CN114150006B

CN114150006B - 一种可提高米尔贝霉素产量的基因簇、重组菌及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114150006B
Application number: CN202111434391.4A
Authority: CN
Inventors: 张艳艳; 向文胜; 叶岚; 李珊珊
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: CN114150006A

Abstract

一种可提高米尔贝霉素产量的基因簇、重组菌及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提高冰城链霉菌中米尔贝霉素的产量，本发明提供了一种可提高米尔贝霉素产量的基因簇，并根据所述基因簇将冰城链霉菌基因组中的基因sbrR、sbrK、sbrH2和sbrH1失活获得重组菌，所述重组菌中米尔贝霉素A3/A4的总产量及外排量均具有显著提高，可应用于米尔贝霉素的生产。

Description

一种可提高米尔贝霉素产量的基因簇、重组菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可提高米尔贝霉素产量的基因簇、重组菌及其制备方法与应用。

背景技术

米尔贝霉素是一类应用于农业和畜牧业的环境友好型大环内酯类抗生素，尽管相对于阿维菌素，米尔贝霉素具有活性高，毒性低的优势，但其较低的产量和昂贵的生产成本很大程度上限制了其广泛应用。

冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是本实验室获得的具有独立知识产权的米尔贝霉素工业生产菌。在链霉菌中，抗生素合成是由分级调控因子严密调控的，包括簇内调控因子(CSRs)和多效/全局性调控因子。其中，双组份系统在抗生素生物合成中发挥着重要作用。到目前为止，双组份系统对抗生素合成的影响已经在模式菌株天蓝色链霉菌中被广泛研究，但对于冰城链霉菌中双组份系统的功能研究仍是空白。

在已测序的细菌中，有30～40％的蛋白质未被功能表征，被称为“假定蛋白”(HPs)，而天蓝色链霉菌和冰城链霉菌的全基因组分析发现，分别有17和25对典型双组份旁侧具有一个或多个假定蛋白。因此，通过解析这种具有一定普遍性的多组分系统的调节机制，从而挖掘冰城链霉菌中影响米尔贝霉素合成的调控基因，进而挖掘更多米尔贝霉素合成相关靶点，对于构建米尔贝霉素高产菌具有重要意义。

发明内容

为了提高冰城链霉菌中米尔贝霉素的产量，本发明提供了一种可提高米尔贝霉素产量的基因簇sbrH1-R(sbi_3478/3479/3480/3481)，所述基因簇sbrH1-R编码一个典型双组份系统以及两个假定蛋白；所述典型双组份系统由基因sbrR(sbi_03478)和sbrK(sbi_03479)编码，所述两个假定蛋白由基因sbrH1(sbi_03481)和sbrH2(sbi_03480)编码；所述基因sbrR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因sbrK的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，基因sbrH2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，基因sbrH1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了一种可提高米尔贝霉素产量的重组菌，该重组菌相对于产生该重组菌的出发菌株，所述重组菌基因组中基因sbrR、sbrK、sbrH2和sbrH1失活；所述出发菌株为冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)BC-101-4；

所述基因sbrR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述基因sbrK的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述基因sbrH2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述基因sbrH1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述基因的失活是指基因核苷酸序列中的一个或多个碱基点突变、缺失、插入或重排。

“失活”包括部分失活和完全失活，是指基因功能部分或全部丧失，不能产生表达其编码的蛋白质、或蛋白质表达水平降低或消除、或表达的蛋白质的相关生物学活性降低或消失，例如基因不能被转录或者转录的RNA不能被翻译为具有相应活性的蛋白质、或者产生的蛋白质的量或其活性与未进行所述失活操作的基因翻译的蛋白质的量或活性相比是降低或者消失的。

本领域技术人员应理解，已知的任何适于链霉菌中的基因失活方法均可以用于进行本发明的基因失活，例如包括但不限于基因替换、基因敲除、插入失活、移码突变、定点诱变、基因部分缺失、基因沉默、RNAi、反义抑制等。对于通过上述方法失活基因可以参见本领域已知的教科书、技术手册和参考文献(例如Kieser T,Bibb M.PracticalStreptomycesGenetics[M].Norwich:The John Innes Foundation,2000)。

本发明还提供了一种上述重组菌的制备方法，包括如下步骤：

1)目的基因敲除质粒的构建：以冰城链霉菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得目的基因的同源重组的左臂片段及右臂片段，将左臂片段与右臂片段连入pKC1139载体骨架中，获得目的基因敲除质粒；

2)将目的基因敲除质粒导入大肠杆菌，通过属间接合转移转入冰城链霉菌，获得目的基因敲除突变株，即为重组菌。

进一步地限定，所述目的基因为基因sbrR、sbrK、sbrH2和sbrH1；

所述基因sbrR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述基因sbrK的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述基因sbrH2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述基因sbrH1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地限定，目的基因的同源重组的左臂片段PCR所用的上、下游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的sbrH1RD-LF和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的sbrH1RD-LR；目的基因的同源重组的右臂片段PCR所用的上、下游引物分别为核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示的sbrH1RD-RF和核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的sbrH1RD-RR。

进一步地限定，步骤1)所述的同源重组的左、右臂片段与EcoRI和HindIII双酶切处理的载体pKC1139，通过ClonExpress MultiS试剂盒组装获得目的基因敲除质粒。

进一步地限定，步骤2)所述大肠杆菌为E.coli ET12567/pUZ8002。

本发明还提供了上述重组菌在生产米尔贝霉素中的应用。

本发明还提供了上述重组菌在提高米尔贝霉素A3/A4产量中的应用，所述应用是在适于米尔贝霉素产生的条件下培养本发明所述的重组菌，即将重组链霉菌依次经种子培养基培养、发酵培养基发酵培养后合成米尔贝霉素。

本发明的有益效果：

本发明揭示了冰城链霉菌中的一个基因簇sbrH1-R，所述基因簇为一个四组分调控系统(包括一个典型双组份系统和两个假定蛋白)，该基因簇能够正调控冰城链霉菌生长发育、负调控米尔贝霉素合成及外排。此外本发明依据该基因簇构建了重组菌ΔsbrH1-R，利用重组菌ΔsbrH1-R发酵生产米尔贝霉素时，相较出发菌株BC-101-4，ΔsbrH1-R的最终细胞生物量显著降低，仅为出发菌株BC-101-4的45％；但胞外米尔贝霉素A3/A4从13.3mg/L提高至443.3mg/L，提高了33.3倍；米尔贝霉素A3/A4总产量从1515.3mg/L提高至3136.7mg/L，提高了1.1倍。

附图说明

图1为载体构建简图；

图2为重组菌株PCR验证胶图；其中，样品1和样品3是以BC-101-4的基因组为模板，分别以ver1-F/R和ver2-F/R为引物，PCR扩增；样品2和样品4是以ΔsbrH1-R的基因组为模板，分别以ver1-F/R和ver2-F/R为引物，PCR扩增；M为DNAmarker；

图3为基因簇sbrH1-R对菌株米尔贝霉素A3/A4总产量及生物量的影响图：其中图3中的a表示HPLC检测与出发菌株相比重组菌株发酵米尔贝霉素A3/A4总产量的变化图；图3中的b表示与出发菌株相比重组菌株生物量的变化图；

图4为HPLC检测重组菌株发酵米尔贝霉素A3/A4外排产量变化图。

定义及缩写：

在本发明中，产生所述重组链霉菌的起始链霉菌是指对其进行本发明所示遗传操作例如基因敲除的链霉菌。也可以是具有其它遗传修饰但是不具有本发明所述遗传修饰的链霉菌如回补株。本文所用“重组”是指由于有意人为干预所获得的具有所需修饰的菌株，例如与相应天然(非重组)菌株相比，重组菌株不表达或者恢复表达天然基因活性。

在本发明中，术语“敲除”是指与野生型菌株相比，重组菌株经本发明所示遗传操作删除掉部分或全部目标基因编码区序列，使重组菌株不能产生具有相应活性的蛋白质、或者产生的蛋白质的量或其活性与未进行所述失活操作的基因翻译的蛋白质的量或活性相比是降低的或者被消除。敲除可以通过例如靶向载体、穿梭载体同源重组或随机插入基因捕获载体等方法使目标基因功能完全或部分丧失。

在本发明中，“回补”的定义是以敲除目标基因的重组菌株为出发菌株，通过整合型质粒将目标基因的编码区序列全部克隆到敲除重组菌株中，从而恢复失活操作的基因的表达，使重组菌株具有产生相应蛋白质的能力。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明所用试剂及设备等均可通过商业化途径购买获得，涉及的PCR扩增，酶切连接、转化等分子生物学实验操作如无特殊说明，均为本领域常规实验操作或依照相应试剂的产品说明书进行。

本发明中所用的菌体生长及发酵所需固体培养基，种子液，发酵液配方以及次级代谢产物对应的具体检测方法均记载在Zhang et al.Microb Cell Fact(2016)15:152DOI 10.1186/s12934-016-0552-1.

本发明所使用的出发菌株：

冰城链霉菌野生型BC-101-4(Streptomyces bingchenggensis)为本实验室具有独立知识产权的米尔贝霉素产生菌，该菌株记载在Wang et al.World J MicrobiolBiotechnol(2009)25:1051–1056 DOI 10.1007/s11274-009-9986-5，上述菌株公众可通过中国农业科学院植物保护研究所获得。

以下实施例中涉及的质粒如表1所示；涉及的菌株如表2所示；涉及的引物如表3所示。

表1实施例中涉及的质粒

表2实施例中涉及的菌株

表3实施例中涉及的序列

实施例1：重组菌ΔsbrH1-R的构建

重组菌ΔsbrH1-R是以冰城链霉菌BC-101-4为出发菌株，敲除基因sbrR、sbrK、sbrH2和sbrH1后获得的，其具体构建方法如下：

(1)重组载体的构建

采用聚合酶链反应(PCR)，Q5高保真酶体系，以冰城链霉菌BC-101-4基因组为模板，分别以sbrH1RD-LF/R和sbrH1RD-RF/R为引物，扩增出基因sbrH1-R上游和下游的片段。将PCR产物与EcoRI和HindIII双酶切处理的载体pKC1139，通过ClonExpress MultiS试剂盒组装，通过转化导入JM109，经涂布，挑取克隆至含有安普霉素(终浓度100μg/mL)的小试管培养，并用质粒提取试剂盒提取质粒，电泳检测后进行酶切验证和测序验证，得到重组质粒pKC1139::sbrH1-RD(如图1)。

将重组质粒pKC1139::sbrH1-RD转入ET12567/pUZ8002中，再通过接合转移方法导入冰城链霉菌BC-101-4中。然后将接合子挑到含安普霉素(终浓度8μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度25μg/mL)的SKYM培养基上，28℃培养9天后，将菌株传代至新的SKYM培养基上，37℃培养，完成单交换，培养7d后在不含抗生素的SKYM培养基上培养3代后挑取安普霉素敏感的菌株即sbrH1-R突变体(ΔsbrH1-R)。将挑到的ΔsbrH1-R接种于种子培养基，28℃，250rpm，培养两天后，收集菌体，提取基因组作为模板，分别以ver1-F/R和ver2-F/R为引物，进行PCR验证和DNA测序验证(如图2)。

对比例1：sbrH1-R基因回补菌株的构建

为实现sbrH1-R的回补，采用Q5高保真酶体系，以菌株BC-101-4基因组为模板，以CsbrH1-R-F/R为引物进行PCR，扩增出包含sbrH1-R编码区及其上游启动子区三个片段。然后通过ClonExpress MultiS试剂盒组装，将PCR产物连接到EcoRI和XbaI双酶切处理的整合型载体pSET152上，通过转化导入JM109，经涂布，挑取克隆至含有安普霉素(终浓度100μg/mL)的小试管培养，并用质粒提取试剂盒提取质粒，电泳检测后进行酶切验证和测序验证，获得重组质粒pSET152::sbrH1-R。将重组质粒转入ET12567/pUZ8002中，再通过接合转移方法将重组质粒导入ΔsbrH1-R，得到重组菌株CsbrH1-R。回补菌株的构建，进一步验证了基因簇sbrH1-R的功能。

实施例2：重组菌ΔsbrH1-R在生产米尔贝霉素中的应用

利用重组菌ΔsbrH1-R生产米尔贝霉素的方法为：将重组菌ΔsbrH1-R在SKYM固体培养基上28℃恒温培养9天，刮取约1平方厘米的孢子，接种在冰城链霉菌种子培养基中，28℃，250rpm，培养46小时。然后以6％的接种量，接种于冰城链霉菌发酵培养基，28℃，250rpm，培养9天。

所述冰城链霉菌及其重组菌生长及发酵所需固体培养基，种子培养基，发酵培养基配方均记载在He et al.Frontiers in Microbiology(2018)9:1064.DOI:10.3389/fmicb.2018.01064.

HPLC检测验证重组菌ΔsbrH1-R中米尔贝霉素A3/A4总产量变化

将重组菌ΔsbrH1-R、对比例中制备的CsbrH1-R以及原始菌株BC-101-4分别接种于SKYM固体培养基上，28℃恒温培养9天，刮取约1平方厘米的孢子，接种在冰城链霉菌种子培养基中，28℃，250rpm，培养46小时。然后以6％的接种量，接种于冰城链霉菌发酵培养基，28℃，250rpm，培养9天，分别获得菌株BC-101-4、ΔsbrH1-R和CsbrH1-R的发酵液。

米尔贝霉素总产素检测方法为：取0.5mL发酵液，浸泡于1.5mL乙醇中，旋转过夜浸提。12000rpm离心10min，取上清，经0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC检测。液相条件为：0-15min内solventA为甲醇从0-100％，solvent B为乙腈:甲醇:水＝350:100:50从100％-0％，柱子为Aligen C18(250mm,4.6μm)，检测波长为242nm。

HPLC检测结果如图3中的a所示，ΔsbrH1-R的米尔贝霉素A3/A4产量比出发菌株BC-101-4提高约1.1倍(1515.3～3136.7mg/L)。回补菌株CsbrH1R米尔贝霉素的产量基本恢复到BC-101-4水平。表明基因簇sbrH1-R负调控米贝霉素的合成。

重组菌ΔsbrH1-R生物量变化测定

生物量测定方法为：提取2mL发酵液，25℃，12000rpm离心，弃上清，去离子水洗涤沉淀，25℃，12000rpm离心后去上清，重复洗涤3次，60℃干燥至恒重后进行称量。

生物量测定结果如图3中的b所示，ΔsbrH1-R的最终细胞生物量显著降低，仅为出发菌株BC-101-4的45％，回补菌株CsbrH1R的生物量基本恢复到BC-101-4水平。表明基因簇sbrH1-R正调控冰城链霉菌的生长发育。

HPLC检测重组菌ΔsbrH1-R中米尔贝霉素A3/A4外排产量变化

米尔贝霉素的胞外产素检测方法为：取发酵液2mL，12000rpm，离心10min，取上清500μL，加入1.5mL的无水乙醇，旋转过夜浸提。12000rpm,离心10min,取上清，经0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC检测，方法与总产素检测方法一致。

HPLC检测结果如图4所示，结果表明，ΔsbrH1-R中胞外米尔贝霉素A3/A4的产量达到443.3mg/L，而出发菌株BC-101-4中只有13.3mg/L。而回补菌株CsbrH1-R的胞外米尔贝霉素A3/A4的产量完全恢复到出发菌株BC-101-4的水平，表明基因簇sbrH1-R对于米尔贝霉素的外排具有重要的负调控作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种可提高米尔贝霉素产量的基因簇、重组菌及其制备方法与应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

gtgacggcgg cggcgggagc accgcagtgg cgcgtactgc tcgtggacga ccatccgctc 60

ttccgcgagg gactggcggc cgcggtcaac ctggacgacg cgttcaccgt ggtcggccag 120

gccgcgtccg ccgaggaggc ggtcgccgag gccgaccgca ccgagcccga cctggtggtc 180

atggacctcg ggctgcccgg cagatccggt acggaggcca cccggcggat cctgtgcgcc 240

cgtcccgagg cccgtgtggt cgtcatgacc atgtccgagg acgacgacag cctgctggcg 300

gccatgcgcg ccggcgcccg cggctacctc ctcaaaggcg cgggccggga cgagatcctg 360

cgcgccctgc acaccgtggc acgcggcggc gcggtcttca gcccccgcat ggccgagcgt 420

cttggcaccc tgctcggctc cttcggcacc gcatcggcca aggaggcgtt ccccaccctc 480

accgcccgtg agcgcgaggt cctggaactg ctggcgggcg ggctcggcta tcgccagatc 540

gcccagcggc tggtggtcac ggacaagacc gtgcgtaacc acgtgggctc cattttcgcc 600

aagctgcagg tccgcgatcg cgcccaggca attgtccggg cccgtgaggc cgggctggga 660

ggtgaatga 669

<210> 2

<211> 2142

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

gtgcaggccg ccggcggagt ctccgccctg ttcgtggtgg tcttcgccgg gtggctggcc 60

ggactgctgc gggtgaacga ccaatggctg gccctgtcct atccgcagcc gcgcggcacc 120

gccgtgctga cccgcgtcgc cgtgggcatt ccggtcctcg gcgtcggggt gctcctgctg 180

gccgagcgct ccgcccgccg ctacggcagc gtcctgctgg tcgccggggc gctgtggctg 240

ctgccctcgg cagccgccga cctgctggga ctggccgacc tgggctcggc gggcgccgtg 300

gtccagctgc tgatctcggc cgccgggatc gcctgccgcc cgctgaccgt cctgctgctg 360

ccgctgtggc tgttcccgcg cggttcgcag cggcggtggc agtggtgggc gatgagcgtc 420

ggcgcctccg cgtactggct gggctacgcc gccctctggc tggtcagcga gccgatggtc 480

ggctcggcga ccaacccctt cttcgccacc gaatgcggcc agtgggcctt cggtcacctc 540

gagcactacg cgaaggcgga ggagtgggtg ctgcgcgccg tggccgccgt ggtgacgggc 600

tcgctgtgct gccgcgccgc tgtcgcccgc agtgccgagc ggcgcaactg ggctctgctc 660

gccgccgcct acccggcctg cgtcttcctg ctgctgtccg aatgggccga gggcatgccc 720

accatcgtgg cgcgcaccgt cggcagcgcc gtctgggcgg ccgcgatctg cctgggcgtc 780

gcccgcaccg gcatatggcg cctggaccgc gtcaccagcc accgtctcgc ccgcgccttc 840

gtcctcacct ccctcgccgc cgtcgtcgtc tgcgccgtcg tcgccgtcca ggccgggctg 900

ccctccctgc gcggcggggc gatcagcacc gccgtcggct gctccctgct gctcggctgg 960

gcgctgcggc cgaccgcccg ctggctgacc ctgcgcgtcg agcgtgcctt ctacgggccg 1020

cgggcccgcc cccacgaggc ggccagcgcc ctggccgtac gcctccagca ggcgccccac 1080

cccggcgagg tgccccagca gatctgccgc agcgccgtcg aggaccttgg cgtctcgggc 1140

gccgccgtca gcgtcgacac ccggtcagga ccccggcggc tggccgcggc cggggcgccg 1200

ctcaccggcc cggtccaggc attcgtgctg cgccaccacg gccgtacggt cggccgcctc 1260

gaagtcgccc gggacggctc cggcaccccc gccgaacggg acagcggact gctctccctg 1320

ctcgccgacc aggcggcccc ggcgctcgcc gccctgagcc tggccgagga ggcccaggcc 1380

gcccgggagc ggctggtgct cgcccgtgag caggagcgcc gccggctgcg gcgcgagatc 1440

cacgacggcc tcggccccca gctcgccgcc gtacggctgc gcctggacat cgcgcagacc 1500

acctgcccgc ccgggcatcc ggcccgccat cagctgcgcg aggccgccga aaccctcgcc 1560

gaggccctgg tcgaggtgcg gcggatcacc tcgggtcttg cccccgccgc cctggccgag 1620

cgcggcttgg ccaaggcggt acgggacctg ggacggcggc tgggcggcgc cgggccgcgg 1680

gtgaccgtgg ccacccaccc caccgcactg ccgccgctgt cgcccggtgt ggagacggcc 1740

gcgtaccgga tctccgccga gtcgctgacc aacgcggtgc ggcacgcacg ggcccggcag 1800

gtccggatcg agctcaccgc gggcccggac acgctcgagg tcaaggtcac cgacgacggg 1860

agcgggctgc ggcggggcgc cgtgcccggc gtcgggctgg cctccgtggc ggagcgcgcc 1920

gaggagatcg gcggctcctg ctcggtgacg ggatccgcga cgggcacggt ggtgcacgcg 1980

atcctgccgc tcgccgggcc gggggatgcc gagccggccg aggacaacgc cgtccatgag 2040

gcggccgtat cgctcgcacc ggaagaacac cgccgcgaag gaggccggga acacggtcgg 2100

cagcgcggcg gagagcgcgg ggaagagggg ccgggccggt ga 2142

<210> 3

<211> 339

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

atgaccccat cccggacccg ccggacccgc gtcctgaccg cgctcgctct gctcaccggc 60

gccgtcgtgg gggccgcccc ggcggcgtcc gccgccgcgg ccccgggagc ggcatggcgg 120

caggccgggc acttcgacac caccagcgcc tgtcgcaagg cgggccggaa cggggtggaa 180

gcccacaagt ggagcgagta caaatgccgg ccgggccaca gcgacaacta catcacgctg 240

tgggtcaagg gccggggcag gagccatacc gccggccagg ccccggctcc gcctccggct 300

tcagcccctg ccccgacccg gggctctggg atgggatga 339

<210> 4

<211> 399

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

gtgacgatca cgacggggga accggccatc accggacccg acatcgacga cctggtcatc 60

cgggtgcggc acgccgccgg cgacaccacg cagctcgaag cggccaagac agcgctcttc 120

ggcacggccg gcgccgcccc ggccgacgcg cagctcatcc ggcagcggct gctgaccgtc 180

gccctgcacc acggcggcga cctgctggcc aaactgctca tccggctcgg gccgcgcgag 240

accgccatgg tccgccgcta cgcccaccgg ctcggctact tcctggaaac cctcgagatc 300

tggtcggcca agccgatcat gctcaccctg atgcggttcg gcgtccccta tatcgaggcc 360

gaggccatcg ccgtcgccat cctgctgctg gtgtggtga 399

<210> 5

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 6

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<210> 7

<211> 42

<212> DNA

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<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 8

<400> 8

cagctatgac atgattacga attccaccac tcgatactgc cgcacc 46

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 13

<400> 13

ccaagcttgg gctgcaggtc gactcgtaga gcgggacgat cagcgcgga 49

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 14

<400> 14

gaaacagcta tgacatgatt acgggcacct cgatcgcggg cg 42

Claims

1.一种可提高米尔贝霉素产量的重组菌，其特征在于，相对于产生该重组菌的出发菌株，所述重组菌基因组中基因sbrR、sbrK、sbrH2和sbrH1敲除；所述出发菌株为冰城链霉菌（Streptomyces bingchenggensis）BC-101-4；所述基因sbrR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述基因sbrK的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述基因sbrH2的核苷酸序列如SEQID No.3所示；所述基因sbrH1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述可提高米尔贝霉素产量的重组菌的制备方法，包括如下步骤：

1)构建目的基因敲除质粒：以冰城链霉菌BC-101-4基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得目的基因的同源重组的左臂片段及右臂片段，将左臂片段与右臂片段连入pKC1139载体骨架中，获得目的基因敲除质粒；

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述目的基因的同源重组的左臂片段PCR所用的上、下游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的sbrH1RD-LF和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的sbrH1RD-LR；目的基因的同源重组的右臂片段PCR所用的上、下游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的sbrH1RD-RF和核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的sbrH1RD-RR。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，步骤1)所述的同源重组的左、右臂片段与EcoRI和HindIII双酶切处理的载体pKC1139，通过ClonExpress MultiS试剂盒组装获得目的基因敲除质粒。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，步骤2)所述大肠杆菌为E.coliET12567/pUZ8002。

5.权利要求1所述的重组菌在生产米尔贝霉素中的应用。