CN113943747B

CN113943747B - 一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法

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Publication number: CN113943747B
Application number: CN202111303004.3A
Authority: CN
Inventors: 吴丽娟; 鄂志国; 张治针; 王磊; 王惠梅
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2041-11-05
Also published as: CN113943747A

Abstract

本发明公开了一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法，涉及基因工程和代谢工程领域。所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，命名为伯克霍尔德氏菌JP2‑270Δ38940，是将伯克霍尔德氏菌JP2‑270中DM992_38940基因敲除，获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。本发明提供的一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌产生的双氢剑兰制霉菌素量大，且该双氢剑兰制霉菌素具有更好的抗肿瘤作用，特别是对胶质瘤具有更好的活性，在制备治疗肿瘤疾病药物方面具有潜在价值。

Description

一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程和代谢工程领域，具体涉及一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法。

背景技术

伯克氏菌目属于细菌中变形菌门的β-变形菌纲，被发现能够存在于水和土壤等多种生态环境中，包括具有致病性的一属和环境友好型的一属。据统计，伯克氏菌能够分泌包括各种具有蛋白水解活性和溶血活性的胞外酶在内的多种次级代谢产物。伯克氏菌中聚酮合酶途径和非核糖体多肽途径的总量只低于放线菌，伯克氏菌目前成为继放线菌之后的天然产物来源的第二大类细菌，然而其中大部分生物合成基因簇为未开发或者沉默的，想要对这些未知基因簇加以开发和利用，则必须借助有效的基因操作工具和表达宿主实现未知基因簇的原位激活和异源表达。

申请人前期的专利申请，公开号为CN109234211A的发明申请公开了一株伯克霍尔德氏菌JP2-270(保藏编号为CCTCC NO：M 2018703)，是一株分离自水稻根系的革兰氏阴性生防细菌，其对水稻纹枯病、稻瘟病和恶苗病具有抑菌作用，具有一定的防治效果。JP2-270属于洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderiacepacia Complex，Bcc)，该菌群是一组表型相近但基因型不同的复合物。

2020年，Hertweck和Challis课题组在确认戊二酰亚胺单元的核心生物合成基因后，先后通过基因组挖掘的手段，从伯克霍尔德氏菌中鉴定出新型戊二酰亚胺类天然产物剑兰制霉菌素(Genomics-driven discovery of a novel glutarimide antibiotic fromBurkholderia gladioli reveals an unusual polyketide synthase chain releasemechanism,Angewandte Chemie International Edition,2020)。剑兰制霉菌素对几种人类癌细胞系具有良好的活性并抑制肿瘤细胞迁移，它含有一种不寻常的2-酰基-4-羟基-3-甲基丁烯内酯。聚酮合酶的C端的AfsA-样结构域被证明可以催化3-酮硫酯与磷酸二羟基丙酮的缩合，因此表明它在聚酮链释放和丁烯内酯形成中起关键作用。

随着公共基因组信息的倍数增加，利用基因组挖掘策略，有望发现更多具有新颖结构和良好活性的戊二酰亚胺类天然产物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产双氢剑兰制霉菌素(dihydrogladiostatin)的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)及其制备方法。

本发明提供了一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，命名为伯克霍尔德氏菌JP2-270Δ38940，由伯克霍尔德氏菌JP2-270敲除了DM992_38940基因得到，双氢剑兰制霉菌素的化学结构式如如图11所示。优选的，DM992_38940基因的DNA序列如SEQ IDNO.1所示。

具体的，将基因序列如SEQ ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如SEQ ID NO.4所示的插入基因片段38940dw同时连接至制备的线性化pK18mobSacB载体上，制备用于DM992_38940基因敲除质粒pK18-38940，将质粒pK18-38940转入伯克霍尔德氏菌JP2-270感受态细胞，筛选获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，其中质粒pK18-38940的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌在制备双氢剑兰制霉菌素中的应用。

本发明还提供了一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌的制备方法，方法如下：将伯克霍尔德氏菌JP2-270中DM992_38940基因敲除，获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。具体的，基因敲除的具体步骤如下：基因敲除时，将基因序列如SEQ ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如SEQ ID NO.4所示的插入基因片段38940dw同时连接到制备的线性化pK18mobSacB载体上，制备用于基因敲除的质粒pK18-38940，将质粒pK18-38940转入伯克霍尔德氏菌JP2-270感受态细胞，筛选得到用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。优选的，采用电转化法，将质粒pK18-38940转入伯克霍尔德氏菌JP2-270感受态细胞。

本发明提供了一种用于制备双氢剑兰制霉菌素的方法，方法如下：发酵培养用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌后，将获得的发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发并收集沉淀物，沉淀物用甲醇溶液溶解后得到粗提物；粗提物依次经Sephadex LH-20色谱柱分离和ODS柱纯化得到双氢剑兰制霉菌素。具体的，所述粗提物经Sephadex LH-20色谱柱分离，用无水甲醇洗脱，得到10个馏分；将第5馏分进一步用ODS柱进行纯化，用80％的甲醇洗脱，得到12个馏分，在第5个馏分中得到双氢剑兰制霉菌素。

本发明还提供了一种抗肿瘤化合物，命名为双氢剑兰制霉菌素，其化学结构式如图11所示。

本发明还提供了所述的抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，肿瘤类型为胶质瘤。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，且其制备方法简单便捷。伯克霍尔德氏菌JP2-270产剑兰制霉菌素而基本不产双氢剑兰制霉菌素，或产生的双氢剑兰制霉菌素量少不足以检测到。本申请研究发现将该菌株的DM992_38940基因敲除后，得到的基因敲除菌株伯克霍尔德氏菌JP2-270Δ38940能够产双氢剑兰制霉菌素，产生的双氢剑兰制霉菌素量大，且该双氢剑兰制霉菌素具有更好的抗肿瘤作用，特别是对胶质瘤具有更好的活性，在制备治疗肿瘤疾病药物方面具有潜在价值。

附图说明

图1为JP2-270(A)和JP2-270Δ38940(B)代谢粗提物HPLC分析图。

图2为剑兰制霉菌素(A)和双氢剑兰制霉菌素(B)高分辨率质谱图。

图3为剑兰制霉菌素(A)和双氢剑兰制霉菌素(B)¹H谱图。

图4为剑兰制霉菌素(A)和双氢剑兰制霉菌素(B)¹³C谱图。

图5为剑兰制霉菌素HMQC谱图。

图6为双氢剑兰制霉菌素HMQC谱图。

图7为剑兰制霉菌素HMBC谱图。

图8为双氢剑兰制霉菌素HMBC谱图。

图9为剑兰制霉菌素COSY谱图。

图10为双氢剑兰制霉菌素COSY谱图。

图11为双氢剑兰制霉菌素结构式图。

图12为剑兰制霉菌素(1)和双氢剑兰制霉菌素(2)HMBC、COSY示意图。

具体实施方式

实施例1

质粒提取、载体制备及基因克隆与纯化。

1.质粒提取步骤如下：

伯克霍尔德氏菌JP2-270及其衍生菌株最适生长条件为：Luria-Bertani培养基(LB培养基)，28℃。LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，H₂O 1000mL，pH为7.2，常规灭菌后使用。若为固体培养基，在灭菌前向其中添加琼脂15g/L。接一新鲜单克隆伯克霍尔德氏菌JP2-270于3mL LB液体中过夜培养，菌悬浮液保藏于20％甘油中，于-80℃冰箱冻存。每次活化伯克霍尔德氏菌JP2-270均从-80℃冰箱中取出，用无菌接种环挑取适量于LB固体培养基表面划线。

将含有pK18mobsacB质粒(为本课题实验室保藏质粒)的E.coli DH5α菌株划线接种至LB固体平板上(含Km)，于37℃培养箱中培养12h。从平板上挑取单菌落接种至20mL灭菌的LB液体培养基中(含Km)，37℃，200rpm，摇晃培养过夜。然后收集菌体，用质粒提取试剂盒Axygen(AP-MN-P-250)提取质粒，具体操作步骤按说明书操作。

2.线性线性化载体制备

提取的pK18mobsacB质粒按照(10×buffer：10μL，质粒：10μL-20μL，酶1(EcoRI)：1μL，酶2(SalI)：1μL，ddH₂O补足100μL)配制双酶切反应体系，将配制好的酶切反应体系于37℃恒温静置30min进行酶切反应。酶切反应结束后，将酶切反应混合液在0.8％的琼脂糖凝胶电泳上分离，用Axgen DNA胶回收试剂盒(AP-GX-50)对大片段(5.7bp)进行回收，立即使用或于-20℃保存备用。

3.DM992_38940基因上下游同源臂基因克隆和纯化

DM992_38940基因的DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。使用在线引物设计软件primer 3，根据伯克霍尔德氏菌JP2-270基因组中DM992_38940基因及其上下游序列，设计DM992_38940框内基因缺失引物，为了不引起下游基因的移码突变，上游臂扩增引物反向引物序列的3’端最后一个碱基应位于DM992_38940起始密码ATG开始的3n处(n为自然数，3n代表碱基数量)。同理，下游臂扩增引物正向引物序列的5’端最后一个碱基应位于DM992_38940终止密码子TAA上游3n处。使用引物38940upF和38940upR扩增DM992_38940基因上游序列，使用引物38940dwF和38940dwR扩增DM992_38940基因下游序列。引物列表如表1所示。

表1引物列表

引物名称	序列(5’-3’)
		38940upF	ctatgacatgattacgaattcCACTGAAATCTGTCGCGGAGA
38940upR	tgaccgttgtaCATGTACGGATCGAGGCTCAG
		38940dwF	ccgtacatgTACAACGGTCAGGCGATTCC
38940dwR	cttgcatgcctgcaggtcgacTACGCCAGCTACAAGGACCG
		M13F	CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13R	AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

PCR反应体系：2×KOD One PCR Master Mix 25μL，正向引物(10mM)：1μL，反向引物(10mM)：1μL，模板0.5μL(约50ng DNA)，ddH₂O补足50μL。

PCR反应程序如下：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸5s，此过程进行35个循环；之后终延伸10min。

PCR反应结束后，将PCR产物分别经1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，在紫外光下分别切下所扩增的目的条带，用Axygen DNA凝胶回收试剂盒(AP-GX-50)进行胶回收处理，纯化后的基因片段(片段38940up(序列如SEQ ID No.3所示)、38940dw(序列如SEQ ID No.4所示))可以立即使用或于-20℃保存备用。

实施例2

1.重组质粒的构建

根据同源重组的原理，用ClonExpress II One Step Cloning Kit(C112-01)试剂盒，将纯化后的基因片段38940up和38940dw两个插入片段同时连接至制备的线性化pK18mobSacB载体上。按照说明书配制连接反应体系，将配好的连接反应体系轻轻混匀，37℃反应30min。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒。之后可将重组产物保存于-20℃备用或直接用于转化。

上述重组反应产物转化到E.coli DH5α感受态细胞。采用热激法转化，从转化筛选平板上随机挑取若干单菌落作为模板，以载体上的引物M13F和M13R做菌落PCR，验证两个插入片段是否同时插入到线性化的pK18mobSacB载体中。将PCR扩增结果为阳性的单菌落接种至含Km抗生素的LB液体培养基中，于37℃摇床中200rpm培养过夜，提取质粒送测序公司测序，将序列完全正确的质粒定名为pK18-38940(SEQ ID NO.5)保存进行下一步操作。

2.伯克霍尔德氏菌JP2-270同源重组双交换突变株的获得

采用电转化法，将pK18-38940转入伯克霍尔德氏菌JP2-270感受态细胞。通过Km抗性的筛选获得成功转入的单交换突变株，经过再次抗性验证后进行无抗性的松弛培养，吸取传6-8代后的菌液100μL，加入到900μL的LB液体培养基中稀释，连续稀释至10-8倍，后涂铺于无抗生素的LB平板上。待单克隆长出后，用牙签挑取单克隆同时划线接种于含Km抗性的LB平板和无抗性平板上(两个板上的克隆要一一对应)。28℃培养48h，挑取在Km平板上不生长而无抗性平板上生长的菌落进行菌落PCR验证，引物使用38940upF/38940dwR。以重组质粒载体和伯克霍尔德氏菌JP2-270基因组分别为阳性和阴性对照，扩增片段大小与重组质粒载体扩增片段大小一致的为正确的双交换突变株，而扩增片段大小与伯克霍尔德氏菌JP2-270基因组大小一致的为回复突变株。获得的双交换突变株定名为伯克霍尔德氏菌JP2-270Δ38940。

实施例3

伯克霍尔德氏菌JP2-270和伯克霍尔德氏菌JP2-270Δ38940比较代谢物差异分析。

使用PDA液体培养基对伯克霍尔德氏菌JP2-270和伯克霍尔德氏菌JP2-270Δ38940进行发酵，全细胞发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发，沉淀物用甲醇溶液溶解后进行高效液相色谱分析。色谱条件：安捷伦色谱柱Agilent Zorbax SB-C18，250×9.2mm，5μm，流速：1mL/min，流动相从90％水和10％甲醇开始，30min内流动相梯度升至100％甲醇，检测波长210nm左右。

如图1所示，JP2-270Δ38940和JP2-270的代谢物谱具有明显不同，JP2-270在24.611min有一个明显的特征峰，而JP2-270Δ38940在相同的时间段没有明显的对应峰。但是，JP2-270Δ38940在23.756min处有一明显的特征峰，在同样的时间段JP2-270却没有对应峰。表明DM992_38940基因的缺失导致了JP2-270中代谢物合成产生了明显差异。

实施例4

伯克霍尔德氏菌JP2-270和伯克霍尔德氏菌JP2-270Δ38940差异代谢物的结构鉴定。

为了确定DM992_38940基因突变所产生的新的液相峰是何种物质，我们对JP2-270在24.611min和JP2-270Δ38940在23.756min的液相峰进行了分离纯化和结构鉴定。

分离纯化：使用PDA液体培养基对JP2-270和JP2-270Δ38940进行发酵，发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发，沉淀物用甲醇溶液溶解后得到粗提物，粗提物经Sephadex LH-20(1g：50g)色谱柱分离，用100％甲醇洗脱，得到10个馏分(每个20mL)。第5馏分进一步用ODS(1g：50g)柱进行纯化，用80％的甲醇洗脱，得到12个馏分(每个20mL)，目标化合物在第5个馏分中纯化得到。得到的化合物经高效液相色谱分析(安捷伦1260型高效液相色谱仪，安捷伦色谱柱Zorbax SB-C18，250×9.2mm，5μm，流速：1mL/min；紫外波长：210nm)表明该化合物纯度大于92％。

实施例5

伯克霍尔德氏菌JP2-270和伯克霍尔德氏菌JP2-270Δ38940化合物结构鉴定。

化合物的结构是根据其紫外光谱、红外光谱、一维和二维核磁共振(NMR)光谱、高分辨质谱(HRESIMS)数据和单晶X-射线衍射等方法相结合而确定。

JP2-270在24.611min产生的代谢物分子式C₂₇H₃₉NO₈；[α]D²⁰+88.2(c 0.50，MeOH)；紫外光谱：UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.21)nm；红外光谱：IR(MeOH)ν_max2926，2855，1767，1692，1378，1263，1184，1151，1031，965cm^–1；高分辨质谱(附图2)：HRESIMS m/z[M+H]⁺506.2747(计算值C₂₇H₄₀NO₈ 506.2754)，[M+Na]⁺528.2567(计算值C₂₇H₃₉NNaO₈ 528.2573)。通过化合物的¹H谱(附图3)、¹³C谱(附图4)、HMQC谱(附图5)、HMBC谱(附图7)和COSY谱(附图9)分析，确定了化学结构，为剑兰制霉菌素，其¹³C和¹H核磁共振信号归属见表2。它的HMBC、COSY相关示意图见附图12。

表2剑兰制霉菌素和双氢剑兰制霉菌素¹³C和¹H NMR数据

^a,b,c标有相同字母a，b和c的¹³C和¹H NMR数据可能会互换。

JP2-270Δ38940在23.756min产生的代谢物分子式C₂₇H₃₇NO₈；[α]D²⁰+74.2(c0.50，MeOH)；紫外光谱：UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.20)nm；红外光谱：IR(MeOH)ν_max2927，2853，1767，1692，1378，1263，1186，1149，1035，967cm^–1；高分辨质谱(附图2)：HRESIMS m/z[M+Na]⁺526.2410(计算值C₂₇H₃₇NNaO₈ 526.2410)。通过化合物的¹H谱(附图3)、¹³C谱(附图4)、HMQC谱(附图6)、HMBC谱(附图8)和COSY谱(附图10)分析，确定了化学结构，为剑兰制霉菌素的双氢衍生物，我们命名为双氢剑兰制霉菌素(图11)，其¹³C和¹H核磁共振信号归属见表2。它的HMBC和COSY相关示意图见附图12。

DM992_38940基因突变后JP2-270产生的物质双氢剑兰制霉菌素比剑兰制霉菌素少了两个氢原子，双氢剑兰制霉菌素在C11和C12位是一双键，说明DM992_38940基因的功能是负责C11-C12位双键还原的。本申请提出了一种新的NADP(H)氧化还原酶，其在剑兰制霉菌素的合成过程中负责C11-C12位双键还原，在双氢剑兰制霉菌素转变成剑兰制霉菌素过程中起关键作用。该氧化还原酶具有双键还原作用，具有良好的应用潜力。

实施例6

化合物双氢剑兰制霉菌素在抗胶质瘤细胞U87MG和U251增殖方面的活性优于化合物剑兰制霉菌素(表3)。在制备治疗肿瘤疾病药物方面具有潜在价值。

表3剑兰制霉菌素和双氢剑兰制霉菌素对肿瘤细胞增殖的抑制活性

DOX：阿霉素(Doxorubicin)。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaccgcaa tgaatcgccg catcgtgctc gcctcgcggc cgaagcaggc gcccgagttg 60

ggcaacttcc ggctagaaga ggtgccgctc gtccagccgg gcgaggacca ggtgctggtc 120

cggcagcact acctgagcct cgatccgtac atgcgcgacc ggatgagcgt atccaagagc 180

tatgccgcgc cacaaccgct cgacgaggtg atgatcggcg gcacggtggg cgaggtgctg 240

gcctcgcgca acgcgcgctt caagcccggc gatttcgtgg tcggcatggg cggctggcag 300

gagtacgcgc tgctcgacgg cgccgaactc ggcggctggc gccacgtcga tccggcgcgc 360

gcgccgctgt cggcctacct cggcgccgtc ggcatgcccg gtgtgaccgc gtggtacggc 420

ctcgcgcgca tcatcgcgcc gcagcccggc gagaccgtcg tgatcagctc cgcggccggc 480

gcggtgggcg gcgccgccgg ccagctggcg cgggcgcgcg gcgcgcgggt ggtcggcatc 540

gcaggcggcc cgaagaagtg cgcgtacgtg gtggaggagc tcggctttga cgcctgcctc 600

gaccatcacc agtacggcga tctcaagtcg atgagcgccg cgctgaatcg cgcctgtccg 660

gacggaatcg acggctattt cgagaacgtc ggcgggatgc tgctcgacgc cgtgctgatg 720

cgctgcaacc cgttcgcgcg cgtggcgctg tgcgggatga tcgccggcta caacggtcag 780

gcgattccgc tcaccatgcc gcaattgctg ctgatcaatc gggtccggct cgaaggcttc 840

atcatcgcgg accagggtga cgcctggttc gacgcgctcg aggaactcgg cgcgctggtg 900

gcggccggca agctgcgcta tcacgagtcc gtcgcagacg gcctcgcgcg cgcgcccgag 960

gcgttcatca cgctgctcgg cggcggcggt cacggcaaac aggtggtgaa gctcctggct 1020

tga 1023

<210> 2

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Ala Met Asn Arg Arg Ile Val Leu Ala Ser Arg Pro Lys Gln

1 5 10 15

Ala Pro Glu Leu Gly Asn Phe Arg Leu Glu Glu Val Pro Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Glu Asp Gln Val Leu Val Arg Gln His Tyr Leu Ser Leu Asp

35 40 45

Pro Tyr Met Arg Asp Arg Met Ser Val Ser Lys Ser Tyr Ala Ala Pro

50 55 60

Gln Pro Leu Asp Glu Val Met Ile Gly Gly Thr Val Gly Glu Val Leu

65 70 75 80

Ala Ser Arg Asn Ala Arg Phe Lys Pro Gly Asp Phe Val Val Gly Met

85 90 95

Gly Gly Trp Gln Glu Tyr Ala Leu Leu Asp Gly Ala Glu Leu Gly Gly

100 105 110

Trp Arg His Val Asp Pro Ala Arg Ala Pro Leu Ser Ala Tyr Leu Gly

115 120 125

Ala Val Gly Met Pro Gly Val Thr Ala Trp Tyr Gly Leu Ala Arg Ile

130 135 140

Ile Ala Pro Gln Pro Gly Glu Thr Val Val Ile Ser Ser Ala Ala Gly

145 150 155 160

Ala Val Gly Gly Ala Ala Gly Gln Leu Ala Arg Ala Arg Gly Ala Arg

165 170 175

Val Val Gly Ile Ala Gly Gly Pro Lys Lys Cys Ala Tyr Val Val Glu

180 185 190

Glu Leu Gly Phe Asp Ala Cys Leu Asp His His Gln Tyr Gly Asp Leu

195 200 205

Lys Ser Met Ser Ala Ala Leu Asn Arg Ala Cys Pro Asp Gly Ile Asp

210 215 220

Gly Tyr Phe Glu Asn Val Gly Gly Met Leu Leu Asp Ala Val Leu Met

225 230 235 240

Arg Cys Asn Pro Phe Ala Arg Val Ala Leu Cys Gly Met Ile Ala Gly

245 250 255

Tyr Asn Gly Gln Ala Ile Pro Leu Thr Met Pro Gln Leu Leu Leu Ile

260 265 270

Asn Arg Val Arg Leu Glu Gly Phe Ile Ile Ala Asp Gln Gly Asp Ala

275 280 285

Trp Phe Asp Ala Leu Glu Glu Leu Gly Ala Leu Val Ala Ala Gly Lys

290 295 300

Leu Arg Tyr His Glu Ser Val Ala Asp Gly Leu Ala Arg Ala Pro Glu

305 310 315 320

Ala Phe Ile Thr Leu Leu Gly Gly Gly Gly His Gly Lys Gln Val Val

325 330 335

Lys Leu Leu Ala

340

<210> 3

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cactgaaatc tgtcgcggag acaaacccga tgaattccac cagcctgcaa acgatccgcc 60

tgatcgccgt cgatctcgac ggcccgttgc tgatcgacac attcagcccg atcatgcaca 120

agctgtgcag cgagtattac cggatcgact acacgcgcga actggagcgc aacaccttct 180

cgcgctcgcg cgccgaggtg gtggagtacc ttcgccggaa gatcggcgag cagatgagcg 240

agaccgagcg caaacagagt gacgaggaga gcatcgctag ctatttccac taccgcgacg 300

aatacatgcg tgaccacccg cacggcatga agcccgaggt gcccgcgttc ctcgatctgc 360

tgacctcgct cggcgtgacg gtgatctgct acggcggcct cgacgaggac tacatgcgcc 420

gcgcgctcgg cgaacaggcc gcgcgcttcg ccacctacat ctgcaccaac gagttccgtc 480

ccggcgtgcg cgagatcgtg cgcgacttct acaagctggc gccgcatcag gcgctgttca 540

tcgacgacgt gaacttcgtg gccgagcacg ccaaggcgct cggcacgcca ttcatcggcg 600

tgccgtcgaa cgagccctgg agctggcaaa agcgcgacat ggaggagacc ggcgtgcgcc 660

gcatcgtcga ttcggtgagc cgaatcgatc tggccttgct gcaggagatc gatgccgccg 720

ccgcgcacgg aggtggctgg tgagccccgc ccgcgagcgt cgggggaggg ccgcgccatg 780

accgcaatga atcgccgcat cgtgctcgcc tcgcggccga agcaggcgcc cgagttgggc 840

aacttccggc tagaagaggt gccgctcgtc cagccgggcg aggaccaggt gctggtccgg 900

cagcactacc tgagcctcga tccgtacatg 930

<210> 4

<211> 982

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tacaacggtc aggcgattcc gctcaccatg ccgcaattgc tgctgatcaa tcgggtccgg 60

ctcgaaggct tcatcatcgc ggaccagggt gacgcctggt tcgacgcgct cgaggaactc 120

ggcgcgctgg tggcggccgg caagctgcgc tatcacgagt ccgtcgcaga cggcctcgcg 180

cgcgcgcccg aggcgttcat cacgctgctc ggcggcggcg gtcacggcaa acaggtggtg 240

aagctcctgg cttgacggcg gggacggggc gcgacggcgg tatggcgcgc gcctgcagtc 300

ggagatgact gtgcggagca ccgacatatg tgatttgaca ttaatgcaat tggcgtgccc 360

agggatgtag gcgctagatt gaaatgtctg ccttgggggt gcggcggaat tcttggacta 420

tttgggagct agtccatgta ctcatacgaa gaacgcatcc gagcagtcaa gctctacttg 480

aagcttggaa agcgccttac cgcgaccgtt tgtgaacctg tccgcatttt tgtgggcgag 540

gcggttgaac aacaggttat ccacgcgcct gcgtaaaccg ttcgccgaac agaatagcaa 600

actggttcat cgctgatttc cagtcgaagg cggccctcac ggtcttggcc agtacgttgc 660

gcagcgccag ccagagcagc ttgatggccg cctcgtcgtt cgggaagtga ccgcgcgtct 720

tgatgatctt gcgcaattgc atgttcaagc tctcgatggc gtttgtcgta taaacgactc 780

gccgaatttc cggcgggaac acgtagaacg gcacgacgtg ctcccacgcg cgttgccacg 840

actgcacgat cgtcgggtac ttcgcgcccc aaggtccgtc ggcgaagtct tgcagcgctt 900

gccttgctgc ctcttcgctg gcagccgcgt agatcgggcg cagcgccgtg gcgagtacct 960

tgcggtcctt gtagctggcg ta 982

<210> 5

<211> 7603

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgccgcaagc actcagggcg caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt 60

ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa 120

aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac 180

tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 240

gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 300

aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 360

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 420

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 480

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactccaaga cgaggcagcg 540

cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 600

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 660

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 720

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 780

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 840

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcggatgc ccgacggcga ggatctcgtc 900

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 960

ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 1020

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 1080

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 1140

gcgggactct ggggttcgct agaggatcga tcctttttaa cccatcacat atacctgccg 1200

ttcactatta tttagtgaaa tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc 1260

aactttatgc ccatgcaaca gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag 1320

attttttagt tctttaggcc cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa 1380

agaggaaaat agaccagttg caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta 1440

aatcgcgcgg gtttgttact gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt 1500

gtatactttg gcgtcacccc ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact 1560

tgccatcttc aaacaggagg gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg 1620

agacatgaac gatgaacatc aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta 1680

ccgcactgct ggcaggaggc gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat 1740

ataaggaaac atacggcatt tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac 1800

agcaaaaaaa tgaaaaatat caagtttctg aatttgattc gtccacaatt aaaaatatct 1860

cttctgcaaa aggcctggac gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg 1920

tcgcaaacta tcacggctac cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg 1980

atgacacatc gatttacatg ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga 2040

aaaacgctgg ccgcgtcttt aaagacagcg acaaattcga tgcaaatgat tctatcctaa 2100

aagaccaaac acaagaatgg tcaggttcag ccacatttac atctgacgga aaaatccgtt 2160

tattctacac tgatttctcc ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag 2220

ttaacgtatc agcatcagac agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa 2280

tctttgacgg tgacggaaaa acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact 2340

acagctcagg cgacaaccat acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca 2400

aatacttagt atttgaagca aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt 2460

tatttaacaa agcatactat ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac 2520

ttctgcaaag cgataaaaaa cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg 2580

agctaaacga tgattacaca ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag 2640

taacagatga aattgaacgc gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca 2700

ctgactcccg cggatcaaaa atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc 2760

ttggttatgt ttctaattct ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg 2820

tgttaaaaat ggatcttgat cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac 2880

ctcaagcgaa aggaaacaat gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg 2940

cagacaaaca atcaacgttt gcgccgagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat 3000

ctgttgtcaa agacagcatc cttgaacaag gacaattaac agttaacaaa taaaaacgca 3060

aaagaaaatg ccgatgggta ccgagcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat 3120

cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 3180

gggacgccct cgcggacgtg ctcatagtcc acgacgcccg tgattttgta gccctggccg 3240

acggccagca ggtaggccga caggctcatg ccggccgccg ccgccttttc ctcaatcgct 3300

cttcgttcgt ctggaaggca gtacaccttg ataggtgggc tgcccttcct ggttggcttg 3360

gtttcatcag ccatccgctt gccctcatct gttacgccgg cggtagccgg ccagcctcgc 3420

agagcaggat tcccgttgag caccgccagg tgcgaataag ggacagtgaa gaaggaacac 3480

ccgctcgcgg gtgggcctac ttcacctatc ctgcccggct gacgccgttg gatacaccaa 3540

ggaaagtcta cacgaaccct ttggcaaaat cctgtatatc gtgcgaaaaa ggatggatat 3600

accgaaaaaa tcgctataat gaccccgaag cagggttatg cagcggaaaa gcgctgcttc 3660

cctgctgttt tgtggaatat ctaccgactg gaaacaggca aatgcaggaa attactgaac 3720

tgaggggaca ggcgagagac gatgccaaag agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa 3780

tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc 3840

aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg 3900

atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcggcgc aaagtgcgtc 3960

gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg tttttgaggt gctccagtgg 4020

cttctgtttc tatcagctcc tgaaaatctc gataactcaa aaaatacgcc cggtagtgat 4080

cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc gatcaacgtc tcattttcgc 4140

caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac caggatttat ttattctgcg 4200

aagtgatctt ccgtcacagg tatttattcg gcgcaaagtg cgtcgggtga tgctgccaac 4260

ttactgattt agtgtatgat ggtgtttttg aggtgctcca gtggcttctg tttctatcag 4320

ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaaaagg 4380

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 4440

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4500

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 4560

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4620

ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4680

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4740

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4800

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4860

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4920

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4980

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 5040

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5100

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 5160

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 5220

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 5280

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 5340

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 5400

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 5460

ggaaacagct atgacatgat tacgaattcc actgaaatct gtcgcggaga caaacccgat 5520

gaattccacc agcctgcaaa cgatccgcct gatcgccgtc gatctcgacg gcccgttgct 5580

gatcgacaca ttcagcccga tcatgcacaa gctgtgcagc gagtattacc ggatcgacta 5640

cacgcgcgaa ctggagcgca acaccttctc gcgctcgcgc gccgaggtgg tggagtacct 5700

tcgccggaag atcggcgagc agatgagcga gaccgagcgc aaacagagtg acgaggagag 5760

catcgctagc tatttccact accgcgacga atacatgcgt gaccacccgc acggcatgaa 5820

gcccgaggtg cccgcgttcc tcgatctgct gacctcgctc ggcgtgacgg tgatctgcta 5880

cggcggcctc gacgaggact acatgcgccg cgcgctcggc gaacaggccg cgcgcttcgc 5940

cacctacatc tgcaccaacg agttccgtcc cggcgtgcgc gagatcgtgc gcgacttcta 6000

caagctggcg ccgcatcagg cgctgttcat cgacgacgtg aacttcgtgg ccgagcacgc 6060

caaggcgctc ggcacgccat tcatcggcgt gccgtcgaac gagccctgga gctggcaaaa 6120

gcgcgacatg gaggagaccg gcgtgcgccg catcgtcgat tcggtgagcc gaatcgatct 6180

ggccttgctg caggagatcg atgccgccgc cgcgcacgga ggtggctggt gagccccgcc 6240

cgcgagcgtc gggggagggc cgcgccatga ccgcaatgaa tcgccgcatc gtgctcgcct 6300

cgcggccgaa gcaggcgccc gagttgggca acttccggct agaagaggtg ccgctcgtcc 6360

agccgggcga ggaccaggtg ctggtccggc agcactacct gagcctcgat ccgtacatgt 6420

acaacggtca ggcgattccg ctcaccatgc cgcaattgct gctgatcaat cgggtccggc 6480

tcgaaggctt catcatcgcg gaccagggtg acgcctggtt cgacgcgctc gaggaactcg 6540

gcgcgctggt ggcggccggc aagctgcgct atcacgagtc cgtcgcagac ggcctcgcgc 6600

gcgcgcccga ggcgttcatc acgctgctcg gcggcggcgg tcacggcaaa caggtggtga 6660

agctcctggc ttgacggcgg ggacggggcg cgacggcggt atggcgcgcg cctgcagtcg 6720

gagatgactg tgcggagcac cgacatatgt gatttgacat taatgcaatt ggcgtgccca 6780

gggatgtagg cgctagattg aaatgtctgc cttgggggtg cggcggaatt cttggactat 6840

ttgggagcta gtccatgtac tcatacgaag aacgcatccg agcagtcaag ctctacttga 6900

agcttggaaa gcgccttacc gcgaccgttt gtgaacctgt ccgcattttt gtgggcgagg 6960

cggttgaaca acaggttatc cacgcgcctg cgtaaaccgt tcgccgaaca gaatagcaaa 7020

ctggttcatc gctgatttcc agtcgaaggc ggccctcacg gtcttggcca gtacgttgcg 7080

cagcgccagc cagagcagct tgatggccgc ctcgtcgttc gggaagtgac cgcgcgtctt 7140

gatgatcttg cgcaattgca tgttcaagct ctcgatggcg tttgtcgtat aaacgactcg 7200

ccgaatttcc ggcgggaaca cgtagaacgg cacgacgtgc tcccacgcgc gttgccacga 7260

ctgcacgatc gtcgggtact tcgcgcccca aggtccgtcg gcgaagtctt gcagcgcttg 7320

ccttgctgcc tcttcgctgg cagccgcgta gatcgggcgc agcgccgtgg cgagtacctt 7380

gcggtccttg tagctggcgt gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt 7440

ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 7500

ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 7560

ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgataa gctagcttca cgc 7603

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctatgacatg attacgaatt ccactgaaat ctgtcgcgga ga 42

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaccgttgt acatgtacgg atcgaggctc ag 32

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgtacatgt acaacggtca ggcgattcc 29

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttgcatgcc tgcaggtcga ctacgccagc tacaaggacc g 41

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcggataac aatttcacac agga 24

Claims

1.一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )，命名为伯克霍尔德氏菌JP2-270Δ38940，由伯克霍尔德氏菌JP2-270敲除了DM992_38940基因得到，所述伯克霍尔德氏菌JP2-270保藏编号为CCTCC NO：M 2018703，双氢剑兰制霉菌素的化学结构式如式Ⅰ所示：

DM992_38940基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，其特征在于，将基因序列如SEQ ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如SEQ ID NO.4所示的插入基因片段38940dw同时连接至制备的线性化pK18mobSacB载体上，制备用于DM992_38940基因敲除质粒pK18-38940，将质粒pK18-38940转入伯克霍尔德氏菌JP2-270感受态细胞，筛选获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，其中质粒pK18-38940的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

3.如权利要求1或2所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌在制备双氢剑兰制霉菌素中的应用；所述双氢剑兰制霉菌素的化学结构式如式Ⅰ所示：

4.权利要求1所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌的制备方法，其特征在于，将伯克霍尔德氏菌JP2-270中DM992_38940基因敲除，获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。

5.如权利要求4所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌的制备方法，其特征在于，基因敲除时，将基因序列如SEQ ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如SEQ ID NO.4所示的插入基因片段38940dw同时连接到制备的线性化pK18mobSacB载体上，制备用于基因敲除的质粒pK18-38940，将质粒pK18-38940转入伯克霍尔德氏菌JP2-270感受态细胞，筛选得到用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。

6.一种用于制备双氢剑兰制霉菌素的方法，其特征在于，发酵培养权利要求1或2所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌后，将获得的发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发并收集沉淀物，沉淀物用甲醇溶液溶解后得到粗提物；粗提物依次经Sephadex LH-20色谱柱分离和ODS柱纯化得到双氢剑兰制霉菌素；所述双氢剑兰制霉菌素的化学结构式如式Ⅰ所示：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述粗提物经Sephadex LH-20色谱柱分离，用无水甲醇洗脱，得到10个馏分；将第5馏分进一步用ODS柱进行纯化，用80％的甲醇洗脱，得到12个馏分，在第5个馏分中得到双氢剑兰制霉菌素。

8.一种抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，肿瘤类型为胶质瘤；所述抗肿瘤化合物，命名为双氢剑兰制霉菌素，其化学结构式如式Ⅰ所示：