包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、赖氨酸运输蛋白、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或两种以上的组合。
18.根据权利要求17所述的制备蛋白的方法，其特征在于，所述蛋白为二氨基庚二酸脱氢酶。
19.一种生产氨基酸的方法，其特征在于，选择权利要求2-3任一项所述的转录表达盒，权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5-8任一项所述的重组宿主细胞表达参与合成氨基酸的酶，以所述参与合成氨基酸的酶生产所述氨基酸。
20.根据权利要求19所述的生产氨基酸的方法，其特征在于，所述氨基酸包括L-赖氨酸及其衍生物，其中，所述衍生物包括戊二胺、5-氨基戊酸和戊二酸中的至少一种。
21.根据权利要求20所述的生产氨基酸的方法，其特征在于，所述参与合成氨基酸的酶为二氨基庚二酸脱氢酶。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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