CN113755517B

CN113755517B - 一种slcg_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法与应用

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Publication number: CN113755517B
Application number: CN202111210912.8A
Authority: CN
Inventors: 吴杭; 许婉莲; 张部昌; 李秉霖; 伊静; 蔡新露
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2021-10-18
Filing date: 2021-10-18
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-10-18
Also published as: CN113755517A

Abstract

本发明提供了一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其通过基因工程途径使林可链霉菌中Lrp家族转录调控基因SLCG_5407缺失，继而获得目标所需的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌；其中，所述SLCG_5407基因的序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种上述构建方法得到的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的应用。本发明通过基因工程技术在林可链霉菌中失活SLCG_5407，能够获得林可霉素高产工程菌株，为提高林可霉素发酵产量提供技术支持。

Description

一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法与应用。

背景技术

林可霉素(lincomycin)在工业生产上主要由林可链霉菌(Streptomyceslincolnensis)发酵产生，是一种林可酰胺类抗生素，其活性A组分用于治疗金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌和某些厌氧的革兰氏阴性菌所引起的感染。林可霉素通过与细菌核糖体50s亚基中的23srRNA的中心环疏水结合，阻止肽链延长，以达到抑菌效果。林可霉素衍生物，特别是克林霉素，在治疗由厌氧菌引起的感染较林可霉素更加有效。我国是林可霉素原料药的最大生产国和主要出口国之一，但相比国外先进水平，工业发酵产量并不理想。由此可见，提高林可霉素的发酵产率具有重要的经济价值，有助于提升我国相关企业的核心竞争力。

过去，林可霉素工业生产菌株主要通过物理或化学诱变方法获得，而传统的诱变技术不但耗时耗力，且随机性较大，无法对林可霉素高产的精准高效育种提供理论指导。本发明目的就是通过基因工程技术定向改造林可链霉菌的编码基因，进而获得林可霉素高产工程菌株，用于高效生产林可霉素或其合成过程中的产物。

亮氨酸应答调控蛋白(Leucine responsive regulatory protein,Lrp)存在于原核生物中，是一类重要的转录调控因子，主要通过应答氨基酸等配体参与代谢过程。近年来研究发现，Lrp可控制放线菌中多样的生理代谢过程，包括抗生素生物合成、菌丝体形态分化、氨基酸代谢、细菌持久性和毒力等。产抗生素放线菌中普遍分布Lrp家族蛋白，如SACE_Lrp、SACE_5717、SLCG_Lrp等，对其进行改造可提高相应抗生素的产量，暗示其在抗生素高产育种中的普遍重要性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种Lrp家族转录调控基因SLCG_5407改造型林可链霉菌的构建方法与应用，利用该SLCG_5407基因改造型林可链霉菌生产林可霉素，可大大提高林可霉素的产量。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，通过基因工程途径使林可链霉菌中Lrp家族转录调控基因SLCG_5407缺失，继而获得目标所需的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌；其中，所述SLCG_5407基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的优选方式之一，所述SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建，以林可链霉菌LCGL为出发菌株。

作为本发明的优选方式之一，所述SLCG_5407基因的产物用于负向调控林可霉素生物合成。

作为本发明的优选方式之一，包括如下具体步骤：

(1)以林可链霉菌LCGL基因组为模板，以5407-p1、5407-p2、5407-p3和5407-p4为引物，分别扩增SLCG_5407基因的上、下游同源片段；

所述5407-p1、5407-p2、5407-p3和5407-p4引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；

(2)将扩增后、回收好的SLCG_5407基因上下游同源片段分别进行双酶切处理后连接到pKC1139载体上，得到pKC1139-Δ5407质粒；

(3)将pKC1139-Δ5407质粒通过PEG3350介导转化到林可链霉菌LCGL原生质体中，待其同源重组后，筛选得到缺失SLCG_5407基因的突变株ΔSLCGL_5407，即目标菌株。

作为本发明的优选方式之一，该方法同样适用于工业高产菌株LA219X(本领域可直接购买得到的菌株)，即：以工业高产菌株LA219X为出发菌株，并通过基因工程途径使林可链霉菌LA219X中Lrp家族转录基因SLCG_5407缺失，继而获得目标所需的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌LA219X。

一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的应用，将通过上述构建方法得到的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌用于林可霉素的发酵生产。

本发明相比现有技术的优点在于：

本发明研究筛选到了林可霉素生物合成负调控子SLCG_5407，通过基因工程技术在林可链霉菌中失活SLCG_5407，能够获得林可霉素高产工程菌株，为提高林可霉素发酵产量提供技术支持。

经研究，在林可链霉菌LCGL中敲除SLCG_5407时林可霉素产量提高了25％，而在ΔSLCGL_5407突变株中回补SLCG_5407基因，林可霉素产量得到恢复，表明SLCG_5407是一个参与林可霉素生物合成的负调控因子；且该方法同样适用于工业高产菌株LA219X，使其林可霉素产量提高12.1％。

附图说明

图1是SLCG_5407基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息；

图2是ΔSLCGL_5407突变株的构建示意图；

图3是ΔSLCGL_5407突变株的PCR鉴定结果图(图3中，SLCG_5407基因未敲除-909bp；SLCG_5407基因敲除后-189bp；M：5000bp DNA Marker)；

图4是ΔSLCGL_5407/pIB139-5407回复菌株的PCR鉴定图(图4中，PCR产物为安普霉素抗性基因-776bp；并且，M：5000bp DNA Marker；+：pIB139；-：水；1：ΔSLCGL_5407/pIB139-5407；2：ΔSLCGL_5407/pIB139)；

图5是LCGL/pIB139-5407过表达菌株的PCR鉴定图(图5中，PCR产物为安普霉素抗性基因-776bp；并且，M：5000bp DNA Marker；+：pIB139；-：水；1：LCGL/pIB139-5407；2：LCGL/pIB139)；

图6是LCGL及其ΔSLCGL_5407突变株的林可霉素产量分析图；

图7是出发菌株LCGL、缺失突变株ΔSLCGL_5407、缺失回补菌株ΔSLCGL_5407/pIB139-5407及回补空载对照菌株ΔSLCGL_5407/pIB139、过表达菌株LCGL/pIB139-5407及过表达空载对照菌株LCGL/pIB139林可霉素的HPLC产量分析图；

图8是ΔSLCGL_5407突变株和出发菌株LCGL菌株的孢子生长情况图(图8中，左：ΔSLCGL_5407突变株，右：LCGL菌株)；

图9是ΔSLCGL_5407突变株和出发菌株LCGL菌株菌丝体干重测定图；

图10是LA219XΔ5407突变株的PCR鉴定图(图10中，M：5000bp DNA Marker；+：pKC1139-Δ5407质粒；-：LA219X基因组；1：阳性克隆)；

图11是LA219X及其LA219XΔ5407突变株中林可霉素产量的HPLC产量分析图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中使用到的菌株和质粒见表1，合成的引物序列见表2。其中，出发菌株-林可链霉菌LCGL为林可链霉菌LC-G(GenBank:CP022744.1)基础上改进获得的菌株，具体为：将林可链霉菌LC-G的SLCG_7011基因(GenBank:AXG58166.1)替换为4×attBΦC31；所述4×attBΦC31为一段包含4个attBΦC31位点序列的240bp碱基，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

下述实施例中使用到的大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。林可霉素产生菌林可链霉菌在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSBY)培养基或在含有1.8％琼脂的改良高氏一号(MGM)平板上培养。

下述实施例中使用到的PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋白氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和林可链霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1研究中所用的菌种和质粒

表2研究中所用的引物

实施例1

SLCG_5407基因的相关信息：

根据基因组注释信息可知SLCG_5407基因长度为1161bp，蛋白单体大小为40.2KDa。SLCG_5407基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

根据氨基酸序列比对发现，SLCG_5407为Lrp家族调控因子。Lrp一般在15-18kDa，其序列同源性较低，其中N端HTH结构域，与靶DNA结合；C端为配体结合结构域，具有典型的αβ-三明治折叠结构，除了促进配体结合，还可介导多聚体如四聚体、八聚体和十六聚体的形成。Lrp的C末端结构域也称为RAM(Regulation of amino acid metabolism)结构域，通常可响应氨基酸配体。将SLCG_5407与一些常见放线菌Lrp的周边信息进行比对后发现：SLCG_5407的周边基因编码一些保守蛋白和酶，而常见放线菌Lrp的周边基因编码一些分支氨基酸或赖氨酸外排蛋白，这种差异表明SLCG_5407可能不是通过影响氨基酸的外排来调控林可霉素的生物合成，这其中可能存在着新的调控机制。

实施例2

SLCG_5407基因缺失突变株ΔSLCGL_5407的构建(参见图2)：

(1)为了敲除林可链霉菌中的SLCG_5407基因，以林可链霉菌LCGL的基因组DNA为模板，分别以5407-p1/5407-p2(序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示)和5407-p3/5407-p4(序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示)为引物对，PCR扩增出SLCG_5407基因的约1.9kb的上下游同源臂。

(2)用HindIII、XbaI和EcoRI、XbaI酶切上下游同源臂后回收；同时用HindIII和EcoRI酶切敲除载体pKC1139并回收；将回收后的上下游同源臂和pKC1139质粒连接后转入DH5α中，通过PCR和酶切鉴定，获得pKC1139-Δ5407。

(3)将构建好的质粒pKC1139-Δ5407转入到制备好的林可链霉菌LCGL原生质体中，然后涂布于无抗R5固体平板上(倒板吹干后放置37℃烘箱48h左右)，放入30℃恒温培养箱中培养大约20h后加入安普霉素(Apramycin)的无菌水覆盖，继续30℃培养到96-120h会有单克隆长出。

将长出的单克隆转接至含50μg/mL安普霉素的小斜面中富集，30℃培养96-120h会有连续孢子长出。取少量孢子于500μL无菌水中，吹吸均匀后取20μL混合液置于无抗的MGM平板中，划线法稀释混合液，然后置于37℃置恒温培养箱中培养96-120h完成质粒的松弛与丢失。当平板中有单克隆长出时，挑单孢一半于无抗小斜面中，一半于含50μg/mL安普霉素的小斜面中，30℃培养96-120h。将安普霉素小斜面中不长，且无抗小斜面中生长的菌株刮取少量孢子进行菌液PCR。

以5407-P5(如SEQ ID NO.8所示)和5407-P6(如SEQ ID NO.9所示)作为鉴定引物，阳性对照的模板为pKC1139-Δ5407质粒，阴性对照的模板为LCGL基因组，根据PCR产物的大小我们获得了ΔSLCGL_5407缺失突变株(见图3)。

实施例3

SLCG_5407基因回复菌株ΔSLCGL_5407/pIB139-5407的构建：

(1)以林可链霉菌LCGL基因组DNA为模板，以5407-P7、5407-P8(分别如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11所示)为引物，进行PCR扩增，获得完整的SLCG_5407片段。

(2)用NdeI和XbaI处理SLCG_5407片段和整合型载体pIB139，连接并转化进入DH5α中，挑取单克隆依次进行菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；测序正确表明成功获得回补质粒pIB139-5407。

(3)通过PEG介导的原生质体转化方法将pIB139-5407导入ΔSLCGL_5407原生质体中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因(aac(3)IV)为对象，Apr-P1、Apr-P2(序列分别如SEQ ID NO.12、如SEQ ID NO.13所示)为鉴定引物，进行PCR鉴定，获得回复菌株，命名为ΔSLCGL_5407/pIB139-5407。ΔSLCGL_5407/pIB139-5407回复菌株的PCR鉴定见图4。

实施例4

出发菌LCGL中过表达SLCG_5407基因：

pIB139-5407通过PEG介导的原生质体转化技术导入林可链霉菌LCGL原生质体中，以安普霉素抗性基因(aac(3)IV)为对象，Apr-P1、Apr-P2(序列分别如SEQ ID NO.12、如SEQID NO.13所示)为鉴定引物，进行PCR鉴定，获得阳性菌株命名为LCGL/pIB139-5407。LCGL/pIB139-5407过表达菌株的PCR鉴定见图5。

实施例5

林可链霉菌发酵产物HPLC检测：

林可链霉菌在斜面培养基上培养168h后，挖1cm²接种于种子培养基，在30℃，240rpm振荡培养48h后，转接至发酵培养基，30℃，240rpm振荡培养168h，然后取2mL菌液12000rpm离心10min；再取200μL上清加800μL乙醇混匀，12000rpm离心10min；最后将上清通过有机滤膜注入检测瓶中进行产量检测。

其中，LCGL及其ΔSLCGL_5407突变株的林可霉素HPLC产量结果见图6；出发菌株LCGL、缺失突变株ΔSLCGL_5407、回复菌株ΔSLCGL_5407/pIB139-5407及回复空载对照菌株ΔSLCGL_5407/pIB139、过表达菌株LCGL/pIB139-5407及过表达空载对照菌株LCGL/pIB139林可霉素的HPLC综合结果见图7。

实施例6

林可链霉菌菌丝体生物量检测：

以相同的接种量分别将ΔSLCGL_5407突变株与LCGL接种于30mL的液体TSBY中，30℃摇床培养48h后，取等量的LCGL和ΔSLCGL_5407新鲜菌液于YMG培养基中，30℃，240rpm培养168h，期间每隔24h取出1mL菌液置于-80℃冰箱中保存(期间，ΔSLCGL_5407突变株和出发菌株LCGL菌株的孢子生长情况见图8)。

待发酵完成后，将七天的样品12000rpm离心10min，弃上清；加入无水乙醇1mL洗涤菌体，12000rpm离心10min，弃上清；将湿润的菌体置于65℃烘箱中放置48h后称重，记录菌体质量。

将ΔSLCGL_5407和LCGL的菌体干重根据生长时间绘制菌体生物量曲线，如图9所示。

实施例7

林可霉素工业高产菌株LA219XΔ5407缺失突变株的构建及HPLC检测：

在林可霉素工业高产菌株LA219X中缺失SLCG_5407，验证正确菌株命名为LA219XΔ5407缺失突变株。并将LA219X高产菌株与LA219XΔ5407缺失突变株的发酵产物进行HPLC检测。突变株构建过程和HPLC检测参考上述实施例。其中，(A)LA219XΔ5407突变株的PCR鉴定结果见图10，LA219X及其LA219XΔ5407突变株中林可霉素产量的HPLC分析结果见图11。

实施例8

本实施的一种上述实施例的结果分析：

1、ΔSLCGL_5407突变株较出发菌株LCGL林可霉素产量提高

SLCG_5407与邻近基因在林可链霉菌染色体上的位置如图1。SLCG_5407基因缺失突变株ΔSLCGL_5407构建过程如图2。SLCG_5407基因缺失突变体在含有50μg/mL安普霉素的MGM平板上筛选并通过PCR证实(图3)。ΔSLCGL_5407在发酵培养基中发酵168h后，经HPLC检测林可霉素产量，发现ΔSLCGL_5407较出发菌株LCGL的产量提高了25％(图6)，HPLC结果表明SLCG_5407是参与林可霉素生物合成的负调控子。

2、缺失SLCG_5407对孢子形态分化及菌体生长的影响

为了确定SLCG_5407基因是否调控菌体的孢子形成，将突变株ΔSLCGL_5407和对照菌株LCGL同时涂于MGM平板上，30℃培养48h和72h，观察菌株孢子生长情况。结果显示相比于LCGL，ΔSLCGL_5407突变株的孢子形态无明显差异(图8)，说明SLCG_5407基因的缺失不影响孢子的形成。测定发酵168h的ΔSLCGL_5407突变株与LCGL菌株的菌体干重，绘制相应变化曲线，结果显示ΔSLCGL_5407较LCGL的生物量差异不大(图9)，暗示着SLCG_5407基因的缺失并未影响菌体的初级代谢。

3、SLCG_5407基因回复与过表达

为了验证突变体ΔSLCGL_5407中林可霉素产量的提高是因为SLCG_5407基因缺失引起的，将SLCG_5407基因表达载体pIB139-5407和pIB139(作为对照)，分别导入ΔSLCGL_5407突变株和出发菌株LCGL的原生质体中，获得回复菌株及空载ΔSLCGL_5407/pIB139-5407、ΔSLCGL_5407/pIB139，过表达菌株及空载LCGL/pIB139-5407、LCGL/pIB139，PCR鉴定结果如图4、5。后将LCGL及ΔSLCGL_5407系列突变株进行摇瓶发酵，HPLC检测结果显示：ΔSLCGL_5407的林可霉素产量较LCGL升高25％；回复菌株ΔSLCGL_5407/pIB139-5407的林可霉素产量较LCGL基本恢复；LCGL/pIB139-5407的林可霉素产量相比于LCGL降低约25％(图7)；HPLC检测结果进一步表明SLCG_5407基因能够负调控林可霉素的生物合成。

4、缺失SLCG_5407的工程菌株LA219XΔ5407可使林可霉素产量提高

LA219XΔ5407构建方法参照ΔSLCGL_5407，其突变株PCR鉴定如图10。后将LA219XΔ5407突变株及工业菌株LA219X涂板活化，然后分别接入工业种子培养基的摇瓶中，30℃、240rpm下培养48h后，转接发酵培养基中，继续培养168h。发酵结束后，通过发酵液的萃取浓缩和HPLC分析，相比较LA219X，LA219XΔ5407的林可霉素产量提高了12.1％(图11)。这说明高产菌株LA219中SLCG_2919基因同样参与调节林可霉素的产量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽大学

<120> 一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法与应用

<130> 2021

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1116

<212> DNA

<213> 林可链霉菌（Streptomyces lincolnensis）

<400> 1

atggacgaca tgacggctct ggacgatgac gacctcgacc tcgtcgccgc gctccagcac 60

gccccgcggg ccccgctgag cctgctggcg gaggtgctgg gggtctcggc gagcaccgcg 120

ggccgccggc tggcccggct ggagtcggac cggctgctgc gggtgatcgg ccagctcgac 180

tggtcggtgt ccggcgaggg caacccgtgg cacgtgtggg tgacggcgga acccggccgc 240

gccccggagg tcgcccgccg tctggccgac cttcccgaga ccagccacgc ggcggtcacc 300

gcgggccact cggacgtcta ctgcgccgtc cagccggccc gccgcgaccg caccaccgac 360

ctgctgtccc gcaccatccc cgccaccccc ggagtccgct cggcccgctc cgaactcatc 420

ctgtcggcca ccaccaagtc cgactcctgg cgcctgccgc ggctgaccga ggaccaggtg 480

cggcggctca ccgagcacgc ggcccccgac cgcgcggtcg atcccccgcc ccaccacacc 540

gccctcaccg acgacgaact gcgcaccctg cggctgctcg ccaccgacgc ccgctcgtcc 600

gccgcccagg tcgcccgcga gctcggcatc ggccagtcca ccgcctaccg caccacccag 660

tccctgctcc ggcgcggcct ggtccgcccc cgcgtggagg tcgaaccggg cctgctcggc 720

tacgccctgg aggtcgcgat caccctgacg gtcgccccga gcgcgacggc cgggctggcc 780

cgctcgctcg cccggcaccc ctcggcccgg tacgtggtca tcaccgcggg cacctcctgc 840

gtgatccacc acggcgtctt ccgcgacgag gagggcctcg cggagtttct cacccgggac 900

ctggccgagc tgcccggggt gacctccttc gacgtctgcg tcgtactcga cgcgctgcgc 960

cgccactggc tcgaccgcga ggacggccgc ctggccgcgc acgacaagca ggaagacgcg 1020

cccgacgagc ggacagccgc gcacgacgag ccggcgaacg gaccggggca cgaccagccg 1080

cggcacggac cgcagaacgg agccgacacc gcatga 1116

<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> 林可链霉菌（Streptomyces lincolnensis）

<400> 2

Met Asp Asp Met Thr Ala Leu Asp Asp Asp Asp Leu Asp Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Leu Gln His Ala Pro Arg Ala Pro Leu Ser Leu Leu Ala Glu Val

20 25 30

Leu Gly Val Ser Ala Ser Thr Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Leu Glu

35 40 45

Ser Asp Arg Leu Leu Arg Val Ile Gly Gln Leu Asp Trp Ser Val Ser

50 55 60

Gly Glu Gly Asn Pro Trp His Val Trp Val Thr Ala Glu Pro Gly Arg

65 70 75 80

Ala Pro Glu Val Ala Arg Arg Leu Ala Asp Leu Pro Glu Thr Ser His

85 90 95

Ala Ala Val Thr Ala Gly His Ser Asp Val Tyr Cys Ala Val Gln Pro

100 105 110

Ala Arg Arg Asp Arg Thr Thr Asp Leu Leu Ser Arg Thr Ile Pro Ala

115 120 125

Thr Pro Gly Val Arg Ser Ala Arg Ser Glu Leu Ile Leu Ser Ala Thr

130 135 140

Thr Lys Ser Asp Ser Trp Arg Leu Pro Arg Leu Thr Glu Asp Gln Val

145 150 155 160

Arg Arg Leu Thr Glu His Ala Ala Pro Asp Arg Ala Val Asp Pro Pro

165 170 175

Pro His His Thr Ala Leu Thr Asp Asp Glu Leu Arg Thr Leu Arg Leu

180 185 190

Leu Ala Thr Asp Ala Arg Ser Ser Ala Ala Gln Val Ala Arg Glu Leu

195 200 205

Gly Ile Gly Gln Ser Thr Ala Tyr Arg Thr Thr Gln Ser Leu Leu Arg

210 215 220

Arg Gly Leu Val Arg Pro Arg Val Glu Val Glu Pro Gly Leu Leu Gly

225 230 235 240

Tyr Ala Leu Glu Val Ala Ile Thr Leu Thr Val Ala Pro Ser Ala Thr

245 250 255

Ala Gly Leu Ala Arg Ser Leu Ala Arg His Pro Ser Ala Arg Tyr Val

260 265 270

Val Ile Thr Ala Gly Thr Ser Cys Val Ile His His Gly Val Phe Arg

275 280 285

Asp Glu Glu Gly Leu Ala Glu Phe Leu Thr Arg Asp Leu Ala Glu Leu

290 295 300

Pro Gly Val Thr Ser Phe Asp Val Cys Val Val Leu Asp Ala Leu Arg

305 310 315 320

Arg His Trp Leu Asp Arg Glu Asp Gly Arg Leu Ala Ala His Asp Lys

325 330 335

Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Arg Thr Ala Ala His Asp Glu Pro Ala

340 345 350

Asn Gly Pro Gly His Asp Gln Pro Arg His Gly Pro Gln Asn Gly Ala

355 360 365

Asp Thr Ala

370

<210> 3

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaagaattcc ttctctctag acgggtgcca gggcgtgccc ttgggctccc cgggcgcgta 60

actagtggat ctcgggtgcc agggcgtgcc cttgggctcc ccgggcgcgt aactagtgga 120

tctcgggtgc cagggcgtgc ccttgggctc cccgggcgcg taactagtgg atctcgggtg 180

ccagggcgtg cccttgggct ccccgggcgc gtaactagtg gatccctgga gaagcttaaa 240

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaatctagag tcgagctggc cgatcacc 28

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaaagcttg cgggccaggg actggat 27

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaagaattcg aaggagctgc ccttcttgt 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaatctagac tggccgagct gcccggggt 29

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgagcctgct ggcggaggtg ct 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgcagacgt cgaaggaggt ca 22

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaacatatga tggacgacat gacggctct 29

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaatctagat catgcggtgt cggctccgtt 30

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaatacgaa tggcgaaaag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctggcggatg caggaagatc 20

Claims

1.一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其特征在于，通过基因工程途径使林可链霉菌中Lrp家族转录调控基因SLCG_5407缺失，继而获得目标所需的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌；其中，所述SLCG_5407基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其特征在于，所述SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建，以林可链霉菌LCGL为出发菌株。

3.根据权利要求1所述的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其特征在于，所述SLCG_5407基因的产物用于负向调控林可霉素生物合成。

4.根据权利要求1～3任一所述的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

所述5407-p1、5407-p2、5407-p3和5407-p4引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；

5.一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的应用，其特征在于，将通过权利要求1～4任一所述构建方法得到的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌用于林可霉素的发酵生产。